CN115232759B - 一株葡萄球菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一株葡萄球菌及其应用，本发明属于微生物技术领域。本发明获得的葡萄球菌为表皮葡萄球菌，经香气成分分析，其具有产吡嗪类、酯类、醇类、酸类等多种产香物质的能力，且该菌株抗逆性极强，能够耐受25％浓度及以上的盐溶液，同时具有广谱pH耐受性，且安全性高，因此特别适合用于酱油等发酵食品的生产，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一株葡萄球菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株葡萄球菌及其应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

酱油是中国传统的发酵调味品，用大豆或脱脂大豆或黑豆、小麦或麸皮，加入水、食盐等利用微生物的发酵作用，从而水解成多种氨基酸、肽、有机酸以及糖类等，并且以这些物质作为基础，经过酿造而成的液体调味品，其色泽呈红褐色，有独特酱香，滋味鲜美，有助于促进食欲。酱油香气成分非常复杂丰富，有研究指出，其包括酸类、醇类、醛类、酯类、酮类、酚类、吡嗪类和呋喃酮类等多种产香物质，由此生发出酯香、花香、焦糖香、烤土豆香、酱香等多种香气成分。

随着生活水平的提高，消费者对酱油的色、香、味等提出更高的要求，但是随着目前酱油发酵工艺封闭程度的提高，酱油发酵过程中自然接种的产风味微生物相对缺乏，且发明人发现，目前很多研究人员主要关注于酱油中主要耐盐产香酵母菌，比如鲁氏接合酵母以及假丝酵母等等，而对于其他具有产香性能的菌种研究较少，因此有必要对其他种类的产香微生物进行筛选，并对其产香特性进行研究，从而进一步改善酱油香味、提高酱油品质。

发明内容

基于上述现有技术的不足，本发明提供一株葡萄球菌及其应用，经香气成分分析，其具有产吡嗪类、酯类、醇类、酸类等多种产香物质的能力，且该菌株抗逆性极强，能够耐受25％浓度及以上的盐溶液，同时具有广谱pH 耐受性，因此特别适合用于酱油等发酵食品的生产。

为实现上述技术目的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供一株葡萄球菌(Staphylococcus sp.)QXF-G，该菌株已于2021年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，(地址：中国武汉武汉大学)，其生物保藏号为CCTCC NO：M 20211298。

所述葡萄球菌QXF-G的特征特性如下：菌落为白色，形成圆形凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，形成不透明的菌落；菌体成单个、成对和成堆 (葡萄状)，革兰氏染色为阳性。

经形态学、生理生化以及16S rDNA测序发现，所述葡萄球菌QXF-G 为表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。

本发明筛选得到的葡萄球菌QXF-G其对人体无害，其不产生细菌毒素，无耐热核酸酶活性，溶血试验验证也未发现其产生溶血现象，同时其对盐浓度具有极高适应性和耐受性，在25％以上盐浓度仍能够正常生长，且具有广谱pH适应性和耐受性，并具有产吡嗪类、酯类、醇类、酸类等多种产香物质的能力，因此在酱油酿造等领域极具应用价值。

本发明的第二个方面，提供上述葡萄球菌QXF-G的生产方法，所述生产方法包括：将所述葡萄球菌QXF-G接种至发酵培养基中进行发酵培养即得。

本发明的第三个方面，提供一种菌剂，所述菌剂含有上述葡萄球菌 QXF-G或其发酵物。

本发明的第四个方面，上述葡萄球菌QXF-G或其发酵物在如下a)-d) 中任意一种或多种中的应用也是本发明保护的范围：

a)在增香和/或调香中的应用；

b)在制备增香/调香剂中的应用；

c)在酱油酿造中的应用；

d)在制备酱油酿造生产菌剂中的应用。

其中，所述酱油包括但不限于高盐稀态发酵酱油和低盐固态发酵酱油，优选为高盐稀态发酵酱油，高盐稀态发酵酱油以大豆或脱脂大豆、小麦或小麦粉为原料，经蒸煮、曲霉菌制曲后与盐水混合成稀醛，再经发酵制成，其香气成分多，营养物质丰富，然而由于其制酱醪的盐水浓度一般较高，在18％以上，酱醪含盐量也达到15％以上，因此对菌株耐盐性要求较高，本申请的葡萄球菌QXF-G具有极佳的耐盐性，从而能够在高盐稀态发酵酱油酿造过程中使用，从而提升其应用价值。

本发明的第五个方面，提供一种酱油酿造生产的方法，所述酿造生产方法包括：在生产过程中施加上述葡萄球菌QXF-G、上述葡萄球菌QXF-G的发酵物和/或上述微生物菌剂。

其中，所述酱油包括但不限于高盐稀态发酵酱油和低盐固态发酵酱油，优选为高盐稀态发酵酱油。

上述一个或多个技术方案的有益技术效果：

上述技术方案首次报道一株表皮葡萄球菌QXF-G，其具有产吡嗪类、酯类、醇类、酸类等多种香气成分的能力，同时该菌株抗逆性强，具有极佳的耐盐性和pH广谱适应性，同时安全性高，因此特别适合作为酱油等传统发酵食品的生产菌剂使用，具有良好的实际应用推广之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明葡萄球菌镜检图；

图2为本发明葡萄球菌PCR电泳图；其中，M为Maker，1为葡萄球菌PCR产物。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

如前所述，随着目前酱油发酵工艺封闭程度的提高，酱油发酵过程中自然接种的产风味微生物相对缺乏，且目前很多研究人员主要关注于酱油中主要耐盐产香酵母菌，比如鲁氏接合酵母以及假丝酵母等等，而对于其他具有产香性能的菌种研究较少，因此有必要对其他种类的产香微生物进行筛选，并对其产香特性进行研究，从而进一步改善酱油香味、提高酱油品质。

有鉴于此，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一株葡萄球菌，Staphylococcus sp.QXF-G，该菌株已于2021年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，(地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学)，其生物保藏号为CCTCC NO：M 20211298。

所述葡萄球菌QXF-G的特征特性如下：菌落为白色，形成圆形凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，形成不透明的菌落；菌体成单个、成对和成堆 (葡萄状)，革兰氏染色为阳性。

经形态学、生理生化以及16S rDNA测序发现(上海派森诺生物科技有限公司)，所述葡萄球菌QXF-G为表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。血平板实验结果表明表皮葡萄球菌不产生血浆凝固酶，进一步通过细菌基因完成图致病菌毒力因子(VFDB)分析和抗生素抗性(CARD) 分析该菌不产生α-溶血素等毒性物质，无抗生素抗性，故认为是非致病性葡萄球菌。本发明筛选得到的葡萄球菌QXF-G其对人体无害，其不产生细菌毒素，无耐热核酸酶活性，溶血试验验证也未发现其产生溶血现象，同时其对盐浓度具有极高适应性和耐受性，在25％以上盐浓度仍能够正常生长，且对pH亦具有广谱适应性和耐受性，在pH4～9中均能生长正常，并具有产吡嗪类、酯类、醇类、酸类等多种产香物质的能力，因此在酱油酿造等领域极具应用价值。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述葡萄球菌QXF-G的生产方法，所述生产方法包括：将所述葡萄球菌QXF-G接种至发酵培养基中进行发酵培养即得。

发酵培养条件具体为：在15～35℃(优选为30℃)培养12～30h(优选为20h)，转速：100-150rpm(优选为120rpm)。

其中，所述发酵培养基可采用常规细菌培养基，如LB培养基，进一步可选择使用MSA培养基等，在此不做具体限定。

术语“发酵物”用于指代发酵产品。相应的发酵物可以是从发酵培养葡萄球菌QXF-G的过程获得的液体，因此，也可称为发酵液(如采用上述LB 培养基或者MSA培养基进行发酵培养获得的发酵液)；液体可以含有细菌 (菌体)，但并不必然需要含有细菌。液体优选的含有由本发明的葡萄球菌 QXF-G产生的代谢产物。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种菌剂，所述菌剂含有上述葡萄球菌QXF-G或其发酵物。

需要说明的是，为进一步方便存储、运输，提高菌株存活率等，所述菌剂也可以是固体，进一步优选为冻干粉剂。即针对上述葡萄球菌QXF-G或其发酵物进行冷冻干燥获得，所述冷冻干燥技术(包括真空冷冻干燥技术) 可采用常规方法进行，在此不再进行赘述。

本发明的又一具体实施方式中，上述葡萄球菌QXF-G或其发酵物在如下a)-d)中任意一种或多种中的应用也是本发明保护的范围：

a)在增香和/或调香中的应用；

b)在制备增香/调香剂中的应用；

c)在酱油酿造中的应用；

d)在制备酱油酿造生产菌剂中的应用。

其中，所述酱油包括但不限于高盐稀态发酵酱油和低盐固态发酵酱油，优选为高盐稀态发酵酱油，高盐稀态发酵酱油以大豆或脱脂大豆、小麦或小麦粉为原料，经蒸煮、曲霉菌制曲后与盐水混合成稀醛，再经发酵制成，其香气成分多，营养物质丰富，然而由于其制酱醪的盐水浓度一般较高，在18％以上，酱醪含盐量也达到15％以上，因此对菌株耐盐性要求较高，本申请的葡萄球菌QXF-G具有极佳的耐盐性，从而能够在高盐稀态发酵酱油酿造过程中使用，从而提升其应用价值。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种酱油酿造生产的方法，所述酿造生产方法包括：在生产过程中施加上述葡萄球菌QXF-G、上述葡萄球菌 QXF-G的发酵物和/或上述微生物菌剂。

其中，所述酱油包括但不限于高盐稀态发酵酱油和低盐固态发酵酱油，优选为高盐稀态发酵酱油。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1葡萄球菌的分离、鉴定

以耐盐性(盐浓度5％)作为指标，筛选出一株具有耐盐特性的菌株，命名为菌株QXF-G。该菌株特征如下：菌落为白色，形成圆形凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，形成不透明的菌落；菌体成单个、成对和成堆(葡萄状)，革兰氏染色为阳性，结合生理生化特征，初步鉴定属于葡萄球菌。对菌株QXF-G的16S rDNA序列进行测序(上海派森诺生物科技有限公司)，将测序得到的序列(SEQ ID NO.1)在NCBI中比对，结合实际情况选择相似度较大的序列作为物种鉴定结果。

表1各样品NCBI比对结果

结合上述其他特征，综合判定该菌株QXF-G为表皮葡萄球菌 (Staphylococcusepidermidis)。

生物保藏说明如下：

菌株QXF-G，分类命名：葡萄球菌(Staphylococcus sp.)，该菌株已于 2021年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，(地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学)，其生物保藏号为CCTCC NO：M 20211298。

实施例2葡萄球菌的耐盐特性研究

进一步研究该葡萄球菌株的耐盐特性，取菌株QXF-G分别接种至含有 5％-30％的NaCl的MSA培养基中，30℃120rpm/min培养24h后观察各菌株在不同的盐浓度下的生长情况。结果如下表2所示。结果表明，菌株QXF-G 具有极佳的耐盐特性，在盐浓度达到27％时，依然可以生长。远超一般葡萄球菌的耐盐性，表明该菌株非常适于应用于酱油特别是高盐稀态发酵酱油的酿造生产。

表2葡萄球菌QXF-G在不同浓度NaCl下的生长情况

注：“+”生长，“-”不生长。

实施例3葡萄球菌pH广谱特性研究

由于酱油生产过程中，pH会随着发酵进程发生变化，因此菌株具有更宽泛的pH耐受性更加有利于其在酱油酿造中使用。因此为进一步研究该葡萄球菌株的pH适应性，取菌株QXF-G分别接种至pH为3-10的MSA培养基中，结果如下表3所示。结果表明，菌株QXF-G在pH为4-9范围内具生长良好，表明该菌株具有广谱pH耐受性。

表3葡萄球菌QXF-G在不同浓度NaCl下的生长情况

注：“+”生长，“-”不生长

实施例4葡萄球菌产香气成分鉴定

取菌株QXF-G接种至MSA培养基中，30℃120rpm/min培养24h，取上述发酵液以5000rpm离心5分钟，取上清液进行HPLC-MS分析(上海应用技术大学)。香气成分见表4。可见，该葡萄球菌能够产出吡嗪类、酯类、醇类、酸类等众多香气成分，因此可作为用于酱油酿造过程中生产菌株使用，从而实现改善酱油香味、提高酱油品质的效果。

表4葡萄球菌产香气成分

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东巧媳妇食品集团有限公司；山东省食品发酵工业研究设计院

<120> 一株葡萄球菌及其应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1465

<212> DNA

<213> 葡萄球菌（Staphylococcus sp.）QXF-G 16S rDNA

<400> 1

gggcagggcg gggagctata catgcagtcg agcgaacaga cgaggagctt gctcctctga 60

cgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg gataacctac ctataagact gggataactt 120

cgggaaaccg gagctaatac cggataatat attgaaccgc atggttcaat agtgaaagac 180

ggttttgctg tcacttatag atggatccgc gccgcattag ctagttggta aggtaacggc 240

ttaccaaggc aacgatgcgt agccgacctg agagggtgat cggccacact ggaactgaga 300

cacggtccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg gcgaaagcct 360

gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg tcttcggatc gtaaaactct gttattaggg 420

aagaacaaat gtgtaagtaa ctatgcacgt cttgaacggg tacctaatca gaaaagccac 480

ggctaaacta cgtgccagca gccgcgggta aatacgtagg tgggcaagcg ttatccggaa 540

ataatttggg cgtaaagcgc gcgtaggcgg tttttttaag tctgatgtga aagcccacgg 600

ctcaaccgtg gagggtcatt ggaaactgga aaacttgagt gcagaagagg aaagtggaat 660

tccatgtgta gcggtgaaat gcgcagagat atggaggaac accagtggcg aaggcgactt 720

tctggtctgt aactgacgct gatgtgcgaa agcgtgggga tcaaacagga ttagataccc 780

tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttagg gggtttccgc cccttagtgc 840

tgcagctaac gcattaagca ctccgcctgg ggagtacgac cgcaaggttg aaactcaaag 900

gaattgacgg ggacccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag 960

aaccttacca aatcttgaca tcctctgacc cctctagaga tagagttttc cccttcgggg 1020

gacagagtga caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag 1080

tcccgcaacg agcgcaaccc ttaagcttag ttgccatcat taagttgggc actctaagtt 1140

gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg 1200

atttgggcta cacacgtgct acaatggaca atacaaaggg cagcgaaacc gcgaggtcaa 1260

gcaaatccca taaagttgtt ctcagttcgg attgtagtct gcaactcgac tatatgaagc 1320

tggaatcgct agtaatcgta gatcagcatg ctacggtgaa tacgttcccg ggtcttgtac 1380

acaccgcccg tcacaccacg agagtttgta acacccgaag ccggtggagt aaccatttgg 1440

agctagccgt cgaagtgata aagta 1465

Claims (12)

1.一株葡萄球菌（Staphylococcus sp.）QXF-G，所述葡萄球菌QXF-G已于2021年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，其生物保藏号为CGMCC NO：M 20211298。

2.权利要求1所述葡萄球菌QXF-G的生产方法，其特征在于，所述生产方法包括：将所述葡萄球菌QXF-G接种至发酵培养基中进行发酵培养即得。

3.如权利要求2所述的生产方法，其特征在于，发酵培养条件为：在15~35℃培养12~30h，转速：100-150 rpm。

4.如权利要求3所述的生产方法，其特征在于，发酵培养条件为：在30℃培养20h，转速：120 rpm。

5.如权利要求4所述的生产方法，其特征在于，所述发酵培养基采用常规细菌培养基，所述常规细菌培养基选自LB 培养基或MSA 培养基。

6.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂含有权利要求1所述葡萄球菌QXF-G。

7.权利要求6所述葡萄球菌QXF-G在如下a）-d）中任意一种或多种中的应用：

a）在增香和/或调香中的应用；

b）在制备增香/调香剂中的应用；

c）在酱油酿造中的应用；

d）在制备酱油酿造生产菌剂中的应用。

8.如权利要求7所述应用，其特征在于，所述酱油包括高盐稀态发酵酱油和低盐固态发酵酱油。

9.如权利要求8所述应用，其特征在于，所述酱油为高盐稀态发酵酱油。

10.一种酱油酿造生产的方法，其特征在于，所述酿造生产方法包括：在生产过程中施加权利要求1所述葡萄球菌QXF-G和/或权利要求6所述菌剂。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述酱油包括高盐稀态发酵酱油和低盐固态发酵酱油。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述酱油为高盐稀态发酵酱油。