CN110305803B - 一株汉逊德巴利酵母及其在酱油酿造中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于酱油酿造技术领域，具体为一株汉逊德巴利酵母菌及其在酱油酿造中的应用。该汉逊德巴利酵母菌于2019年3月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019133，分类命名为：Debaryomyces hansenii RRJ‑JM‑2。该菌株可在酱油酿造高盐环境下生长繁殖，能够有效改变酱油风味，适用于酱油酿造。

Description

一株汉逊德巴利酵母及其在酱油酿造中的应用
技术领域
本发明属于酱油酿造技术领域，具体为一株汉逊德巴利酵母菌及其在酱油酿造中的应用。
背景技术
酱油是我国传统的酿造型调味品，历史悠久,从东汉开始，中国便开始了酱油生产，酱油是以蛋白质原料和淀粉质原料为主，经微生物发酵酿造而成的色香味协调、营养物质丰富的调味品。酱油酿造有一谚语：一曲、二醪、三熬油，是对酱油生产工艺的精炼概述，二醪是指制曲后的发酵过程，这个过程是酱油酿造的重要环节，此时，酵母、乳酸菌等作为主体微生物参与整个发酵过程，并且在其作用下，经过一系列复杂的生物化学反应，将黄豆、小麦等原料转化成酱油的成分。
目前已明确增香酵母对酱油等食品在酿造过程中风味物质的形成起到重要的作用，增香酵母是一类能够产生芳香气味物质的酵母，在酱油酿造中，酵母菌能够以米曲霉代谢产生的小分子糖类和氨基酸的为基础，产生醇、醛、酸、酚、酯等酱油主要的香气成分。不同酵母对风味的影响不同，如鲁氏酵母菌能大量生成甘油、阿拉伯糖醇、乙醇、异丁醇、异戊醇等醇类物质；结合酵母贯穿整个发酵过程，均能进行酒精发酵，给酱油增加特有的风味；球拟酵母菌主要存在发酵后期，可将葡萄糖分解成大量的甘油、乙醇和4—乙基愈创木酚等香气物质。此外，酵母菌体在后酵后期发生自溶，产生呈味核酸等物质。
高盐稀态发酵工艺是一种高品质酱油生产工艺，在发酵过程中，为了提高酱油的风味，要人为进行增香酵母添加，目前国内应用广泛并且有一定效果的为鲁氏酵母，但是，存在酵母在应用过程中是否适应酱油酿造过程中的高盐环境，以及不同菌株之间的差异导致菌株对酱油风味影响不同等问题，因此筛选出一株耐高盐并有效改变酱油风味的菌株是十分必要的。
发明内容
本发明鉴于现有工业化生产酱油中可应用的增香潜能酵母品种少，生产的酱油香味不足的问题，提供了一株汉逊德巴利酵母菌，以及该汉逊德巴利酵母菌在酱油酿造中的应用。该菌株可在酱油酿造高盐环境下生长繁殖，能够有效改善酱油风味，适用于酱油酿造。
为了实现以上发明目的，本发明的技术方案为：
一株汉逊德巴利酵母菌RRJ-JM-2，该汉逊德巴利酵母菌于2019年3月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019133，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；分类命名为：Debaryomyces hanseni RRJ-JM-2。
利用汉逊德巴利酵母菌进行酱油酿造的方法，包括以下步骤：以黄豆、面粉为原料，采用米曲霉沪酿3.042为制曲菌种进行制曲，采用高盐稀态发酵工艺发酵，在发酵的初期(优选发酵的第50天)或中期(优选发酵的第61-120天)接入汉逊德巴利酵母菌，使酱醩中酵母的含量达到5×105cfu/g，继续发酵4个月，过滤收集生油，静置澄清即得。酱油酿造技术为现有技术，高盐稀态发酵工艺也为现有技术。
作为优选，利用汉逊德巴利酵母菌进行酱油酿造的方法，具体包括以下步骤：以黄豆、面粉为原料，先将黄豆在37℃左右的温水中浸泡4h后，于115℃的条件下灭菌15min，待曲料冷却至40℃左右时，将黄豆按黄豆与面粉质量比为8:1的比例拌入面粉中，再以0.25％(以原料总质量计)的比例接入米曲霉沪酿3.042种曲，制曲厚度10cm，制曲温度28-30℃，制曲时间40h。在制曲结束后，按照成曲与盐水的质量比为1:2.2的比例加盐水(盐水的质量浓度为24.8％)，在发酵的前30d内，维持发酵温度15℃，期间每周搅拌2-3次，待发酵30d后将发酵温度升温至28℃继续发酵，期间每月搅拌2-4次，在发酵的第50天时，接入该汉逊德巴利酵母菌，使酱醩中的酵母含量达到5×105cfu/g左右，继续发酵4个月，过滤收集酱油，静置澄清即得。
该汉逊德巴利酵母菌也适用于在泡菜或腌菜类中的发酵增香。
该汉逊德巴利酵母菌也适用于在酒类酿造中的发酵增香。
本发明的积极效果体现在：
(一)本发明所述汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)菌株RRJ-JM-2(增香酵母菌)在16-18％NaCl存在情况下生长情况良好，在20％氯化钠存在情况下仍能存活。说明本发明的汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)菌株NaCl耐受性良好，适用于高盐稀态发酵的高盐环境，耐受范围为0％-20％。
(二)汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)菌株RRJ-JM-2运用于酱油酿造技术中，对风味物质苯乙醇、乙酸异戊酯、棕榈油酸乙酯、棕榈酸乙酯、油酸乙酯、3-苯丙酸乙酯和乙酸苯乙酯等有增强的效果，以上风味物质对酱油风味有重要作用，因此本菌株对于酱油风味的改变能够起到积极作用。
附图说明：
图1为0％NaCl的麦芽汁培养基上菌株平板图片；
图2 8％NaCl的麦芽汁培养基上菌株平板图片；
图3 16％NaCl的麦芽汁培养基上菌株平板图片；
图4菌株显微图片；
图5菌株系统进化发育树。
具体实施方式：
为了使本发明的发明目的、技术方案及其有益技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
本申请中所采用的汉逊德巴利酵母菌RRJ-JM-2，也称增香酵母菌，该汉逊德巴利酵母菌于2019年3月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019133，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；分类命名为：Debaryomyces hanseni RRJ-JM-2。
菌种培养：
配制麦芽汁液体种子培养基，接入汉逊德巴利酵母菌RRJ-JM-2，于30℃摇瓶发酵培养18h，制成种子培养基，再次配制麦芽汁液体发酵培养基，以2％接种量接入种子培养基，30℃摇瓶发酵培养18h，发酵液装入无菌离心瓶，4000r/min离心20分钟，收集菌体，以涂布法对菌体数量进行计数。
本申请文件中所使用的％，如无特殊说明，均表示其质量百分含量，即wt％。
实施例1：
利用汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)菌株RRJ-JM-2(增香酵母菌)酱油酿造的方法，其步骤为：以黄豆、面粉为原料，先将黄豆在37℃左右的温水中浸泡4h后，于115℃的条件下灭菌15min，待曲料冷却至40℃左右时，将黄豆按黄豆与面粉质量比为8:1的比例拌入面粉中，再以0.25％(以原料总质量计)的比例接入米曲霉沪酿3.042种曲，制曲厚度10cm，制曲温度28℃，制曲时间40h。在制曲结束后，按照成曲与盐水的质量比为1:2.2的比例加盐水(盐水的质量浓度为24.8％)，在发酵的前30d内，维持发酵温度15℃，期间每周搅拌2次，待发酵30d后将发酵温度升温至28℃继续发酵，期间每月搅拌3次，在发酵的第50天时，接入具体实施例方式中培养好的汉逊德巴利酵母菌，使酱醩中的酵母含量达到4×105cfu/g左右，继续发酵4个月，过滤收集酱油，静置澄清即得生油样品A。
实施例2：
利用汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)菌株RRJ-JM-2(增香酵母菌)酱油酿造的方法，其步骤为：以黄豆、面粉为原料，先将黄豆在37℃左右的温水中浸泡4h后，于115℃的条件下灭菌15min，待曲料冷却至40℃左右时，将黄豆按黄豆与面粉质量比为8:1的比例拌入面粉中，再以0.25％(以原料总质量计)的比例接入米曲霉沪酿3.042种曲，制曲厚度10cm，制曲温度28℃，制曲时间40h。在制曲结束后，按照成曲与盐水的质量比为1:2.2的比例加盐水(盐水的质量浓度为24.8％)，在发酵的前30d内，维持发酵温度15℃，期间每周搅拌2次，待发酵30d后将发酵温度升温至28℃继续发酵，期间每月搅拌3次，在发酵的第100天时，接入具体实施例方式中培养好的汉逊德巴利酵母菌，使酱醩中的酵母含量达到4×105cfu/g左右，继续发酵5个月，过滤收集酱油，静置澄清即得生油样品B。
对比例1
利用增香酵母菌酱油酿造的方法，其步骤为：以黄豆、面粉为原料，先将黄豆在37℃左右的温水中浸泡4h后，于115℃的条件下灭菌15min，待曲料冷却至40℃左右时，将黄豆按黄豆与面粉质量比为8:1的比例拌入面粉中，再以0.25％(以原料总质量计)的比例接入米曲霉沪酿3.042种曲，制曲厚度10cm，制曲温度28℃，制曲时间40h。在制曲结束后，按照成曲与盐水的质量比为1:2.2的比例加盐水(盐水的质量浓度为24.8％)，在发酵的前30d内，维持发酵温度15℃，期间每周搅拌2次，待发酵30d后将发酵温度升温至28℃继续发酵，期间每月搅拌3次，继续发酵5个月，过滤收集酱油，静置澄清即得生油阴性对照样品。
将实施例1、实施例2和对比例1中制备得到的生油样品A、生油样品B和生油阴性对照样品均采用顶空固相微萃取，利用GC-MS测定培养基中香气成分。萃取温度60℃，时间30min。色谱条件：运用SH-Rtx-WAS(30m×0.25mm×0.32um，强极性)色谱柱；载气为高纯He；流速为1.67mL/min；进样口温度为250℃；升温程序：初始温度45℃，保持3min，以3℃/min的速度升温至180℃，保持3min，以12℃/min的速度升温至220℃保持3min；质谱条件：离子源温度为200℃；接口温度为250℃；电子轰击离子源(EI)；检测范围：35-500m/z。对采集到的质谱图进行组分和相对含量分析。结果见下表。
表一应用增香酵母酱油主要挥发性风味物质相对含量变化
Figure GDA0002162724290000061
从上表可以看出，应用该酵母菌作为增香菌株进行酱油酿造，菌株能够生成以棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯、亚麻酸乙酯等长链脂肪酸酯为主的酯类，对酱油酯香改善明显。
汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hanseni)菌株RRJ-JM-2分子生物学鉴定：
利用EZneneTM Fungal Gdna Kit(GD2416,BIOMIGA)试剂盒方法提取酵母基因组DNA，并使用通用引物NL1/NL4(NL1：GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG；NL4：GGTCCGTGTTTCAAGACGG)对其26S rDNA D1/D2区域序列进行特异性扩增，PCR反应条件：94℃for 1min；52℃ for 1min；72℃ for 1min 30sec，36cycle；72℃ for 5min；4℃ save，END。扩增产物经以2％琼脂糖凝胶电泳呈单一条带，无非特异扩增现象，条带长短约593bp，送生工生物测序。将测序得到的基因序列与NCBI数据库中已有序列进行BLAST比对，与汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hanseni)菌株相似性达到99％，初步确定为汉逊德巴利酵母。为进一步显示供试菌株与己知酵母菌的亲缘关系及系统地位，根据同源性搜索结果，使用MEGA5.0生物学软件对测试菌株和相关菌株的多个序列以neighbour-joining方法建立系统发育树，所构建的系统进化发育树如图5所示，最终确定该菌为汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hanseni)。
将汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hanseni)菌株RRJ-JM-2划线于0％、8％、16％NaCl的麦芽汁培养基上，28℃倒置培养70h后，对菌株在各平板上培养特征进行观察。在0％NaCl的麦芽汁培养基上(图1)，菌落直径0.6mm，奶黄色，不透明，表面光滑，无光泽，全缘；在8％NaCl的麦芽汁培养基上(图2)，菌落直径0.8mm，奶黄色，不透明，表面光滑，无光泽，全缘；在16％NaCl的麦芽汁培养基上(图3)，菌落直径0.1mm，奶黄色，不透明，表面光滑，无光泽，全缘。对菌株RRJ-JM-2进行镜检，其细胞直径3-5μm，，菌体呈球形，芽殖。如图4所示。
实验二、耐盐性测试
以麦芽汁液体培养基为基础，添加NaCl，设定盐浓度为10％、13％、16％、18％、20％、22％、24％，灭菌后接入汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hanseni)菌株RRJ-JM-2置于28℃、160转/分摇床观察其生长状况，记录菌液混浊时间，结果如表二所示，本发明所示菌株在16％、18％NaCl以下浓度条件下生长情况良好，在20％NaCl浓度下生长极其缓慢，在22％、24％NaCl浓度下，14d内未明显观测到生长。
表二菌株耐盐性实验
NaCl浓度 10％ 13％ 16％ 18％ 20％ 22％ 24％
浑浊时间(d) 2d 2d 3d 5d 8d - -
实验三、酵母在0％NaCl浓度下麦芽汁培养基中的风味物质分析
从试管斜面上挑取汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hanseni)菌株RRJ-JM-2一环接种于30mL 0％NaCl的麦芽汁液体培养中，于28℃、160转/分摇床培养24h。吸取上述培养液1.5mL接种于150mL含0％NaCl的麦芽汁液体培养基中，于28℃、160转/分摇床培养6d后，具有浓郁的酯香。采用顶空固相微萃取，利用GC-MS测定培养基中香气成分。萃取温度60℃，时间30min。色谱条件：运用SH-Rtx-WAS(30m×0.25mm×0.32um，强极性)色谱柱；载气为高纯He；流速为1.67mL/min；进样口温度为250℃；升温程序：初始温度45℃，保持3min，以3℃/min的速度升温至180℃，保持3min，以12℃/min的速度升温至220℃保持3min；质谱条件：离子源温度为200℃；接口温度为250℃；电子轰击离子源(EI)；检测范围：35-500m/z。对采集到的质谱图进行组分和相对含量分析。结果见表三和表四。
表三菌株在0％NaCl的麦芽汁发酵液中主要挥发性风味物质相对含量变化
Figure GDA0002162724290000091
表四菌株在0％NaCl的麦芽汁发酵液中主要醇和酯类相对含量变化
Figure GDA0002162724290000092
从表三可以看出，汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hanseni)菌株RRJ-JM-2以0％NaCl的麦芽汁液体培养基为发酵底物，通过GC-MS对比发现，菌株能够有效提升发酵液中醇类和酯类物质的种类，改变醇类和酯类物质的相对含量。从表四可以看出，风味物质主要为苯乙醇、月桂酸乙酯、丙位壬内酯、十四酸乙酯、软脂酸乙酯等。
实验四：酵母在16％NaCl浓度下麦芽汁培养基中的风味物质分析
从试管斜面上挑取汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hanseni)菌株RRJ-JM-2一环接种于30mL 16％NaCl的麦芽汁液体培养中，于28℃、160转/分摇床培养24h。吸取上述培养液1.5mL接种于150mL含16％NaCl的麦芽汁液体培养基中，于28℃、160转/分摇床培养6d后，具有浓郁的果香和酯香。采用顶空固相微萃取，利用GC-MS测定培养基中香气成分。萃取温度60℃，时间30min。色谱条件：运用SH-Rtx-WAS(30m×0.25mm×0.32um，强极性)色谱柱；载气为高纯He；流速为1.67mL/min；进样口温度为250℃；升温程序：初始温度45℃，保持3min，以3℃/min的速度升温至180℃，保持3min，以12℃/min的速度升温至220℃保持3min；质谱条件：离子源温度为200℃；接口温度为250℃；电子轰击离子源(EI)；检测范围：35-500m/z。对采集到的质谱图进行组分和相对含量分析。结果见表5和表6。
表五菌株在16％NaCl的麦芽汁发酵液中主要挥发性风味物质相对含量变化
Figure GDA0002162724290000101
表六菌株在16％NaCl的麦芽汁发酵液中主要醇和酯类相对含量变化
Figure GDA0002162724290000102
SEQUENCE LISTING
<110>四川省食品发酵工业研究设计院
<120>一株汉逊德巴利酵母及其在酱油酿造中的应用
<130>2019
<160>1
<170> PatentIn version 3 .5
<210>1
<211>541
<212>DNA
<213>汉逊德巴利酵母菌
<400>1
1 acatgggggc atcgacttag tacggcgaca tgagcggcaa aagctcaaat ttgaaatctg
61 gcaccttcgg tgtccgagtt gtaatttgaa gaaggtaact ttggagttgg ctcttgtcta
121 tgttccttgg aacaggacgt cacagagggt gagaatcccg tgcgatgaga tgcccaattc
181 tatgtaaagt gctttcgaag agtcgagttg tttgggaatg cagctctaag tgggtggtaa
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541 ggatgttggc ataatgatct taagccaccc gtcttgaaca cacggacaca gca

Claims (2)

1.一株汉逊德巴利酵母菌RRJ-JM-2，其特征在于：该汉逊德巴利酵母菌于2019年3月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO： M 2019133，分类命名为：Debaryomyces hansenii RRJ-JM-2。
2.一种利用汉逊德巴利酵母菌酱油酿造的方法，其特征在于：在酱油生产过程中加入汉逊德巴利酵母菌，采用高盐稀态发酵工艺发酵，在发酵的第50天时接入汉逊德巴利酵母菌，使酱醩中酵母的含量达到5×105cfu/g，继续发酵4个月，过滤收集生油，静置澄清即得。
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Bioconversion of ferulic acid to 4-vinylguaiacol and 4-ethylguaiacol and of 4-vinylguaiacol to 4-ethylguaiacol by halotolerant yeasts belonging to the genus Candida;Yasuhiko Suezawa 等;《Biosci Biotechnol Biochem》;20070407;第71卷(第4期);摘要和第1058页右栏第2段第15-18行 *

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