CN117229929A - 一株高产酯异常威克汉姆酵母菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株高产酯异常威克汉姆酵母及其在四川麸醋发酵中的应用。所述菌株为异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）D13‑Y2，于2023年4月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.27008，该菌具有较强的产酯能力且发酵性能优良。异常威克汉姆酵母D13‑Y2应用于四川麸醋发酵，醋液中挥发性风味物质测定：接种该菌发酵使四川麸醋品质明显提高，接种组苯乙醇含量是自然发酵组2.18倍，乙酸乙酯含量是自然发酵组1.68倍，其他挥发性风味物质如2,3‑丁二醇、异戊酸、2‑羟基丙酸乙酯、乙酸苯乙酯等含量均增加。由此可知，异常威克汉姆酵母D13‑Y2可以提高食醋品质，在食醋发酵中具有良好应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株高产酯且具有良好发酵性能的异常威克汉姆酵母菌及其在四川麸醋发酵中的应用。
背景技术
食醋发酵过程中，传统酿造工艺多以经验为主，存在标准化程度低，品质不稳定等问题，因此食醋行业发酵工艺亟需改善；目前，我国对产酯酵母的应用研究已有一定基础，在增香方面有着较为显著的效果，因此受到发酵食品的较多应用，如白酒、食醋、面包发酵等；在食醋酿造方面，以产酯酵母强化大曲或直接强化醋醅发酵的研究较多，特别是在山西陈醋和镇江香醋中较为普遍，而在四川麸醋中以产酯酵母强化食醋发酵鲜有报道，且四川麸醋中酯类物质含量较低，因此提高四川麸醋中酯类物质含量很有必要。
产酯酵母又称生香酵母，是一类能够代谢生成酯类物质的酵母菌总称，现泛指生长代谢过程中能产酯气物质的酵母，不限于仅产酯的这个范围；目前国内外报道高产酯酵母包括汉逊酵母属（Hansenula）、毕赤酵母属（Pichia）、假丝酵母属（Candida）、异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）等，该类酵母在生长代谢过程中产生乙醇、乙酸等物质，并在分泌的酯化酶作用下利用环境中乙醇、乙酸及其衍生物合成以乙酸乙酯为主的香味物质，同时还产生醛、酮、酸等多种香味物质，丰富食醋的风味，直接或间接影响食醋的品质。
已有报道中，发明专利202110749569.8提供了一株产酯酵母DebaryomyceshanseniiH32，其最优发酵条件下产酯量可达1.17 g/L；发明专利201510849370.7、201810311217.2分别提供了一株具有良好产酯能力的产酯酵母，其筛选来源分别来自白酒曲药原料、发酵酱醪，且其主要应用为白酒、发酵酱油，与本发明菌种来源、主要应用对象均不相同，且产酯能力低于本发明专利提供的菌株；发明专利201711075949.8、发明专利201711135657.9分别提供了一株根霉、米曲霉来提升液态发酵米醋风味，这与本发明提供的产酯酵母不同；发明专利201010532413.6、201611064006.0分别提供及利用产香酵母制曲，进而强化提升发酵食醋香气的工艺，与本发明提供的直接添加产酯酵母种子液应用方式不同。
发明内容
本发明的目的在于提供一株筛选自四川麸醋高产酯异常威克汉姆酵母D13-Y2及其应用；本试验从四川麸醋传统发酵过程中分离纯化得到酵母菌菌株，利用嗅闻法、皂化法等方法进行筛选，最终得到一株高产酯酵母菌并应用于食醋发酵，以期达到提高四川麸醋含酯量，丰富四川麸醋香味，提高产品品质的目的，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
自四川某麸醋厂采集不同发酵时间的醋醅，分别为：1 d、5 d、9 d、13 d、20 d、25d、30 d，采用传统酵母菌种分离纯化手段从样品中分离酵母菌，共分离得到101株酵母菌。
利用嗅闻法初筛得到37株产香气较明显的酵母菌。
利用皂化法复筛得到1株产酯能力较强的酵母菌，产酯量达3.9±0.39 g/L。
得到一株高产酯且具有良好发酵性能的酵母菌，编号D13-Y2，经26S rDNA测序鉴定为异常威克汉姆酵母菌（Wickerhamomyces anomalus）；菌落呈圆形，边缘规整，表面光滑而湿润，质地柔软而黏稠，不透明，有光泽，白色。
对酵母菌D13-Y2进行产酯曲线及耐受性试验，结果显示，菌株D13-Y2在发酵第4天产酯量达峰值，在6%乙醇含量和0.3%乙酸含量内的环境中均有良好的生长及产酯能力。
将酵母菌D13-Y2按1%的接种量接入食醋固态发酵，结果显示，接种酵母菌D13-Y2发酵的食醋风味明显优于自然发酵食醋，醋液中挥发性风味物质（尤其酯类物质）的种类及相对含量均有所提高。
本发明具有以下优点。
本发明以醋醅作为筛菌来源，而土著微生物是一类常用的强化微生物，对环境有一定耐受力，且不易造成原有的微生物菌群结构发生变化，更具有安全、可靠性，筛选获得一株高产酯异常威克汉姆酵母，并证实其具有良好发酵性能。
通过发酵试验发现异常威克汉姆酵母菌D13-Y2产总酯能力突出，相比于市售曲中产酯酵母，总酯产量高出45.3%-92.8%；以豆芽汁作空白对照组，菌株D13-Y2能够发酵产生56种挥发性物质，其中包含13种酯类物质，其中乙酸乙酯占总酯含量75%。
将异常威克汉姆酵母菌D13-Y2按1%接种量接种至麸醋发酵，醋液中挥发性风味物质种类及含量显著增加，其中接种异常威克汉姆酵母的处理组（以下均简称为接种组）的苯乙醇含量是自然发酵组2.18倍，乙酸乙酯含量是自然发酵组1.68倍，乙酸乙酯是典型的香气成分之一，能够赋予食醋水果香及花香；由此可知，异常威克汉姆酵母D13-Y2可以提高食醋品质，在食醋发酵中具有良好应用潜力。
生物保藏信息。
酵母菌D13-Y2（Wickerhamomyces anomalus），于2023年4月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.27008。
附图说明
图1是产酯酵母菌D13-Y2与商业酵母产酯对比图。
图2是产酯酵母菌D13-Y2菌落形态图。
图3是产酯酵母菌D13-Y2细胞形态图。
图4是产酯酵母菌D13-Y2系统发育树。
图5是产酯酵母菌D13-Y2产酯曲线。
图6是产酯酵母菌D13-Y2乙酸耐受曲线。
图7是产酯酵母菌D13-Y2乙酸耐受曲线。
具体实施方式
本部分所描述的实施例仅仅是一部分实施例，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例都属于本发明保护的范围。
实施例1：醋醅中产酯酵母菌筛选及鉴定。
酵母菌分离纯化。
配制YPD液体培养基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，自然pH，然后121℃条件下灭菌20 min；YPD固体培养基：在液体培养基基础上添加2%的琼脂粉；生理盐水配置：0.85%的NaCl。
将逐级稀释的不同浓度的醋醅样液，涂布于YPD固体培养基平板上，28℃倒置培养，挑取疑似酵母菌落进行划线分离后采用显微镜观察和确定，筛选获得101株酵母菌，4℃下保藏备用。
酵母菌高产酯及发酵能力筛选。
产酯酵母菌初筛：使用接种环勾取一环保存于斜面培养基的酵母菌，接种于装有5 mL豆芽汁培养基的10 mL试管中，混合均匀，于28℃培养72 h，以基础豆芽汁培养基为溶剂，分别配制0 μg/L（无香）、5 μg/L（微香）、50 μg/L（较香）、100 μg/L（香气浓郁）的乙酸乙酯溶液作为阳性参照，采用嗅闻法初步判断是否产生酯香味，并淘汰不产香及产香能力弱的菌株；结果以“-”（无香）、“+”（微香）、“++”（较香）及“+++”（香气浓郁）表示，每株菌3个平行；最终得到37株产香气较明显菌株。
产酯酵母菌复筛：在嗅闻结果的基础上，选取产香能力较强的37株酵母菌为备选菌株，于PDB中活化，28℃培养至菌体密度为108 CFU/mL，8000 r/min离心10 min收集菌体，用无菌生理盐水反复洗涤2~3次后，加入等量无菌生理盐水重悬菌体；以3%接种量接种于豆芽汁培养基，28℃培养72 h后采用室温避光皂化24 h法测定发酵液总酯含量；总酯测定方法：参照《GB/T19777-2013地理标志产品山西老陈醋》规定的方法，测定样品总酯含量；最终筛选得到一株产酯能力较强的酵母菌，编号为D13-Y2，总酯产量达3.9±0.39 g/L，显著高于其他菌株（P<0.01）。
产酯酵母菌D13-Y2与市售曲中酵母产酯对比。
由醋醅中筛选得到的高产酯产酯酵母菌与市售曲中酵母菌产酯能力对比，市售曲中酵母菌由安琪香霸、安琪酿酒曲、安琪产酯活性干酵母等商业曲中筛选，实验结果由图1知，产酯酵母菌D13-Y2产酯能力突出，高出一般市售曲中酵母总酯产量45.3%-92.8%。
最终选择酵母菌D13-Y2作为高产酯酵母菌研究对象，对其进行菌种鉴定、产酯特性研究。
菌株的鉴定。
（1）形态学鉴定：将菌株D13-Y2进行形态学观察、生理生化特性和分子生物学鉴定；菌株D13-Y2在YPD固体培养基上于28℃培养24 h后，长势良好，菌落呈乳白色，突起，圆形，表面光滑且湿润，不透明，内部湿润易挑起（图2）；显微镜下细胞形态特征如图3所示，细胞为卵圆形，多边芽殖，属酵母的典型特征。
（2）分子鉴定：提取酵母菌D13-Y2总DNA后，通过通用引物扩增获得其26S rDNA序列，对其进行测序后，在NCBI数据库中进行序列比对。
菌株D13-Y2经26S rDNA序列测定，获得如下序列：
AAAAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTAGCACCTTCGGTGTTCGAGTTGTAATTTGAAGATGGTAACCTTGGGTTTGGCTCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTCTGATGAGATGCCCATTCCTATGTAAGGTGCTATCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTAGATCAGACTTGGTGTTTTACGATTATCTTCTCTTCTTGAGTTGTGCACTCGTATTTCACTGGGCCAGCATCGATTCGGATGGCAAGATAATGGCAGTTGAATGTGGCTTCACTTCGGTGGAGTGTTATAGCTTCTGCTGATATTGCCTGTCTGGATCGAGGGCTGCGTCTTTTGACTAGGATGCTGGCGTAATGATCTAATGCCGCCCGTCTTGACC。
结果显示，该菌与异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）的26S rDNA序列同源性最高，相似度达到100%，将其26S rDNA上传NCBI，利用MEGA7.0软件对该菌株及其序列相似度较高的菌株构建系统发育树（图4）；由图4可以看出该酵母与Wickerhamomyces anomalusJN083817的亲缘关系最近。
综合形态学及分子生物学试验结果，酵母菌D13-Y2被鉴定为Wickerhamomyces anomalus，将该菌株于2023年4月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.27008。
实施例2 产酯酵母产酯特性研究。
配制豆芽汁发酵培养基，以培养时间（0-8 d）、乙醇添加量（0%、1%、3%、6%、9%）、乙酸添加量（0%、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%）研究产酯酵母菌D13-Y2的产酯特性及耐受性。
按照上述条件，将产酯酵母菌D13-Y2接种于豆芽汁发酵培养基，在一定条件培养后测定总酯及生物量，探究不同因素对总酯产量及生物量的影响；由图5知，产酯酵母菌D13-Y2在发酵前期总酯产量呈上升趋势，并在发酵第4d总酯产量达最大，随发酵时间延长总酯产量降低；发酵过程中，生物量在发酵第1 d达到最大并趋于稳定；结合总酯产量与生物量变化趋势，分析可能是在发酵初期，酵母菌以生长繁殖为主，并未大量代谢产酯，发酵1d后酵母菌开始进行产物代谢，因此总酯产量逐渐增大，而发酵后期总酯产量减少，分析可能是培养基质中营养物质消耗，同时酯类物质挥发及分解，因此最佳发酵时间为4 d。
由图6知，产酯酵母菌D13-Y2在乙醇添加量为0-6%内均有较高的产酯和生长能力，说明其具有良好的乙醇耐受性；据文献报道，在适度范围内，乙醇添加有利于酯类物质合成；实验结果知，在乙醇添加量为1%时，总酯含量略高于其他组，说明在该乙醇浓度范围左右有利于酯类物质合成，过高的乙醇含量反而对酵母菌生长具有抑制作用。
由图7知，产酯酵母菌D13-Y2在乙酸添加量为0-0.3%内均有较高的产酯和生长能力；酯类物质合成是以醇和酸为前体物质，但同时高浓度酸会抑制菌的生长；实验结果知，在0.1%-0.3%的乙酸含量，酵母菌产酯能力及生物量具有较高水平，说明其对0.3%内的乙酸有良好耐受性且能利用乙酸合成酯类物质。
实例3 产酯酵母D13-Y2在固态食醋发酵中的应用。
按照以下所示的投料方式进行20 d发酵，控制原料中总淀粉含量为14%、水含量为56%为宜，固态食醋发酵主要投料配方：回糟47%、麸皮17%、小麦11%、曲药5%、高粱0.2%、荞麦0.2%、酵母种子液1%（仅接种组）。
发酵结束后，取醋液进行挥发性风味物质测定：采用顶空固相微萃取-气质联用仪（HS-SPME-GC-MS）测定接种组与自然发酵组的挥发性风味物质，结果表明，接种组中挥发性风味物质种类相较于对照组增加了2种，且含量也得到显著增加，其中苯乙醇含量是自然发酵组2.18倍，乙酸乙酯含量是自然发酵组1.68倍，而乙酸乙酯是典型的香气成分之一，能够赋予食醋水果香及花香；其他挥发性风味物质如2,3-丁二醇、异戊酸、2-羟基丙酸乙酯、乙酸苯乙酯等含量均增加；由此可知，异常威克汉姆酵母D13-Y2可以提高食醋品质，在食醋发酵中具有良好应用潜力。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1. 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株高产酯异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）D13-Y2，其特征在于：2023年4月3日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号：CGMCC No.27008。
2.一种权利要求1所述的高产酯异常威克汉姆酵母，其特征在于：所述的异常威克汉姆酵母分离自四川麸醋醋醅并应用于四川麸醋发酵。
3.一种包含权利要求1所述的高产酯酵母菌D13-Y2的微生物菌剂，所述的微生物菌剂为固体菌剂或液体菌剂。
4. 一种权利要求2所述的异常威克汉姆酵母的应用，其特征在于：所述的异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）D13-Y2应用于四川麸醋发酵，将异常威克汉姆酵母种子液按1%接种量进行接种，采用顶空固相微萃取-气质联用仪（HS-SPME-GC-MS）测定发酵结束后醋液中的挥发性风味物质，结果表明，接种异常威克汉姆酵母菌的处理组（以下均简称为接种组）挥发性风味物质种类及含量显著增加，接种组中苯乙醇含量是自然发酵组2.18倍，乙酸乙酯含量是自然发酵组1.68倍，而乙酸乙酯是典型的香气成分之一，能够赋予食醋水果香及花香，其他挥发性风味物质如2,3-丁二醇、异戊酸、2-羟基丙酸乙酯、乙酸苯乙酯等含量均增加。由此可知，异常威克汉姆酵母D13-Y2可以提高食醋品质，在食醋发酵中具有良好应用潜力。
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