CN111647517B - 一株产蛋白酶的诞沫假丝酵母 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株产蛋白酶的诞沫假丝酵母，属于食品微生物技术领域。本发明的诞沫假丝酵母菌株，分离自传统郫县豆瓣酿造体系，已于2020年3月17日保藏于中国普通微生物保藏管理中心，保藏编号CGMCC NO.19481。本发明的诞沫假丝酵母筛选自郫县豆瓣酿造体系，可耐受高盐等环境，产生较高水平的酸性蛋白酶。利用该菌株，模拟郫县豆瓣环境分批发酵，在高盐条件下，所生产的蛋白酶在pH 3时测定的酶活为6.73U/mg，总蛋白酶活为21.91U/mg。本发明中的诞沫假丝酵母菌株因具有高渗条件下分解蚕豆蛋白的能力及纯天然菌株的来源属性，郫县豆瓣加工，高氮底物食品加工等。

Description

一株产蛋白酶的诞沫假丝酵母
技术领域
本发明涉及一株产蛋白酶的诞沫假丝酵母，属于食品微生物技术领域。
背景技术
氨基酸态氮浓度是评价发酵酱及酱油调味品品质的重要指标。发酵酱及酱油中的氨基酸来源于原料蛋白质的降解，更高的蛋白质降解率会有利于提升产品品质及产量。以郫县豆瓣中的蚕豆醅发酵为例，以蚕豆、面粉及盐为原料，蚕豆醅短时烫瓣，裹面粉，加入米曲霉制曲48-60h。在制曲阶段，米曲霉充分生长并分泌蛋白酶，将大分子蛋白降解为多肽，少量寡肽和少量氨基酸。制曲结束后，成曲添加盐水(19％-21％NaCl)，形成高渗的酱醅状态。高渗状态一方面抑制腐败微生物的繁殖，另一方面允许少量有益微生物繁殖。有益微生物在繁殖过程中，利用多肽、氨基酸及糖生成风味物质(图1)。并且在高渗的酱醅阶段，氨基酸浓度在发酵前7天迅速上升，中期变化不明显，到后期显著提升。而大分子肽(1.4-12kDa)在发酵前期浓度上升，中后期浓度下降(图2)，可见在豆酱发酵的高渗酱醅阶段前期能够积累大量的氨基酸态氮，从而为微生物的生长繁殖及豆酱的发酵提供了良好的条件。
在目前研究中，研究者普遍认为，在发酵酱及酱油制作过程中，制曲阶段为原料降解阶段，高渗的酱醅阶段为产香阶段。高渗的酱醅阶段是否存在原料(蛋白质或多肽)降解功能？若存在，哪些功能微生物发挥降解功能？若能清晰回答如上问题及获得功能菌种，在高渗的酱醅阶段添加功能菌株，将有机会大大提升蛋白降解效率或提升氨基酸浓度。同时，蛋白酶还能够在高渗的酱醅阶段分解原料中的蛋白质，生成风味物质的前体物质，进而再形成复杂的风味物质。但目前研究中，许多菌株不能在高渗酸性的环境中很好地生长，部分能在高渗酸性的环境中生长的菌株功能较单一，生产的蛋白酶酶活也较低，导致了氨基酸态氮含量低、风味物质不佳等问题。
因此，需要寻找一株可在高渗状态下产蛋白酶的菌株，将该菌株添加入高渗酱醅阶段，可以适应酱类产品的发酵环境，生产的蛋白酶酶活高，能够促进原料中蛋白质的分解，从提高发酵体系中的氨基酸态氮和风味物质的含量方面，进而提高酱类产品的品质。
发明内容
针对现有的技术难点及存在的问题，本发明以郫县豆瓣蚕豆醅发酵样品为筛选源，筛选假丝酵母，最终得到一株在高渗状态下表达蛋白酶的诞沫假丝酵母(Candidazeylanoides)，并将其应用于郫县豆瓣蚕豆醅生产。
本发明的第一个目的是提供一株在高渗状态下具有高产酸性蛋白酶能力的诞沫假丝酵母KB4，已于2020年3月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.19481，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明提供一种所述诞沫假丝酵母KB4的培养方法，所述方法是将所述诞沫假丝酵母KB4接种至15～20％(w/v)盐水中进行培养。
在本发明的一种实施方式中，培养温度为25～35℃。
本发明的提供一种微生物菌剂，所述微生物菌剂中含有所述诞沫假丝酵母KB4的微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中还含有任何能够应用于食品、饲料或药物的任意种属的菌株；所述菌株为酿酒酵母、鲁氏接合酵母、嗜盐四联球菌、嗜热链球菌、乳杆菌中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，制备所述菌剂的方法为将诞沫假丝酵母KB4接种至培养基中，在30～40℃下活化至对数中后期，传代培养2～3次至菌液中细胞浓度达到1.0×106cfu/mL以上活菌数时，将菌液在6000～10000rpm下离心15～25min收集沉淀，在沉淀中依次加入缓冲液和冷冻保护剂，待细胞浓度为不低于1.0×107cfu/mL时，进行真空冷冻干燥处理，得到微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，待细胞浓度为不低于1.0×108cfu/mL时，真空冷冻干燥处理。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为双蒸水或磷酸缓冲溶液，冷冻保护剂为海藻糖或脱脂乳粉。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为pH值为5～8的0.1～1M磷酸盐缓冲液，所述冷冻保护剂为5％～20％(w/v)的海藻糖和/或脱脂乳粉。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为pH值为7的0.2M磷酸盐缓冲液，所述冷冻保护剂为10～15％(w/v)的海藻糖或脱脂乳粉。
本发明提供了一种生产蛋白酶的方法，所述方法是以所述诞沫假丝酵母KB4为发酵菌株，在高盐、高酸的环境中进行产酶。
在本发明的一种实施方式中，所述蛋白酶为酸性、中性和碱性蛋白酶。
在本发明的一种实施方式中，所述高盐的环境中盐浓度为15～20％(w/v)，所述高酸的环境中pH为4.3～4.9。
本发明提供一种提高豆酱中氨基酸态氮的方法，所述方法是将所述含有诞沫假丝酵母KB4的盐水加入曲料中制备酱醅，在35～40℃培养。
在本发明的一种实施方式中，所述曲料与盐水的比例为(95～120):(100～140)(w/w)。
本发明保护所述微生物菌剂在制备豆类发酵食品中的应用，所述食品包括蚕豆酱、黄豆酱、酱油。
本发明保护生产蛋白酶的方法在制备豆类发酵食品中的应用，所述食品包括蚕豆酱、黄豆酱、酱油。
本发明保护提高豆酱中氨基酸态氮的方法在制备豆类发酵食品中的应用，所述食品包括蚕豆酱、黄豆酱、酱油。
本发明的有益效果：
1、本发明的诞沫假丝酵母CGMCC NO.19481筛选自郫县豆瓣蚕豆醅高渗酱醅发酵体系中，具有耐受郫县豆瓣生产中的酸性(pH为4.4～4.6)、高盐(18％NaCl)的酿造环境的特性，可在极端环境中长期保持生长；
2、本发明的诞沫假丝酵母在高盐条件下生产的蛋白酶，总酶活达21.91U/mg，在pH＝3的条件下，蛋白酶酶活可达6.73U/mg，在pH＝7的条件下，蛋白酶酶活可达4.68U/mg，在pH＝10的条件下，蛋白酶酶活10.50U/mg；
3、利用其制备的豆酱，可生产得到50种风味物质，物质种类丰富，其中，具有清甜的玫瑰样花香的苯乙醇含量可达187.6mg/L，能够使得豆酱的风味得到提升。
生物材料保藏
诞沫假丝酵母，分类学命名为诞沫假丝酵母Candida zelanoides，于2020年3月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，中国科学院微生物研究所保藏编号为CGMCC NO.19481，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
图1为郫县豆瓣酿造过程图示。
图2为蚕豆醅发酵过程—高渗酱醅阶段，多肽、寡肽及氨基酸浓度变化。
图3为在发酵过程中诞沫假丝酵母所产的蛋白酶酶活变化图；CandidazelanoidesKB4为本发明的菌株。
具体实施方式
LB培养基：胰蛋白胨1％(w/v)，酵母提取物0.5％(w/v)，NaCl 15％(w/v)，自然pH。
PDA固体培养基：胰蛋白胨2％(w/v)，酵母提取物1％(w/v)，葡萄糖2％(w/v)，NaCl15％(w/v)，自然pH。
酶活测定方法：收集1mL发酵液，10000rpm、离心10min，除去沉淀，收集上清液，即为酱醪的蛋白酶粗提液；将蛋白酶粗提液用酸性(pH＝3)、中性(pH＝7)、碱性(pH＝10)缓冲液稀释10倍，4℃超声浸提1h，即为待测酶液；根据GB/T23527-2009《蛋白酶制剂》测定蛋白酶粗提液中的酶活。
蚕豆醅样品的氨基氮浓度测定：具体步骤参考《中华人民共和国专业标准ZB X66038-87》。
豆酱中风味物质测定：通过SPME-GC-MS分析方法(具体步骤参照胡传旺.酱油发酵过程微生物群落解析及功能研究[D].江南大学硕士学位论文,2017.)。
对比例中所使用的诞沫假丝酵母KB1来自于诞沫假丝酵母KB4筛选过程中得到的另一菌株。
实施例1：诞沫假丝酵母的筛选
(1)制备样品稀释梯度并培养
称取5g郫县豆瓣蚕豆醅原料，加入50mL无菌生理盐水进行震荡至形成悬浊液。吸取菌悬液，以无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，取100-200μL稀释后的菌悬液涂布于含15％(w/v)NaCl的YPD培养基平板上，于37℃有氧培养48h，当出现白色菌落，立刻随机挑取单菌落，进行分离、纯化后，接种入分装有LB液体培养基的试管中，过夜培养后。
(2)划线分离与纯化
将长出菌落的平板取出后，选取单菌落明显的平板，挑取不同菌落形态的菌落，进行二次划线并进行菌株培养，如此重复几次，直至纯化出所有单菌落。
(3)ITS序列扩增
吸取1mL菌液6000rpm离心3min，倾去上清，水洗两次，离心倾去上清液，获得菌泥，以此为模板，进行PCR扩增，流程如下：
1)扩增体系20μL：
其中模板量为1μL(27F 0.5μL、1492R 0.5μL)，Taq酶MasterMix为10μL，ddH2O为7μL。
所用引物为：
ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。
2)扩增条件：
预变性：95℃3min；
第一步变性：94℃1min；
第二步退火：60℃30s；
第三步延伸：72℃2min；
循环次数：30次循环；
第四步最后延伸：72℃5min；
第五步保持：12℃10min。
(4)菌株序列送测与鉴定
将PCR成功的样品送到华大基因进行检测，根据华大基因反馈的序列结果，结合NCBI菌株序列数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行BLAST检索，选取匹配度最高的菌株信息进行结果记录。
经分析鉴定，本发明提供的菌株为诞沫假丝酵母(Candida zeylanoides)。
(5)菌株保藏
诞沫假丝酵母KB4已于2020年3月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.19481。
实施例2：诞沫假丝酵母KB4在高盐高渗条件下生产蛋白酶
(1)制曲
先用沪酿3042米曲霉(购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为中科3.951)来进行制曲。将米曲霉接种于PDA固体培养基中，培养3-5天，至表面有一层细密的孢子。用无菌的一次性涂布棒刮取孢子，收集备用。
精确称取100g蚕豆，将其在100℃沸水中烫瓣10s，随后立即放入45℃水浴3min，使蚕豆内充满水分。随后称取30g小麦粉，将0.003g米曲霉孢子与小麦粉充分混合，拍打均匀，之后将该含曲霉孢子的小麦粉与蚕豆充分混合，在28℃进行制曲培养；共培养3-5天，期间结块翻曲，至表面充满一层黄绿色的曲霉菌丝。之后将曲料进行115℃，30min灭菌3次以除去曲霉孢子。
(2)菌株在高浓度盐水中的培养
在无菌条件下，将-80℃保存的诞沫假丝酵母KB4菌株，接种于YPD液体培养基中，30℃，200rpm，培养24h，得到菌液，将菌液在8000rpm下离心20min收集沉淀，在沉淀中加入2.0％(w/v)的生理盐水，形成菌悬液，将菌悬液按上述步骤进行离心并收集沉淀，将沉淀加入18％(w/v)盐水中，使得菌浓为1.0×108CFU/mL。
(3)菌株发酵豆酱
将盐水加入曲料中来制作酱醅，曲料与盐水的比例为100:120(w/w)，之后在37℃培养。
(4)蛋白酶活和氨基氮浓度的测定
在发酵7天后，测定样品中的蛋白酶酶活及氨基酸态氮浓度。
结果显示：在添加诞沫假丝酵母KB4发酵的豆酱中，在pH 3时测定的酶活为6.73U/mg，总蛋白酶活为21.91U/mg。
并在发酵的第1、2、3、4、5天分别实时监测酸性、中性、碱性蛋白酶的酶活(图3)，由图可知，在发酵前期，诞沫假丝酵母所产的蛋白酶具有良好的酶活，能够很好地用于降解豆酱中的大分子蛋白质，为后续豆瓣的发酵打下了良好的基础。
测定发酵7天后的豆瓣酱样品，豆酱的氨基酸态氮浓度提升了19.54％。
表1菌株制备的豆酱中不同pH下蛋白酶酶活(U/mg)
Figure BDA0002543193990000061
表2菌株制备的豆酱中氨基酸态氮浓度
Figure BDA0002543193990000062
对比例1
具体实施方式参见实施例2，区别在于，将所述诞沫假丝酵母KB4替换为在诞沫假丝酵母KB4筛选过程中得到的另一株诞沫假丝酵母KB1，结果显示，该菌株生产的总蛋白酶活为10.43U/mg(表1)，氨基氮浓度提升了8.82％(表2)。
实施例3：利用诞沫假丝酵母制备的豆瓣酱及风味物质检测
具体实施方式参见实施例2，进行制曲、将菌株在高浓度盐水中培养、菌株发酵豆酱，在发酵7天之后，取豆酱样品测定豆酱中的风味物质(表3)。由表可知，制备得到豆酱风味物质丰富，可达50种，其中，具有清甜的玫瑰样花香的苯乙醇含量可达187.6mg/L，能够使得豆酱的风味得到提升。
表3菌株发酵豆酱中的风味物质
Figure BDA0002543193990000063
Figure BDA0002543193990000071
实施例4：诞沫假丝酵母的微生物菌剂的制备
取200～600μL的诞沫假丝酵母接种于10～30mL YPD液体培养基中，37℃下活化2至3代，待诞沫假丝酵母达到108cfu/mL以上活菌数时，5000～10000rpm下离心10～20min，去除上清液后，在无菌环境下依次加入缓冲液(pH值为7的0.2M磷酸盐缓冲液)和冷冻保护剂(15～20g/100mL的海藻糖和/或脱脂乳粉)，待细胞浓度不低于107cfu/mL时，真空冷冻干燥处理得到固体菌剂。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一株诞沫假丝酵母(Candida zelanoides)，已于2020年3月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.19481。
2.权利要求1所述诞沫假丝酵母的培养方法，其特征在于，所述方法是将所述诞沫假丝酵母接种至浓度为15~20 g/100 mL NaCl溶液中进行培养。
3.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂含有权利要求1所述诞沫假丝酵母。
4.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中还含有酿酒酵母、鲁氏接合酵母、嗜盐四联球菌、嗜热链球菌、乳杆菌中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中还含有任意能用于食品或药物的载体。
6.制备权利要求3~5任一所述微生物菌剂的方法，其特征在于，所述微生物菌剂是将权利要求1所述诞沫假丝酵母以双蒸水或磷酸缓冲溶液为缓冲液、以海藻糖或脱脂乳粉为冷冻保护剂制备得到。
7.一种生产蛋白酶的方法，其特征在于，所述方法是以权利要求1所述的诞沫假丝酵母为出发菌株，在高盐、高酸的环境中进行产酶；所述蛋白酶为酸性、中性和碱性蛋白酶；所述高盐的环境中NaCl浓度为15~20 g/100 mL，所述高酸的环境中pH为4.3~4.9。
8.一种提高豆酱中氨基酸态氮的方法，其特征在于，所述方法是将含有权利要求1所述诞沫假丝酵母的盐水加入曲料中制备酱醅，在30~40℃培养。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述曲料与盐水的质量比为（90~120）:（100~150）。
10.权利要求1所述诞沫假丝酵母，或权利要求3~5任一所述微生物菌剂在制备豆类发酵食品中的应用。
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