CN117887598A - 一种芦笋酵母及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物工程技术领域，公开了一种芦笋酵母及其应用，该菌株于2024年01月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.29806。本发明从芦笋特性出发，提取芦笋天然酵母使之自然繁殖所得，芦笋酵母比一般酵母风味更佳，因为芦笋酵母是多种菌，无论发酵任何产品都会散发出不同的香味，让发酵产品风味更多样化。芦笋酵母中含有的乳酸菌酸性强，能抑制细菌的滋生，同时混杂在芦笋酵母中的醋酸菌、乳酸菌等在发酵的时候会产生有机酸，也赋予产品独特的风味和醇正浓郁的味道。
Description
技术领域
本发明涉及微生物工程技术领域，特别涉及一种芦笋酵母及其应用。
背景技术
中国是芦笋的最大生产国，远远领先于其他国家，中国芦笋相对集中的产地分布在山东菏泽、江苏徐州等地。芦笋含有丰富的维生素B、维生素A以及叶酸、硒、铁、锰、锌等微量元素及富含蛋白质、维生素、多糖、黄酮类、皂苷等多种活性成分。芦笋具有人体所必需的各种氨基酸。芦笋含硒量高于一般蔬菜，与含硒丰富的蘑菇接近, 甚至可与海鱼、海虾等的含硒量媲美，具有抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力等功效，是一种食药兼用型蔬菜，被誉为“蔬菜之王”。
为了使芦笋的营养成份及药用价值得到最大发挥，制备芦笋酵母成为了芦笋产业链关键因素，因芦笋富含高蛋白质，极易造成酸败现象，给芦笋精深加工行业带来了困难，导致芦笋精深加工滞后发展，因此制备一款芦笋酵母助力芦笋精深加工发展成为了行业间的难题。
发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种芦笋酵母及其应用。
本发明是通过如下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供了一种芦笋酵母，该菌株于2024年01月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.29806。
进一步的，所述芦笋酵母为强凝聚性菌种。
进一步的，它能够利用的碳源有果糖和半乳糖，不能够利用的碳源有木糖、阿拉伯糖和纤维二糖；能够利用的氮源有蛋白胨、硝酸钾和酵母粉，不能够利用的氮源是硝酸铵和硫酸铵。
第一方面，本发明还提供了芦笋酵母应用，它应用于葡萄糖和蔗糖发酵。
此外，还可以应用于酒醅发酵，提升酒体感官品质；以及它应用于芦笋汁和麦芽糖发酵。
与现有技术相比，本发明的有益之处为：
1、本发明从芦笋特性出发，提取芦笋天然酵母使之自然繁殖所得，芦笋酵母比一般酵母风味更佳，因为芦笋酵母是多种菌，无论发酵任何产品都会散发出不同的香味，让发酵产品风味更多样化。芦笋酵母中含有的乳酸菌酸性强，能抑制细菌的滋生，同时混杂在芦笋酵母中的醋酸菌、乳酸菌等在发酵的时候会产生有机酸，也赋予产品独特的风味和醇正浓郁的味道。
2、本发明芦笋酵母更多保留了酵母所含的各种营养，酵母体内蛋白质含量多达一半，含有18种以上的氨基酸、肽类物质，尤其是富含谷物中含量不足的赖氨酸,同时还含有丰富的微量元素钙、铁、锌、镁、硒、铬、锰等和维生素B1、B2、B6 、B12以及泛酸等B族维生素，不含胆固醇及饱和脂肪酸。芦笋酵母发酵能力强、速度快、产香气多等优点且具有明显的提高免疫活性的作用。本发明对丰富芦笋产品有一定的研究意义。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1为本发明酵母单菌落分离平板照片；
图2为本发明酵母菌的显微镜照片；
图3为本发明各瓶发酵度和酵母死亡率柱状图；
图4为本发明聚集性测定实验图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。
实施例1
本发明提供了一株芦笋酵母，该菌株于2024年01月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.29806，分类命名为异常威克汉姆酵母Wickerhamomyces anomalus，该菌株命名为LSN01。菌落形态如图1-2所示。
实施例2
芦笋酵母的制备方法包括以下步骤：
（1）将新鲜芦笋经过清洗、破碎打浆、过滤得到芦笋汁，让芦笋汁自然发酵7天；
（2）MS培养基：MS液体培养基添加千分之二的小麦淀粉和杀菌后的百分之一的18bix的芦笋汁；
分离培养基：YEPD培养基中添加安苄青霉素25μg/mL，pH5.2；
种子培养基：采用YEPD培养基；
（3）吸取1ml（1）中的芦笋汁，按照10倍梯度稀释至10-7，取1μL稀释液涂步于分离培养基平板上，每个梯度涂布3个平行，在32℃的恒温培养箱中培养3天，同时观察菌落并记录；
（4）将（3）培养皿内的菌落较稀处挑选单个菌落接入分离培养基上划线分离至纯种；
（5）将（4）中原菌稀释培养于培养皿中，置于20KW紫外线灯30cm处照射25s，然后挑选菌落进行实验，最后得到2株酵母菌菌种；
（6）将（5）中得到的2株菌种分别接入酒精体积分数为6%、9%的麦芽汁培养基中，于30℃培养48h，比较酵母的存活率。反复转接至存活率相近，再经YEPD培养基平板分离，选出1株较理想的酵母菌菌种；
（7）把第（6）步骤制备的酵母液体用无菌水稀释，从稀释酵母液体中吸取1ml置于装有9ml无菌水的试管中,即稀释倍数为10-1；
（8）同上述方法一样从10-1试管里吸取1ml于9ml无菌水的试管中,即稀释倍数为10-2。同样接出10-3、10-4、10-5、10-6……
（9）在稀释过程中，每步均要抽取菌液镜检，当一个视野内酵母数为1-2个或无酵母菌时,即可停止稀释；
（10）将上述稀释后的试管中的菌液分别接种于灭菌的培养皿中,并记上稀释倍数以示分辨；将灭菌后的芦笋汁MS培养基冷至45℃左右，倒入上述培养液中，摇匀后于25℃生化培养箱中培养2~3天，每天检查菌落的生长情况；
（11）根据菌落的生长情况，选择25个形态整齐，大小均匀,菌态饱满的菌落用接种环接种于斜面试管中，每个选择菌落接2支斜面试管,即共接50支试管，分别编号培养，培养基采用 芦笋汁MS培养基，培温28-30℃，时间36小时，将培养好的每个编号拿出一支，分别接入5000 ml三角瓶内，每瓶装200 ml，SO2添加量为180 ppm，于28-30℃发酵4天；
(12) 检测发酵液的残糖、总酸、酒精度鉴定酵母的热死温度、对乙醇和SO2抵抗力、发酵力与酒精得率，观察发酵情况，产酒精速度，香味构成，筛选出发酵好，旺盛的芦笋酵母。
实验结果表明，本发明芦笋酵母更多保留了酵母所含的各种营养，酵母体内蛋白质含量多达一半，含有18种以上的氨基酸、肽类物质，尤其是富含谷物中含量不足的赖氨酸,同时还含有丰富的微量元素钙、铁、锌、镁、硒、铬、锰等和维生素B1、B2、B6 、B12以及泛酸等B族维生素，不含胆固醇及饱和脂肪酸。芦笋酵母发酵能力强、速度快、产香气多等优点且具有明显的提高免疫活性的作用。
实施例3 分离菌种的鉴定
（1）形态学观察：将分离得到的菌株接种于种子培养基，30℃培养1 d，连续活化培养两代后，取100 L活化液涂布接种至种子培养基中，30℃培养3 d，观察菌落形态，并挑取单菌落，美兰染色制作水浸片后在显微镜下观察细胞形态。
（2）生理生化鉴定：参照贾丽艳等（果香风味导向的库德毕赤酵母FJZ的分离鉴定及生物学特性研究）的生理生化试验方法对分离菌株进行糖类发酵试验(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉)、碳源同化试验(果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、纤维二糖)、氮源同化试验(硝酸铵、硫酸铵、硝酸钾、蛋白胨、酵母粉)。
芦笋酵母的生理生化试验结果见下表1。由下表1可知，芦笋酵母可发酵葡萄糖和蔗糖，不可发酵可溶性淀粉；可利用的碳源有果糖和半乳糖，不可利用的碳源有木糖、阿拉伯糖和纤维二糖；可利用的氮源有蛋白胨、硝酸钾和酵母粉，不可利用的氮源是硝酸铵和硫酸铵。
表1 芦笋酵母生理生化试验结果
（3）分子生物学鉴定：利用DNA快速提取试剂盒提取分离菌株的基因组DNA，以其为模板，采用通用引物26S rDNA(5’一GCATATCGGTAAGCGGAGGAAAAG一3’)和1492R(5’一GGTCCGTGTTTCAAGACGG—3’)进行聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction，PC心扩增。PCR扩增结果委托第三方进行测序。将测序结果在数据库中进行基本局部比对搜索工具同源性比对搜索，选择同源性较高的模式菌株的26SrDNA基因序列使用ClustalX2和MEGAll．0软件处理，采用邻接(neighbo卜joining，NJ)法构建系统进化树。
菌种的26S进化树鉴定结果
菌种序列与Wickerhamomyces anomalus（异常威克汉姆酵母）的26S序列完全一致，因此，该菌种属鉴定为异常威克汉姆酵母。
此外，结果表明本发明酵母能够分泌β-D-葡萄糖苷酶、β-D-木糖苷酶、α-L-鼠李糖苷酶等多种糖苷酶，并且具有一定的产香、产酯和产酒精的能力，可以显著提升酒体感官品质，是酒醅发酵过程中重要的功能性微生物。
实施例4
芦笋酵母是否优良必须通过做酵母的特性实验即发酵度、死亡率、凝聚性、发酵速度的测定,死亡温度及小样实验等,才能选育出优良健壮的芦笋酵母菌株。
（1）发酵度和死亡率的测定从上述第11步骤中的50支斜面试管中挑选18支形态好、边缘整齐、菌落饱满的菌株，分别接种于装有20ml无菌芦笋浓缩汁的试管中,置于25℃恒温培养24小时。在将上述试管中的菌株接入装有300ml芦笋MS培养基的500ml带棉塞的小三角瓶中。接种后将三角瓶置于25℃的恒温箱中每天摇动三角瓶数次，3-4天，直至不在产生泡沫为止。测定各瓶发酵度和酵母死亡率。结果见图3。
（2）取发酵率高且死亡率低的菌株12支再做凝聚性测定实验。将上述选出的12支菌株,同测定发酵度一样的方法，接入三角瓶中，置于25℃培养箱中培养3~4天，然后将培养液离心分离，倒出上部清液，取得芦笋汁下沉液测凝聚性。取4-6g芦笋汁下沉液放入盛有30ml硫酸钙溶液的离心管中，摇匀离心分离,去上清液。以30ml硫酸钙溶液洗涤酵母，离心，去上清液。在15ml离心管中加10ml硫酸钙缓冲液，加入上述酵母lg使其悬浮，在20℃的水溶液中保持20分钟。振荡5分钟,使酵母悬浮,静置10分钟测定沉淀酵母的体积结果见图4。实验结果表明，测得沉淀酵母体积为1.5ml，判定芦笋酵母为强凝聚性菌种。
（3）从凝聚性测定实验结果中选出6支凝聚性强的菌株做发酵速度实验。取待测的6支菌株，各接一环盛于装有20ml麦汁的试管中，在25℃恒温培养24小时。将上述试管菌种分别接入装有350ml芦笋浓缩汁500ml 的小三角瓶中，置于10℃生化培养箱中培养，每天测定其外观糖度,当外观糖度降为3.5'Bx，记下发酵天数,以发酵天数对比来判断其发酵速度，实验结果显示，该菌株的衰败期为14h，为了使菌株在驯化诱导过程中生香，避免生酸，控制该菌株的发酵时间为36h。
（4）从中挑4株发酵好、速度快的做死亡温度对比实验，微生物的死亡温度是指该微生物在某温度下10分钟被杀死的温度。芦笋酵母菌对高温的抵抗力不高,一般在液态加热至50-60℃数分钟就会失去活性。酵母死亡温度高，则证明它耐热能力强。分别从上述4株培育菌种各挑一环接入装有5ml麦汁的试管中，在25℃的恒温下培养24小时。在50℃、52℃和54℃下分别保温10分钟(每种温度2支，其中1支插入温度计)，立即用冷水冷至室温，然后移至 25℃恒温箱培养。每天观察试管酵母的发酵情况，观察一周，如在对应某温度下该管中酵母菌不繁殖，则此温度即为死亡温度。为了求得较精确的芦笋酵母菌的死亡温度范围，在上述实验测定的问隔范围内，再以间隔时间为1℃用同样的方法实验。最终得到取耐温性能好的菌种2株做小样实验。
（5）小样实验
小样实验是在同样的条件下，通过小批量芦笋汁经菌种发酵后，观察其发酵过程,并进行品尝检测，以此来判断菌种的发酵、还原、产酸及样品的口味和风味，最终选择得到优良健壮的菌株。
工艺如下：菌株→活化→试管→小角瓶→大三角瓶→卡氏罐→1吨小罐→过滤
详细步骤如下：
芦笋酵母菌株
准备37℃的70%酒精浴槽，从液氮罐中取出安瓿瓶，将低温安瓿瓶从低温保存条件中取出，置于37℃浴槽之小试管架上。不断轻微摇动低温安瓿瓶，液面不可高至管塞，直至结冰完全溶解。
芦笋酵母活化
用无菌微量吸管，从已溶解之低温安瓿瓶，吸取 1-2滴菌液，滴入固态指定培养基边缘附近，以划线法接种于培养基。将接种好的培养基置于培养箱中培养。
手持金属接种环，用酒精灯将接种环（共约5公分）烧至火红，并不断来回烧烤金属固定杆之前约10cm，等待约10秒钟，将接种环前端轻触培养基边缘凝胶（无菌体部份），待接种环完全冷却后，以环沾黏菌滴，由MS培养基边缘向中央轻轻横划紧接的并行线，直到涵盖1/3培养基为止。灼烧接种环，待数秒冷却后，旋转培养基自I区涂布的边缘再横划数条线到未接种的区域。
试管培养
取出培养箱中的芦笋酵母。在无菌环境下，以沾有75%酒精的棉花擦拭外管，吸取0.3-0.5mL无菌水，滴入内管内，以无菌吸管吸取并滴入约含有5ml无菌水之试管内，轻微震荡使其均匀后，静置30至60分钟。取0.1-0.2mL之菌体悬浮液于指定的试管培养基上，本实施例采用MS培养基，用无菌L型玻棒均匀涂抹，以检验菌种之纯度及活化情形，而剩余的菌体则全部移入指定的试管固体培养基内，并依指定的温度培养。
芦笋酵母扩培：
小三角瓶培养：
用1000 ml三角瓶装600 ml芦笋汁，糖度要求在18—20，常压杀菌1小时，每瓶接一支固体试管，于28-30℃下培养24小时，成熟后检测有无杂菌。
大三角瓶培养
用3000 ml三角瓶每瓶装18—20的芦笋汁2000 ml，经常压杀菌1小时，按6%的接种量接种小三角瓶，于28—30℃培养20 小时成熟可用。
卡氏罐培养
将培养结束的大三角瓶轻轻振荡均匀后，全部接入15L芦笋汁卡氏罐中，然后于18±1℃培养24~36小时，正常生产使用。
1吨小罐
在进入1吨发酵罐之前，进行酵母扩配，首先制备50升麦芽汁，控制在20℃打入扩配罐，再将15升芦笋汁卡氏罐酵母原液打入50升扩配罐，进行扩配20小时，扩配期间每间隔6小时冲氧10min。待扩配罐酵母数达到108次方后，随麦芽汁打入1吨发酵罐，进行发酵，发酵结束后过滤，得到成品。
本发明从芦笋特性出发，提取芦笋天然酵母使之自然繁殖所得，芦笋酵母比一般酵母风味更佳，因为芦笋酵母是多种菌，无论发酵任何产品都会散发出不同的香味，让发酵产品风味更多样化。芦笋酵母中含有的乳酸菌酸性强，能抑制细菌的滋生，同时混杂在芦笋酵母中的醋酸菌、乳酸菌等在发酵的时候会产生有机酸，也赋予产品独特的风味和醇正浓郁的味道。
通过以上酵母泥的挑选,纯化、选育和小样实验,选育出活力强、发酵速度快、发酵力高、香气浓、适用于芦笋汁和麦芽糖发酵的优良菌种。将上述菌种复壮，再进行到两次平板分离，复壮，放置于4℃冰箱保藏备用。该菌种已于2024年01月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.29806，分类命名为异常威克汉姆酵母Wickerhamomyces anomalus，该菌株命名为LSN01。
Claims (6)
1.一种芦笋酵母，其特征在于，该酵母2024年01月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.29806，保藏名称为LSN01。
2.根据权利要求1所述的芦笋酵母，其特征在于，所述芦笋酵母为强凝聚性菌种。
3.根据权利要求1所述的芦笋酵母，其特征在于，它能够利用的碳源有果糖和半乳糖，不能够利用的碳源有木糖、阿拉伯糖和纤维二糖；能够利用的氮源有蛋白胨、硝酸钾和酵母粉，不能够利用的氮源是硝酸铵和硫酸铵。
4.一种权利要求1所述的芦笋酵母应用，其特征在于，它应用于葡萄糖和蔗糖发酵。
5.一种权利要求1所述芦笋酵母的应用，其特征在于，它应用于酒醅发酵，提升酒体感官品质。
6.一种权利要求1所述芦笋酵母的应用，其特征在于，它应用于芦笋汁和麦芽糖发酵。
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