CN111053195B - 基于前发酵紫红曲霉为优势共生菌系的大豆酱及制作方法 - Google Patents

基于前发酵紫红曲霉为优势共生菌系的大豆酱及制作方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于前发酵紫红曲霉为优势共生菌系的大豆酱及制作方法，属于调味品制作技术领域。选用大豆为原料，利用紫红曲霉TYQ017、米曲霉3.042、雅致放射毛霉、黑曲霉、青霉、枯草芽孢杆菌、马克思克鲁维酵母组合成的复合菌种进行三段式发酵，促进了游离氨基酸的产生，提高了天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸含量，结合枯草芽孢杆菌，促进优势菌生长的同时抑制病原菌产生，最后，马克思克鲁维酵母的介入提升了豆酱的醇香风味，使豆酱色泽鲜亮、入口绵润、酱香浓郁、后味鲜美持久。本发明在保留大豆酱自身营养的同时富含红曲色素和洛伐他丁，具有降低胆固醇、预防心血管疾病发生的功效，可提升产能，缩短生产周期，具有良好的社会效益。

Description

基于前发酵紫红曲霉为优势共生菌系的大豆酱及制作方法
技术领域
本发明属于调味品制作技术领域，尤其涉及一种基于前发酵紫红曲霉TYQ017为优势共生菌系富含降胆固醇因子的大豆酱及其制作方法。
背景技术
传统大豆酱，采用传统工艺，自然发酵、生产周期长，生产效率低，能源消耗较大，但保持了大豆酱特有的风味和香气。现在工业化生产大豆酱采用单一菌种进行制曲，缩短了生产周期，提高了产品品质，但单一菌种制曲，导致原料利用率降低，使生产出的酱品风味和口感不如传统发酵的酱，酱的颜色较深。
豆酱的自然发酵受到许多因素的影响,如食盐浓度、发酵pH值、溶氧浓度、气温高低、谷物的化学成分、原料附生微生物的数量及菌相比例等。这些因素以及它们之间的相互作用影响到整个自然发酵的进程和菌系变化,进而影响到最终产品的质量。
优良的豆酱发酵剂应来源于自然发酵的优质酱类。发酵剂质量的优劣直接影响到产品的口感、风味和香气等感官特征。因此,优良的发酵剂菌株对于研制豆酱发酵剂来说是十分重要的。自然发酵的豆酱风味独特,这与其中微生物的发酵作用是密不可分的。因此,对自然发酵的优质豆酱进行菌系分析,确定其菌相组成和比例,成为研究豆酱接种发酵的一个首要条件。
大豆中激活的脂肪氧化酶可将多不饱和脂肪酸氧化成过氧化物,最终降解为低分子醛、酮、醇等挥发性成分,这些小分子物是大豆腥味的主要来源。有研究表明,微量(500μg/kg)的己醛能够使得食品有令人非常不愉快的气味。
紫红曲霉的重要产物有红曲色素、洛伐他丁、Monacolin K。其中红曲色素安全性高、热稳定性较强、对蛋白质的着色性好、不易褪色、色彩鲜艳、具有生产周期短、产量稳定、价格波动相对较小，已广泛使用于奶酪、米酒、肉制品和鱼制品等生产中。紫红曲霉的次级代谢产物洛伐他汀及其衍生物，具有降低胆固醇的功效，可预防心血管疾病的发生。
米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸。米曲霉3.042，具有产孢快、生长迅速的特点，生命力顽强，对环境的适应力强，有利于生产控制。米曲霉3.042在产生酯类物质方面具有优势，酯类在酱料中起着香甜、浓郁而柔和的基底作用；米曲霉3.042产物中含量较多的有2－甲基丁酸乙酯、异戊酸乙酯、棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯等，与酱香气的浓重有着直接关系。
雅致放射毛霉直接发酵全脂大豆乳状液,能够提高其蛋白质和油脂的溶出率,提高的程度分别为10.03％和8.48％，且对大豆蛋白质有良好的水解性能,蛋白质水解度可达74.94％,但其中只有12.67％水解到了游离氨基酸水平,既利于蛋白质的溶出,又保证了水解后的蛋白质应有的功能特性。利用雅致放射毛霉对豆渣进行发酵，可将粗蛋白含量从28.14％上升至30.61％；粗脂肪从12.05％上升至13.32％，可溶性膳食纤维从6.01％上升至11.71％，同时豆渣蛋白的氨基酸组成也发生了改变，改善了豆渣的基本营养价值。
产酶菌株大多数为青霉属或曲霉属，黑曲霉是重要的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶等。，黑曲霉发酵酶液富含糖化酶、淀粉酶及纤维素酶等，可以利用发酵体系中的淀粉、还原糖等，并为大曲、红曲等物料中富含的酯化菌类提供物质基础，并促进酯化酶的产生。
枯草芽孢杆菌能迅速消耗肠道中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，间接抑制其它致病菌生长。还可刺激动物(人体)免疫器官的生长发育，激活T、B淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力。
马克斯克鲁维酵母，是一种新型的食品安全级酵母，它可以耐受高温、高渗透压及酸性环境。它具有生长迅速、耐高温、能吸收糖类、产生乙醇等多种特点,因而适合大批量的工业生产。此外,将马克斯克鲁维酵母能够发酵产生矿物质、小分子肽等有机物质和醇类、酯类等风味物质，有益于身心健康。
现有技术存在的问题是：
传统大豆酱，采用传统工艺，自然发酵、菌种不明确，具体风味物质不明确，安全没保障，生产周期长，生产效率低，能源消耗较大，很难实现标准化；
现在工业化生产大豆酱采用单一菌种进行制曲，缩短了生产周期，提高了产品品质，但单一菌种制曲，导致原料利用率降低，使生产出的酱品风味和口感不如传统发酵的酱，酱的颜色较深；
自然发酵过程中容易因外界条件变化产生不良气味，成品风味总有不同，难以完全统一风味。
上述技术问题虽然早已被厂家和研究人员发现，但一直无法得到有效的解决，其难度主要表现在：
需要对比国内外对酱的研究，进行大量实验，探索可以改良的发酵条件或工艺环节，通过标准化工艺，不受环境温度限制，控制温度，缩短生产周期；
需要对传统大豆酱的风味成分进行分析，找出影响风味的靶向物质和优势菌群，单一菌种可对风味进行分析，确定靶向风味物质；
需要对优势菌群进行分离纯化，将分离出的菌群重新接种，分析风味变化，不断对风味进行改良，继续分离纯化菌株，依次循环进行大量实验，直到解决风味问题，得出能够改善风味的菌剂组成；
对于风味单一问题：对比传统农家酱为突出其独特风味，需控制其菌种添加的合理度，以免产生不良风味。
发明内容
本发明提供一种基于前发酵紫红曲霉为优势共生菌系的大豆酱及制作方法，以解决传统大酱风味物质不明确，安全没保障，生产周期长，生产效率低，能源消耗较大，原料利用率，降低，很难实现标准化。
本发明采取的技术方案是：是由以下步骤制得的：
步骤一、精选大豆：选取大豆要求蛋白含量＞40％，脂肪含量＞20％，经过机械分级精选；
步骤二、气蒸祛腥：120℃下气蒸3-5min；
步骤三、糖液煮制熟化：加入0.5％-1％β-葡聚糖溶液进行高温熟化，溶液添加量为干豆体积的1.5-2.5倍，进行高温熟化，熟化参数为100℃，35-40min，熟化后冷却备用；
步骤四、酶解:加入中性蛋白酶和谷氨酰胺转胺酶对大豆蛋白进行复合改性；混合比例中性蛋白酶：谷氨酰胺转胺酶＝1:1.5，温度55℃、时间0.5h、pH7.0、酶用量为上一步中全部物料重量的2.5％-5％；
步骤五、辗绊：将物料转移至斩拌机充分辗绊；
步骤六、一次接菌：接入紫红曲霉TYQ017、雅致放射毛霉、黑曲霉、米曲霉3.042、青霉，菌种比例为紫红曲霉TYQ017：雅致放射毛霉：黑曲霉：米曲霉3.042：青霉＝5:2:0.5:2:0.5，接种温度25-32℃，接菌量为上一步中全部物料重量的2-3％；
步骤七、制酱醅：将接菌后的酱料挤压置于发酵池中；
步骤八：前发酵；
步骤九、辗绊、一次注盐水：盐水浓度18％-20％,加水量为干豆体积的一倍；
步骤十、二次接菌：接入枯草芽孢杆菌，接种温度35-40℃，接菌量为上一步中全部物料重量的1％-2％；
步骤十一、稀盐半固态发酵，于35-40℃发酵30-45天；
步骤十二、二次注盐水：稀释至盐水浓度9％-11％；
步骤十三、三次接菌；注水后接入马克思克鲁维酵母，接种温度26-32℃，接菌量为上一步中全部物料重量的0.5％-1％；
步骤十四：后发酵，后发酵温度为26-32℃，发酵30-40天；
步骤十五、罐装；封口；灭菌；成品。
本发明采用大豆绥农29，蛋白含量41.92％，脂肪含量21.28％。
本发明所述步骤八中，发酵温度25-32℃，发酵时间保持48-72h。
本发明所述紫红曲霉TYQ017，Monascus purpureus在中国典型培养物保藏中心的保藏号为：CCTCC No.M2019844，保藏日期2019年10月21日，地址：中国，武汉，武汉大学。
本发明所述步骤十五中，发酵好后的大豆酱采用自动包装机进行灌装、封口；灌装后采用水浴杀菌，杀菌温度80℃，时间30分钟，然后冷却至15℃；将冷却后的包装袋装箱，即为成品。
一种基于前发酵紫红曲霉为优势共生菌系的大豆酱的制作方法，包括下列步骤：
步骤一、精选大豆：选取大豆要求蛋白含量＞40％，脂肪含量＞20％，经过机械分级精选；
步骤二、气蒸祛腥：120℃下气蒸3-5min；
步骤三、糖液煮制熟化：加入0.5％-1％β-葡聚糖溶液进行高温熟化，溶液添加量为干豆体积的1.5-2.5倍，进行高温熟化，熟化参数为100℃，35-40min，熟化后冷却备用；
步骤四、酶解:加入中性蛋白酶和谷氨酰胺转胺酶对大豆蛋白进行复合改性；混合比例中性蛋白酶：谷氨酰胺转胺酶＝1:1.5，温度55℃、时间0.5h、pH7.0、酶用量为上一步中全部物料重量的2.5％-5％；
步骤五、辗绊：将物料转移至斩拌机充分辗绊；
步骤六、一次接菌：接入紫红曲霉TYQ017、雅致放射毛霉、黑曲霉、米曲霉3.042、青霉，菌种比例为紫红曲霉TYQ017：雅致放射毛霉：黑曲霉：米曲霉3.042：青霉＝5:2:0.5:2:0.5，接种温度25-32℃，接菌量为上一步中全部物料重量的2-3％；
步骤七、制酱醅：将接菌后的酱料挤压置于发酵池中；
步骤八：前发酵；
步骤九、辗绊、一次注盐水：盐水浓度18％-20％,加水量为干豆体积的一倍；
步骤十、二次接菌：接入枯草芽孢杆菌，接种温度35-40℃，接菌量为上一步中全部物料重量的1％-2％；
步骤十一、稀盐半固态发酵，于35-40℃发酵30-45天；
步骤十二、二次注盐水：稀释至盐水浓度9％-11％；
步骤十三、三次接菌；注水后接入马克思克鲁维酵母，接种温度26-32℃，接菌量为上一步中全部物料重量的0.5％-1％；
步骤十四：后发酵，后发酵温度为26-32℃，发酵30-40天；
步骤十五、罐装；封口；灭菌；成品。
本发明采用大豆绥农29，蛋白含量41.92％，脂肪含量21.28％。
本发明所述步骤八中，发酵温度25-32℃，发酵时间保持48-72h。
本发明所述紫红曲霉TYQ017，Monascus purpureus在中国典型培养物保藏中心的保藏号为：CCTCC No.M2019844，保藏日期2019年10月21日，地址：中国，武汉，武汉大学。
本发明所述步骤十五中，发酵好后的大豆酱采用自动包装机进行灌装、封口；灌装后采用水浴杀菌，杀菌温度80℃，时间30分钟，然后冷却至15℃；将冷却后的包装袋装箱，即为成品。
本发明解决了传统大豆酱，生产效率低，能源消耗较大问题；改良了大豆酱风味，使大豆酱酯香浓厚，后味香甜，酱香浓郁而柔和；提高了产品品质，提高了大豆蛋白利用率。与传统农家酱制作工艺对比，实现发酵时间的可控性，缩短了生产周期。
本发明有益效果是通过气蒸祛腥、糖液煮制熟化、中性蛋白酶和谷氨酰胺转胺酶复合作用，在脱除大豆豆腥味的同时，提高了大豆蛋白的溶解性、乳化性、发泡性；通过分段式接种充分发挥各菌种优势特征，紫红曲霉TYQ017为代表的霉菌共生体系协同作用，促进了游离氨基酸的产生，提高了天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸含量，结合枯草芽孢杆菌，促进优势菌生长的同时抑制病原菌产生，最后，马克思克鲁维酵母的介入提升了豆酱的醇香风味，使豆酱色泽鲜亮、入口绵润、酱香浓郁、后味鲜美持久。本发明在保留大豆酱自身营养的同时富含红曲色素和洛伐他丁，具有降低胆固醇、预防心血管疾病发生的功效，可提升产能，缩短生产周期，具有良好的社会效益。
附图说明
图1、本发明优势菌的菌种鉴定图；
图2、本发明优势菌菌种鉴定结果图。
具体实施方式
实施例1
是由以下步骤制得的：
步骤一、精选大豆绥农29，蛋白含量41.92％，脂肪含量21.28％，经过机械分级精选；
步骤二、气蒸祛腥：120℃下气蒸3min；
步骤三、糖液煮制熟化：加入0.5％β-葡聚糖溶液进行高温熟化，溶液添加量为干豆体积的1.5倍，进行高温熟化，熟化参数为100℃，35min，熟化后冷却备用；
步骤四、酶解:加入中性蛋白酶和谷氨酰胺转胺酶对大豆蛋白进行复合改性；混合比例中性蛋白酶：谷氨酰胺转胺酶＝1:1.5，温度55℃、时间0.5h、pH7.0、酶用量为上一步中全部物料重量的2.5％；
步骤五、辗绊：将物料转移至斩拌机充分辗绊；
步骤六、一次接菌：接入紫红曲霉TYQ017、雅致放射毛霉、黑曲霉、米曲霉3.042、青霉，菌种比例为紫红曲霉TYQ017：雅致放射毛霉：黑曲霉：米曲霉3.042：青霉＝5:2:0.5:2:0.5，接种温度25℃，接菌量为上一步中全部物料重量的2％；所述紫红曲霉TYQ017，Monascus purpureus在中国典型培养物保藏中心的保藏号为：CCTCC No.M2019844，保藏日期2019年10月21日，地址：中国，武汉，武汉大学；
步骤七、制酱醅：将接菌后的酱料挤压置于发酵池中；
步骤八：前发酵；发酵温度25℃，发酵时间保持48h；
步骤九、辗绊、一次注盐水：盐水浓度18％,加水量为干豆体积的一倍；
步骤十、二次接菌：接入枯草芽孢杆菌，接种温度35℃，接菌量为上一步中全部物料重量的1％；
步骤十一、稀盐半固态发酵，于35℃发酵30天；
步骤十二、二次注盐水：稀释至盐水浓度9％；
步骤十三、三次接菌；注水后接入马克思克鲁维酵母，接种温度26℃，接菌量为上一步中全部物料重量的0.5％；
步骤十四：后发酵，后发酵温度为26℃，发酵30天；
步骤十五、酵好后的大豆酱采用自动包装机进行灌装、封口；灌装后采用水浴杀菌，杀菌温度80℃，时间30分钟，然后冷却至15℃；将冷却后的包装袋装箱，即为成品。
实施例2
是由以下步骤制得的：
步骤一、精选大豆绥农29，蛋白含量41.92％，脂肪含量21.28％，经过机械分级精选；
步骤二、气蒸祛腥：120℃下气蒸4in；
步骤三、糖液煮制熟化：加入0.7％β-葡聚糖溶液进行高温熟化，溶液添加量为干豆体积的2.0，进行高温熟化，熟化参数为100℃，37.5min，熟化后冷却备用；
步骤四、酶解:加入中性蛋白酶和谷氨酰胺转胺酶对大豆蛋白进行复合改性；混合比例中性蛋白酶：谷氨酰胺转胺酶＝1:1.5，温度55℃、时间0.5h、pH7.0、酶用量为上一步中全部物料重量的3.7％；
步骤五、辗绊：将物料转移至斩拌机充分辗绊；
步骤六、一次接菌：接入紫红曲霉TYQ017、雅致放射毛霉、黑曲霉、米曲霉3.042、青霉，菌种比例为紫红曲霉TYQ017：雅致放射毛霉：黑曲霉：米曲霉3.042：青霉＝5:2:0.5:2:0.5，接种温度28℃，接菌量为上一步中全部物料重量的2.5％；所述紫红曲霉TYQ017，Monascus purpureus在中国典型培养物保藏中心的保藏号为：CCTCC No.M2019844，保藏日期2019年10月21日，地址：中国，武汉，武汉大学；
步骤七、制酱醅：将接菌后的酱料挤压置于发酵池中；
步骤八：前发酵；发酵温度29℃，发酵时间保持60h；
步骤九、辗绊、一次注盐水：盐水浓度19％,加水量为干豆体积的一倍；
步骤十、二次接菌：接入枯草芽孢杆菌，接种温度38℃，接菌量为上一步中全部物料重量的1.5％；
步骤十一、稀盐半固态发酵，于38℃，发酵38天；
步骤十二、二次注盐水：稀释至盐水浓度10％；
步骤十三、三次接菌；注水后接入马克思克鲁维酵母，接种温度26-32℃，接菌量为上一步中全部物料重量的0.75％；
步骤十四：后发酵，后发酵温度为28℃，发酵35天；
步骤十五、酵好后的大豆酱采用自动包装机进行灌装、封口；灌装后采用水浴杀菌，杀菌温度80℃，时间30分钟，然后冷却至15℃；将冷却后的包装袋装箱，即为成品。
实施例3
是由以下步骤制得的：
步骤一、精选大豆绥农29，蛋白含量41.92％，脂肪含量21.28％，经过机械分级精选；
步骤二、气蒸祛腥：120℃下气蒸5min；
步骤三、糖液煮制熟化：加入1％β-葡聚糖溶液进行高温熟化，溶液添加量为干豆体积的2.5倍，进行高温熟化，熟化参数为100℃，40min，熟化后冷却备用；
步骤四、酶解:加入中性蛋白酶和谷氨酰胺转胺酶对大豆蛋白进行复合改性；混合比例中性蛋白酶：谷氨酰胺转胺酶＝1:1.5，温度55℃、时间0.5h、pH7.0、酶用量为上一步中全部物料重量的5％；
步骤五、辗绊：将物料转移至斩拌机充分辗绊；
步骤六、一次接菌：接入紫红曲霉TYQ017、雅致放射毛霉、黑曲霉、米曲霉3.042、青霉，菌种比例为紫红曲霉TYQ017：雅致放射毛霉：黑曲霉：米曲霉3.042：青霉＝5:2:0.5:2:0.5，接种温度32℃，接菌量为上一步中全部物料重量的3％；所述紫红曲霉TYQ017，Monascus purpureus在中国典型培养物保藏中心的保藏号为：CCTCC No.M2019844，保藏日期2019年10月21日，地址：中国，武汉，武汉大学；
步骤七、制酱醅：将接菌后的酱料挤压置于发酵池中；
步骤八：前发酵；发酵温度32℃，发酵时间保持72h；
步骤九、辗绊、一次注盐水：盐水浓度20％,加水量为干豆体积的一倍；
步骤十、二次接菌：接入枯草芽孢杆菌，接种温度40℃，接菌量为上一步中全部物料重量的2％；
步骤十一、稀盐半固态发酵，于40℃发酵45天；
步骤十二、二次注盐水：稀释至盐水浓度11％；
步骤十三、三次接菌；注水后接入马克思克鲁维酵母，接种温度32℃，接菌量为上一步中全部物料重量的1％；
步骤十四：后发酵，后发酵温度为32℃，发酵40天；
步骤十五、酵好后的大豆酱采用自动包装机进行灌装、封口；灌装后采用水浴杀菌，杀菌温度80℃，时间30分钟，然后冷却至15℃；将冷却后的包装袋装箱，即为成品。
下边结合实验例对本发明作进一步说明。
实验例1：优势菌种的分离、纯化及鉴定
实验材料
1.1实验原料：大豆绥农29；
1.2菌种：紫红曲霉TYQ017来自于吉林省田野泉酿造有限公司，进行菌种保藏、米曲霉3.042、雅致放射毛霉、黑曲霉、青霉、枯草芽孢杆菌、耐盐酵母；
1.3培养基：32778毛霉培养基、Luria-Bertani培养基、3042豆汁试管培养基1.4；实验试剂：基因组DNA(20ng/μl)，10×Buffer(含2.5mM Mg2+)，Taq聚合酶(5u/μl)，dNTP(10mM)，27F引物(10uM)，1492R引物(10uM)
1.5实验仪器：
旋涡震荡器QL-861江苏省海门市麒麟医用仪器厂
洁净工作台SW-CJ-2D苏州净化设备有限公司
台式高速冷冻离Neofuge13R上海力申科学仪器有限公司
pcr仪ABI-2720美国AppliedBiosystems公司
精密移液器一套EppendorfCo.,Germany
ND2000 NanoDrop2000 Thermo.,USA
电泳仪MiniPro300VPowerSupply majorscience.,USA
电泳槽LabnetSubSystem70 LabnetInc.,USA
测序仪ABI3730XL美国AppliedBiosystems公司
实验方法
(一)真菌基因组DNA的提取
1从平板上刮取一定样品置于2ml离心管，加入200μl缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。
注意：加入溶壁酶进行破壁处理，具体方法为:加入180μl缓冲液(20mM Tris,pH8.0；2mM Na2-EDTA；1.2％Trise；终浓度为20mg/ml的溶壁酶，37℃处理30min以上。
2向管中加入20μlProteinaseK溶液，混匀。
3加入220μl缓冲液GB,振荡15sec，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
4加220μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
5将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
6向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
7向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
8重复操作步骤8.
9将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3至于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液。
注意：这一步的目的是将吸附柱中残留的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切，PCR等)实验。
10将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50～200μl洗脱缓冲液TE,室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。
注意：洗脱缓冲液的体积不应少于50μl，体积过小影响回收率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用ddH2O做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min。
(二)真菌基因组PCR扩增
表1引物设计
引物名称 序列
ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG
ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC
PCR扩增反应体系：在0.2ml离心管中加入以下成分：
表2 PCR扩增反应体系
轻弹混匀，瞬时离心收集管壁上的液滴至管底,在PCR扩增仪上进行PCR反应，反应参数如下：
表3 PCR扩增反应程序
预变性 变性 退火 延伸 终延伸 循环数
95℃，5min 95℃，30s 58℃，30s 72℃，1min 72℃，7min 35
反应完成后，取3ulPCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。确认PCR扩增片段。
(三)PCR产物的回收
PCR产物用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒回收，具体操作按试剂盒说明书进行，步骤如下：
1在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶放入干净的离心管中，称取重量。
2加入3个凝胶体积的BufferDE-A，混合均匀后于75℃加热直至凝胶块完全熔化。
3加0.5个BufferDE-A体积的BufferDE-B，混合均匀；当分离的DNA片段小于400bp时，加入1个凝胶体积的异丙醇。
4将混合液，转移到DNA制备管12,000×g离心1min。弃滤液。
5将制备管置回2ml离心管，加500μlBufferW1，12,000×g离心30s，弃滤液。
6将制备管置回2ml离心管，加700μl BufferW2，12,000×g离心30s，弃滤液。以同样的方法再用700μlBufferW2，12,000×g离心1min。
7将制备管置回2ml离心管中，12,000×g离心1min。
8将制备管置于洁净的1.5ml离心管(试剂盒内提供)中，在制备膜中央加25-30μl去离子水，室温静置1min。12,000×g离心1min洗脱DNA。
(四)序列测定
取各个菌种纯化后的PCR产物，使用测序仪ABI3730-XL进行DNA测序。
(五)序列分析
用NCBI Blast程序将拼接后的序列文件与NCBI核酸数据库中的数据进行比对，得到与待测物种序列相似性最大的物种信息，即为鉴定结果。
表4：各样品NCBI比对结果
DNAidentificationresults Identities
Aspergillus niger(ID.NO1) 100％
Aspergillus niger(ID.NO4) 99.80％
Monascus purpureus 100％
Penicillium polonicum 100.00％
图1为菌种鉴定过程PCR电泳图，从图中可以看出所检测菌种为纯菌，表4及图2为优势菌菌种鉴定相似度比对和斜面菌照片。
实验例2：成品酱工艺、配方优化
按本发明步骤中工艺及配方范围进行六因素五水平正交试验优化，以感官评分为评价指标，筛选出综合感官评分大于85分的工艺及配方，作为风味及营养成分评定基础。
表5：大豆酱感官评分标准
表6：正交试验因素水平表
表7：正交试验结果分析表
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(该表为六因素五水平正交试验分析表结果，其中感官评分是按表5标准进行评价，表中“1-5”各水平按表6对应添加)
实验例2：成品酱风味及营养成分分析
将成品酱工艺、配方优化试验中筛选出的感官评分大于85分的酱料进行植物库广靶测序分析和动物库广靶测序分析，分析不同参数所得酱料的营养成分含量(主要为部分氨基酸)、风味物质种类及含量。
表8：挥发性成分检测表
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/>
表9：保证同等氨基酸含量下发酵周期比较
发酵类型 发酵时间
自然发酵 270d-360d
单种制曲发酵 190-300d
混合菌种制曲发酵(本发明) 62d-88d
依照表5标准进行感官评分，依照表6添加量进行试验，依照表7分析结果中感官评分不低于85分的酱料样品进行植物库广靶测序和动物库广靶测序，表8为检测结果。综合表7和表8中因素水平组合，在保证感官评分不低于85分，氨基酸及其衍生物含量不低于20％的情况下，本发明利用发酵前期，紫红曲霉TYQ017为代表的霉菌共生体系协同作用，所含菌种明确，在原料大豆品种、数量不改变的基础上，提高了豆酱中天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸等营养物质的含量，大大提高了产品品质及原料利用率。
在保证感官评分不低于85分，氨基酸及其衍生物含量不低于20％的情况下，本发明利用发酵前期，紫红曲霉TYQ017为代表的霉菌共生体系协同作用，使成品酱中风味物质明确可控，促进了豆酱中游离氨基酸的产生，提高了豆酱中氨基酸及其衍生物含量(见表8)，结合枯草芽孢杆菌，促进优势菌生长的同时抑制病原菌产生，最后，马克思克鲁维酵母的介入提升了豆酱的醇香风味，大大增加2-(甲硫基)乙醇、3-甲硫基丙醇等醇类物质含量，抑制了硫化氢等含硫物质产生，改善了自然发酵过程中因外界条件变化产生的不良气味，使豆酱醇香浓郁，后味鲜美持久。
本发明所制大豆酱通过二次注水稀释降低了发酵豆酱的含盐量，结合紫红曲霉TYQ017菌落特征和产红曲色素和洛伐他丁的代谢特征，改良了酱品颜色，所制成品低盐可口、色泽鲜亮
本发明在保证感官评分不低于85分，氨基酸及其衍生物含量不低于20％的情况下，本发明大大缩短了生产周期(见表9)，提高了生产效率，降低了能耗，具有良好的社会效益。

Claims (6)

1.一种基于前发酵紫红曲霉为优势共生菌系的大豆酱，其特征在于，是由以下步骤制得的：
步骤一、精选大豆：选取大豆要求蛋白含量＞40％，脂肪含量＞20％，经过机械分级精选；
步骤二、气蒸祛腥：120℃下气蒸3-5min；
步骤三、糖液煮制熟化：加入0.5％-1％β-葡聚糖溶液进行高温熟化，溶液添加量为干豆体积的1.5-2.5倍，进行高温熟化，熟化参数为100℃，35-40min，熟化后冷却备用；
步骤四、酶解:加入中性蛋白酶和谷氨酰胺转胺酶对大豆蛋白进行复合改性；混合比例中性蛋白酶：谷氨酰胺转胺酶＝1:1.5，温度55℃、时间0.5h、pH7.0、酶用量为上一步中全部物料重量的2.5％-5％；
步骤五、辗绊：将物料转移至斩拌机充分辗绊；
步骤六、一次接菌：接入紫红曲霉TYQ017、雅致放射毛霉、黑曲霉、米曲霉3.042、青霉，菌种比例为紫红曲霉TYQ017：雅致放射毛霉：黑曲霉：米曲霉3.042：青霉＝5:2:0.5:2:0.5，接种温度25-32℃，接菌量为上一步中全部物料重量的2-3％；所述紫红曲霉TYQ017，Monascus purpureus在中国典型培养物保藏中心的保藏号为：CCTCC No.M2019844；
步骤七、制酱醅：将接菌后的酱料挤压置于发酵池中；
步骤八：前发酵，发酵温度25-32℃，发酵时间保持48-72h；
步骤九、辗绊、一次注盐水：盐水浓度18％-20％,加水量为干豆体积的一倍；
步骤十、二次接菌：接入枯草芽孢杆菌，接种温度35-40℃，接菌量为上一步中全部物料重量的1％-2％；
步骤十一、稀盐半固态发酵，于35-40℃发酵30-45天；
步骤十二、二次注盐水：稀释至盐水浓度9％-11％；
步骤十三、三次接菌；注水后接入马克思克鲁维酵母，接种温度26-32℃，接菌量为上一步中全部物料重量的0.5％-1％；
步骤十四：后发酵，后发酵温度为26-32℃，发酵30-40天；
步骤十五、罐装；封口；灭菌；成品。
2.根据权利要求1所述的一种基于前发酵紫红曲霉为优势共生菌系的大豆酱，其特征在于：采用大豆绥农29，蛋白含量41.92％，脂肪含量21.28％。
3.根据权利要求1所述的一种基于前发酵紫红曲霉为优势共生菌系的大豆酱，其特征在于：所述步骤十五中，发酵好后的大豆酱采用自动包装机进行灌装、封口；灌装后采用水浴杀菌，杀菌温度80℃，时间30分钟，然后冷却至15℃；将冷却后的包装袋装箱，即为成品。
4.一种基于前发酵紫红曲霉为优势共生菌系的大豆酱的制作方法，其特征在于，包括下列步骤：
步骤一、精选大豆：选取大豆要求蛋白含量＞40％，脂肪含量＞20％，经过机械分级精选；
步骤二、气蒸祛腥：120℃下气蒸3-5min；
步骤三、糖液煮制熟化：加入0.5％-1％β-葡聚糖溶液进行高温熟化，溶液添加量为干豆体积的1.5-2.5倍，进行高温熟化，熟化参数为100℃，35-40min，熟化后冷却备用；
步骤四、酶解:加入中性蛋白酶和谷氨酰胺转胺酶对大豆蛋白进行复合改性；混合比例中性蛋白酶：谷氨酰胺转胺酶＝1:1.5，温度55℃、时间0.5h、pH7.0、酶用量为上一步中全部物料重量的2.5％-5％；
步骤五、辗绊：将物料转移至斩拌机充分辗绊；
步骤六、一次接菌：接入紫红曲霉TYQ017、雅致放射毛霉、黑曲霉、米曲霉3.042、青霉，菌种比例为紫红曲霉TYQ017：雅致放射毛霉：黑曲霉：米曲霉3.042：青霉＝5:2:0.5:2:0.5，接种温度25-32℃，接菌量为上一步中全部物料重量的2-3％；所述紫红曲霉TYQ017，Monascus purpureus在中国典型培养物保藏中心的保藏号为：CCTCC No.M2019844；
步骤七、制酱醅：将接菌后的酱料挤压置于发酵池中；
步骤八：前发酵，发酵温度25-32℃，发酵时间保持48-72h；
步骤九、辗绊、一次注盐水：盐水浓度18％-20％,加水量为干豆体积的一倍；
步骤十、二次接菌：接入枯草芽孢杆菌，接种温度35-40℃，接菌量为上一步中全部物料重量的1％-2％；
步骤十一、稀盐半固态发酵，于35-40℃发酵30-45天；
步骤十二、二次注盐水：稀释至盐水浓度9％-11％；
步骤十三、三次接菌；注水后接入马克思克鲁维酵母，接种温度26-32℃，接菌量为上一步中全部物料重量的0.5％-1％；
步骤十四：后发酵，后发酵温度为26-32℃，发酵30-40天；
步骤十五、罐装；封口；灭菌；成品。
5.根据权利要求4所述的一种基于前发酵紫红曲霉为优势共生菌系的大豆酱的制作方法，其特征在于：采用大豆绥农29，蛋白含量41.92％，脂肪含量21.28％。
6.根据权利要求4所述的一种基于前发酵紫红曲霉为优势共生菌系的大豆酱的制作方法，其特征在于：所述步骤十五中，发酵好后的大豆酱采用自动包装机进行灌装、封口；灌装后采用水浴杀菌，杀菌温度80℃，时间30分钟，然后冷却至15℃；将冷却后的包装袋装箱，即为成品。
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