CN116694486A - 一种胶红酵母菌株及其在制备酱油中的应用 - Google Patents

一种胶红酵母菌株及其在制备酱油中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种胶红酵母菌株及其在制备酱油中的应用，胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)GT_317，于2022年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M20222012，保藏地址为中国·武汉·武汉大学，应用于酱油发酵生产，高产具有脂香的不饱和脂肪酸及其脂类衍生物，促进发酵产脂后的乳化、厚重效果，并在酱油颜色形成后发挥固色、澄清的作用，在促进酱油增脂、增香、增质方面具有良好的效果，具有广泛的应用前景。

Description

一种胶红酵母菌株及其在制备酱油中的应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及到一种胶红酵母菌株及其在制备酱油中的应用。
背景技术
酱油是以大豆、小麦等为原料，经过微生物的发酵作用，产出的具有增香、调色作用的调味品。酱油底物大豆虽然富含油脂，但在长时间的酱油酿造过程中极易被氧化或代谢形成小分子物质，或以油囊体形式存于残渣被浪费。因此，酱油本应含有的脂香味在发酵过程中被转换殆尽。此外，酱油榨油后常进行多批勾兑、稀释调配工艺，导致酱油挂壁、粘特性和厚重感下降，菜品上色能力差。并且酱油多酚类易于氧化，导致酱油色泽异变品质下降。
目前，胶红酵母多用于饲料发酵、环境改良等领域，尚未发现其被应用在酱油增脂、增香以及潜在的护色、增质方面。
专利(申请号202010574324.1)虽然公开了高产苯乙醇的耐盐胶红酵母菌株，但其核心在于提升酱油最普遍的酱香与醇香风味，而不是酱油领域广泛缺失的脂香风味，并且其未提出关于酱油护色、增质改良的内容。
因此，本领域亟需一种弥补香气缺陷、改良色泽质地的酱油酿造菌株。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)GT_317。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)GT_317，于2022年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20222012，保藏地址为中国·武汉·武汉大学。
作为本发明所述胶红酵母的一种优选方案，其中：所述胶红酵母在20％NaClw/w、pH＝3.5、8％乙醇w/w环境中生长，抗胁迫能力强。
本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种胶红酵母在制备酱油中的应用。
作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述胶红酵母高产具有脂香的不饱和脂肪酸及其脂类衍生物。
作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述具有脂香的不饱和脂肪酸及其脂类衍生物，包括亚油酸、亚麻酸、亚油酸甲酯、亚油酸乙酯和硬脂酸甲酯。
作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述胶红酵母促进酱油发酵产脂后的乳化、厚重效果。
作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述胶红酵母在酱油颜色形成后发挥固色、澄清的效果。
本发明的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种胶红酵母在促进酱油增脂、增香中的应用。
本发明有益效果：
本发明提供一种胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)GT_317，于2022年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M20222012，保藏地址为中国·武汉·武汉大学，本发明的胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)GT_317可在20％NaCl(w/w)、pH＝3.5、8％乙醇(w/w)环境中生长，应用于酱油发酵生产，高产具有脂香的不饱和脂肪酸及其脂类衍生物，促进发酵产脂后的乳化、厚重效果，并在酱油颜色形成后发挥固色、澄清的作用，在促进酱油增脂、增香、增质方面具有良好的效果，具有广泛的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明实施例中胶红酵母在YPD营养琼脂上的菌落形态及光学显微镜镜检图。
图2为本发明实施例中胶红酵母受胁迫生长数据图。
图3为本发明实施例中酱油颜色、质地图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
本发明胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)GT_317，于2022年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20222012，保藏地址为中国·武汉·武汉大学。
实施例1：胶红酵母的分离
酱醪来自天津科技大学3年陈酿高盐稀态酱醪，采用五点法取样，充分混匀后置于无菌甘油EP管中并存放于-80℃冰箱。
无菌条件下称取-80℃保存的酱油样品5.0g，与45mL无菌生理盐水混合，与摇床中振荡2h，使微生物细胞分散，制成10-1稀释度的稀释液，并进行系列梯度稀释。
分别取0.1mL稀释度为10-3、10-4和10-5的稀释液接种到YPD营养琼脂培养基中，涂布后将平板分别置于30℃培养箱中培养48h，观察并挑取产生色素的菌落，并进行反复划线纯化得到纯种菌株。
在YPD固体培养基上进行平板划线，30℃恒温培养箱培养48h，观察菌落形态：菌落的大小、颜色、形状，菌落边缘、凸起情况，如图1。
挑取的菌落颜色呈现橘色；外形以圆形为主，表面湿润，粘稠，易挑起，表面光滑。
筛选出的菌株不能发酵半乳糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、蜜二糖、乳糖、纤维二糖、淀粉；可以同化葡萄糖、半乳糖、山梨糖、核糖、木糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖。
最适生长温度30±2℃，最高温度45℃。
实施例2：胶红酵母的分子生物学鉴定
挑取小米粒大小的菌落(克隆直径为0.1-0.3cm大小)至TE溶液中，尽量避免挑取任何固体培养基(混有培养基会影响后续基因组提取效果)。
添加100μL TE溶液，充分重悬沉淀，再添加20μL溶菌酶、10μL RNaseA，充分混匀，37℃孵育2.5小时，每隔30分钟摇匀一次。添加100μL LYS溶液(55℃提前预热)，轻轻吹打混匀。再添加20μL蛋白酶K溶液，充分混匀。55℃孵育30分钟。添加220μL EXT溶液。颠倒数次直至混匀，10,000×g离心5分钟。转移上清至新的1.5mL EP管中，添加220μL无水乙醇。颠倒数次直至混匀。将DNA离心柱装入2mL收集管中，将样品全部转移到DNA离心柱中，10,000×g离心1分钟。弃离心废液，将DNA离心柱重新装入2mL收集管中。添加500μLPD溶液，10,000×g离心1分钟，弃废液，将DNA离心柱重新装入2mL收集管中。添加600μL PW溶液，10,000×g离心1分钟，弃废液。将DNA离心柱重新装入2mL收集管中，重复这一步骤。12,000rpm离心2分钟。将DNA离心柱重新装入干净的1.5mL EP管中，室温晾干5分钟。添加50-100μL ElutionBuffer或水至DNA离心柱中。室温静置3～5分钟。12,000rpm离心2分钟，收集基因组DNA。
DNA放置-20℃储存。通用引物ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC。提取的DNA样品适量稀释后作为PCR模板，以擎科1×TSE101金牌mix进行扩增。用ContigExpress拼接测序结果，并去除两端不准的部分。将拼接好的序列在NCBI数据库(blast.ncbi.nlm.nih.gov)中进行比对，鉴定结果为胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)。
本发明中胶红酵母的核苷酸序列(Seq_1)为：
GGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGAATATAGGACGTCCAACTTAACTTGGAGTCCGAACTCTCACTTTCTAACCCTGTGCACTTGTTTGGGATAGTAACTCTCGCAAGAGAGCGAACTCCTATTCACTTATAAACACAAAGTCTATGAATGTATTAAATTTTATAACAAAATAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCATGGTATTC CGTGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAATACTTCAACCCTCCTCTTTCTTAATGATTGAAGAGGTGTTTGGTTTCTGAGCGCTGCTGGCCTTTACGGTCTAGCTCGTTCGTAATGCATTAGCATCCGCAATCGAACTTCGGATTGACTTGGCGTAATAGACTATTCGCTGAGGAATTCTAGTCTTCGGACTAGAGCCGGGTTGGGTTAAAGGAAGCTTCTAATCAGAATGTCTACATTTTAAGATTAGATCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAA
实施例3：胶红酵母抗胁迫能力测定
将冻存在-80℃的2mL菌液，倒入100mLYPD液体培养基中(2％大豆蛋白胨，2％葡萄糖，1％酵母粉，调节pH＝7)，30℃摇床120rpm培养48h，随后将培养好的菌液按照2％的比例接入到100mL新鲜YPD液体中，30℃摇床120rpm培养至OD 600＝0.7，视为完成活化。
将活化的菌株以2％接种量分批接种到含0％、4％、8％、12％、16％、20％NaCl(w/w)的YPD液体培养基；pH为3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7的YPD液体培养基；以及乙醇含量(w/w)为0％、2％、4％、6％、8％的YPD液体培养基。及30℃培养120h，培养液离心收集菌体，55℃烘箱烘干24h至恒重，用干重反映生物量。
测定结果如图2，考虑到胶红酵母在酱油发酵中需要发挥实际作用，因此选取生物量大于0.01g/L为阈值评估胶红酵母抗胁迫能力。
发现NaCl、pH和乙醇的耐受极限阈值分别为20％(w/w)、3.5和8％(w/w)。
实施例4：胶红酵母产脂香效果和产脂之后的增质因子
将冻存在-80℃的2mL菌液，倒入100mLYPD液体培养基中，30℃摇床120rpm培养48h，随后将培养好的菌液按照2％的比例接入到100mL新鲜YPD液体中，30℃摇床120rpm培养至OD600＝0.7，视为完成活化。将活化的菌株以2％(v/v)接种量接种到酱醪培养基中(大曲：20％盐水＝1：2.5w/w)，30℃培养15天。
对照组一添加相同质量的鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号CICC 1379)；
对照组二添加相同质量的标准保藏菌株胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa，CICC 33374，中国工业微生物菌种保藏管理中心)，其它工艺与上述步骤相同。
参照GB/T 18186-2000，制定了感官评价表。然后选择了10名训练有素的小组成员来评估发酵液的风味香气。并且团队成员在正式的感官评估之前接受了几次训练，训练包括定义和描述。取混合均匀的适量试样置于直径60～90mm的白色瓷盘中闻其气味(感官强度由弱到强评分1～10)。
感官数据如表1所示，该发明胶红酵母发酵液综合脂香和特征脂香感知强烈。而酱油常见酵母和标准保藏的胶红酵母脂香轻微，甚至特征脂香不易察觉，易于酸败。
表1发酵液脂香风味感官强度
β-葡聚糖含量测定：发酵液板框挤压过滤3次，取10000×g上清液冻干后采用盐酸水溶液溶解，在经高压锅灭菌121℃水解60min，使用氢氧化钠调节pH值为中性，采用衍生化方法在70℃水浴衍生反应60min，使用三氯甲烷洗涤4次。色谱柱型号为C18(250mm×4.6mm,5μm)，流动相比例为0.1mol/L乙酸铵(pH值＝5.5)：乙腈＝75：25，流速为1.0mL/min，波长为250nm，柱温值35℃，进样体积为10.0μL，等度洗脱。100mg/L的β-葡聚糖标准工作溶液为外标，计算含量以干物质量计。
甘露聚糖含量测定(HPLC进行定量分析)：发酵液板框挤压过滤3次，取10000×g上清液冻干后碱水解1h，用盐酸调节pH至中性，再用PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)试剂进行柱前衍生，用HPLC分析，参照标样为D-甘露糖。色谱条件为：色谱柱：Agilent EclipseXDB-C18柱；流动相：乙睛-0.02moL/L的乙酸铵溶液(20:80)；流速:1.0mL/min；柱温：30℃，检测波长：250nm。计算含量以发酵液体计。
检查结果如表2所示：胶红酵母发酵液中的β-葡聚糖、甘露聚糖含量都比酱油发酵常用酵母以及标准保藏显著多，因此该发明胶红酵母发酵液有着更强的乳化能力，这可以弥补胶红酵母高产脂后酱油质地不均的问题。
表2发酵液乳化剂含量
胶红酵母漆酶的酶活测定：以3-乙基-2-亚硝基亚胺-2,3(2H)苯噻唑(ABTS)为底物，构建3.0mL反应体系，包括2.0mL柠檬酸/磷酸氢二钠缓冲液(0.2mol/L，pH 4.5)，0.1mL酶液和0.9mL 1.0mmol/LABTS。在25℃条件下，测定反应前3min内OD 420的增加量。定义1个酶活力单位(U)为每分钟氧化1μmolABTS所需的酶量。以灭活的发酵液为空白(扣减误差)，平行测定3次，取平均值。
表3发酵液漆酶的酶活
如表3所示，该发明胶红酵母产油酶能力分别比传统酵母和标准胶红酵母高出14、6.32倍，说明其抗酚类组分氧化的护色能力更强。
实施例5：胶红酵母在酿造酱油中增香、护色的应用
将大豆浸泡4h后与炒小麦一起进行高压蒸汽灭菌，连续通蒸汽10min，然后保持高压(0.8MPa)20min。待温度降至37℃后，在原料中添加0.3％的种曲，30℃培养。第8h、12h进行翻曲，36h后制成大曲。将大曲和18％(w/w)NaCl溶液按1:2.5质量比混合，开始盐水发酵。15℃发酵30天，随后升温至30℃发酵30天，补充发酵原料0.5％质量比的胶红酵母，保温发酵120天。
以板框压榨过滤法滤出生酱油。
对照组一添加相同质量的鲁氏接合酵母(同实施例4)；对照组二添加相同质量的标准保藏菌株胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa，CICC 33374，中国工业微生物菌种保藏管理中心)，其它工艺与上述步骤相同。
利用顶空固相微萃取和气相色谱质谱联用仪检测实验组和对照组的挥发性风味物质。取发酵后样品3mL置于顶空瓶中,并加入20ppm 2-辛醇标准品30uL。密封顶空瓶后在加热磁力搅拌器上，60℃水浴平衡20min。平衡后，取头顶空萃取30min，温度为60℃，GC-MS进样250℃解吸15min。GC条件：起始温度为40℃保持3min，以4℃/min上升到150℃保持1min,再以8℃/min上升到250℃保持6min。以氦气为载气，进样口温度为250℃，进样时间1min。MS条件：离子源温度200℃，接口温度220℃，溶剂延迟时间1.5min,电离方式为EI，70eV扫描质量范围为33～500m/z，扫描速率为3.00s cans/s。根据NIST11数据库检索选取相似度≥90％的化合物，并结合离子碎片及保留指数进行定性。以2-辛醇为内标物质,采用内标法进行定量。每组三次平行，筛选差异显著的风味物质并，参考Flavornet数据库(http://flavornet.org/flavornet.html)和标准品，筛选出差异显著的脂香类物质。
参照GB/T 18186-2000，制定了酿造酱油感官评价表。然后选择了10名训练有素的小组成员来评估酱油样本的风味、色泽和质地。并且团队成员在正式的感官评估之前接受了几次训练，训练包括定义和描述。取混合均匀的适量试样置于直径60～90mm的白色瓷盘中，在自然光线下观察色泽和质地，闻其气味(感官强度由弱到强评分1～10)。
表4酱油脂香差异性风味组分
酱油脂香差异性风味组分如表4所示，与对照组一相比，该发明胶红酵母GT_317参与发酵的酱油中的脂香类物质显著提升。并且胶红酵母GT_317在高产脂后并不会导致酱油出现油水分层等质地问题，反而粘稠、挂壁效果更佳，酱油整体更厚重(如图3所示)，这与胶红酵母高产β-葡聚糖、甘露聚糖等兼具乳化剂和黏着剂效果的大分子糖类物质一致(如实施例4)。并且胶红酵母GT_317比标准株胶红酵母CICC 33374具有更强的产脂、产香优势。
酱油色泽、质地如图3所示，胶红酵母GT_317漆酶能去除酱油因多酚氧化导致的色泽变异，使酱油颜色更为稳定，但其它酵母组酱油易于氧化而呈色黝黑；另外，酱油发酵的低pH环境可促进胶红酵母GT_317与大分子难降解渣物发生强静电互作，渣物疏水性增强，便于澄清酱油滤除，防止渣物沉积干预酱油颜色。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的范围当中。

Claims (8)

1.胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)GT_317，于2022年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20222012，保藏地址为中国·武汉·武汉大学。
2.如权利要求1所述的胶红酵母，其特征在于：所述胶红酵母在20％NaCl w/w、pH＝3.5、8％乙醇w/w环境中生长，抗胁迫能力强。
3.权利要求1或2所述的胶红酵母在制备酱油中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述胶红酵母高产具有脂香的不饱和脂肪酸及其脂类衍生物。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述具有脂香的不饱和脂肪酸及其脂类衍生物，包括亚油酸、亚麻酸、亚油酸甲酯、亚油酸乙酯和硬脂酸甲酯。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述胶红酵母促进酱油发酵产脂后的乳化、厚重效果。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述胶红酵母在酱油颜色形成后发挥固色、澄清的效果。
8.权利要求1或2所述的胶红酵母在促进酱油增脂、增香中的应用。
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