CN117683664A - 一种产香细菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株产香细菌及其应用，其中产香细菌经鉴定为奥莱龙海氏菌(Heyndrickxia oleronia)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2023年10月25日，保藏编号为CGMCC 28772，命名为SQJ6。本发明提供的产香菌SQJ6可发酵产生3‑乙基‑2,5‑二甲基吡嗪、异戊酸乙酯、2‑甲基丁酸乙酯、6‑乙基‑2,3,5‑三甲基吡嗪、苯乙酸乙酯等挥发性风味物质。该菌株可用于酒精发酵阶段的强化发酵，强化后不影响食醋主要产酸菌种巴氏醋杆菌的发酵产酸，可提升最终食醋产品的醇类、酯类、醛类和吡嗪类挥发性风味成分的含量，可作为食醋增香发酵菌种，提高食醋品质。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，尤其涉及一种产香细菌及其应用。
背景技术
食醋是重要的酸味调味品。食醋品质的优劣除了主体酸味外，食醋的香气是决定食醋品质的重要因素之一。在食醋的风味轮廓描述包括酸气、甜香、焦香、酱香、果香、麸皮香、烟熏香、米香、酒香、花香，不同香气风味的强弱组成后赋予食醋标识性特征风味。对于食醋的甜香、果香、花香等的产生，主要依赖微生物的发酵，特别是产挥发性物质的微生物。
而现在市售的食醋产品除咸味和甜味的差别，风味同质化严重，具有特征性风味的食醋产品较少，并且通过食用香精调配的食醋难以让消费者放心食用，通过产特征香气微生物强化后发酵，在不影响酸味的基础上，可赋予食醋特征香气，提高食醋品质。
奥莱龙海氏菌(Heyndrickxia oleronia)所属物种最早由Kuhnigk在1996年分离自法国奥莱龙岛上的白蚁肠道，最初该物种被命名为蔬菜芽孢杆菌(Bacillusoleronius)。2020年Gupta基于基因学的分类研究中重新整理的了芽孢杆菌属菌株的分类，并将该种重新划分，命名为奥莱龙海氏菌(Heyndrickxia oleronia)。奥莱龙海氏菌(Heyndrickxia oleronia)部分菌株被报道具有降解多糖、纤维素、蛋白质、植物源酚酸类等物质的能力，可作为菌肥(专利号CN116063128A)，果蔬废水和尾菜废水处理的发酵菌剂(专利号CN114350556A、CN114540219A、CN114606154A)，还可以应用于烟叶的发酵，提高烟叶品质(专利号CN115838663A)。但该物种菌株在产香和增加发酵食品香气的作用和应用还未有报道。
发明内容
发明目的：为了解决上述技术问题，本发明旨在提供一种产香细菌，其产香和耐受乙醇、乙酸性能优良。
本发明还提供了产香细菌的应用，应用于香料生产和发酵食醋的增香。
技术方案：为了实现上述目的，本发明提供一种产香细菌，经鉴定为奥莱龙海氏菌(Heyndrickxia oleronia)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2023年10月25日，保藏编号为CGMCC 28772，命名为SQJ6。
本发明所述产香菌SQJ6，分离自中国传统食醋发酵醋醅，菌落呈肉色、湿润、不规则状；革兰氏阳性，好氧生长，产芽孢。
进一步地，所述产香细菌的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明所述的产香细菌在香料生产中的应用。
其中，所述香料包括3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、异戊酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、6-乙基-2,3,5-三甲基吡嗪、苯乙酸乙酯。
本发明所述产香细菌在食醋增香中的应用。
其中，所述的产香菌SQJ6在固态发酵食醋中的应用。
进一步地，所述产香细菌在食醋发酵的酒精发酵阶段强化发酵，提升食醋产品的挥发性风味成分的含量。
进一步地，所述酒精发酵阶段拌入安琪酵母黄酒曲和奥莱龙海氏菌SQJ6培养液，再进行上述醋酸发酵。
进一步地，所述产香菌SQJ6在增加食醋中2-甲氧基-5-甲基苯酚、三甲基吡嗪、四甲基吡嗪中任意一种或几种挥发性风味物质总量中的应用。
进一步地，所述产香菌SQJ6在增加食醋中醇类、酯类或醛类中任意一种或几种挥发性风味物质总量中的应用。
进一步地，所述醇类为异丁醇、苯乙醇、2,3-丁二醇中的任意一种或几种。
进一步地，所述酯类为乙酸异戊酯、2-甲基丁酸乙酯、异戊酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸己酯、辛酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸异辛酯、壬酸乙酯、棕榈酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸乙酯、γ-壬内酯中的任意一种或几种。
进一步地，所述醛类为3-羟基-2-丁酮、异戊醛、异佛尔酮、糠醛、苯乙醛、3,4-二甲基苯甲醛中的任意一种或几种。
进一步地，产香微生物的分离与筛选步骤如下：
将镇江香醋醋醅进行常规梯度稀释，稀释液涂布于GYE固体培养基，30℃培养48h后，挑取单菌落结合划线分离方法在GYE固体培养基中纯化3次，以获得纯培养。将分离的纯菌株接种GYE固体平板，并用封口膜将培养皿封口，30℃培养48h，通过嗅闻法对培养物产生气味作为初筛。以液体发酵液气味，使用嗅闻法复筛。综合气味特征、有无杂味、气味强度，从30株初赛菌株中获得产香效果最好的菌株SQJ6。
其中，所述GYE培养基成分为：葡萄糖2％，酵母粉1％，琼脂粉2％，乙醇3％灭菌后加入。
进一步地，本发明所提供的菌株SQJ6使用细菌通用引物27F和1492R进行PCR扩增，测序后获得长度为1411bp的16S rRNA基因序列，序列提交Ezbiocloud的16S数据库比对，提示菌株SQJ6与Heyndrickxia oleronia DSM 9356的16S rDNA基因相似性为98.93％，因此菌株SQJ6分类命名为奥莱龙海氏菌(Heyndrickxia oleronia)。
进一步地，本发明所提供的菌株SQJ6，不能产酸，无产胞外蛋白酶和纤维素酶的能力，具有产胞外酯酶和淀粉酶的能力。菌株SQJ6，可在10g/100mL以内的乙酸中微弱生长，且具有良好的乙醇耐受性，在6％(v/v)以内的乙醇含量中优良生长，最适乙醇浓度为2％(v/v)。
进一步地，本发明所提供的菌株SQJ6可在GYE固体和液体培养下，产生浓郁的果香味且无其他不愉快气味，通过固相微萃取结合GC-MS鉴定GYE培养基48h发酵液主要产生的挥发性香味物质为3-乙基-2,5-二甲基吡嗪(7.52g/L)、异戊酸乙酯(4.46g/L)、2-甲基丁酸乙酯(2.72g/L)、6-乙基-2,3,5-三甲基吡嗪(2.00g/L)、苯乙酸乙酯(0.54g/L)。菌株SQJ6的产香性质表明其具有生产香原料的开发潜力。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
本发明提供的分离自发酵食醋醋醅的产香奥莱龙海氏菌，在培养液中能够发酵产生浓郁的水果味，主要挥发性成分为3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、异戊酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、6-乙基-2,3,5-三甲基吡嗪、苯乙酸乙酯，为香料生产提供一种微生物资源。
将本发明提供的奥莱龙海氏菌SQJ6用于食醋生产的酒精发酵阶段的强化发酵，以提升发酵食醋的香气。强化后不影响食醋主要产酸菌种巴氏醋杆菌的发酵产酸，可提升最终食醋产品的醇类、酯类、醛类和其他类挥发性风味成分的含量，尤其是可产生具有果香味的酯类和焙烤香气的吡嗪类物质。该菌株可作为食醋增香发酵菌种，应用于食醋的发酵生产，提高食醋品质。
附图说明
图1为本发明奥莱龙海氏菌SQJ6菌落形态与菌体形态图；其中(a)为菌株在含CaCO3的GYE固体培养基上的菌落形态图，(b)为菌体经革兰氏染色后的镜检图；
图2为本发明奥莱龙海氏菌SQJ6的16S rDNA基因与相近菌株的系统发育树图；
图3为本发明奥莱龙海氏菌SQJ6在不同乙酸(a)和乙醇(b)含量下生长浊度图；
图4为本发明奥莱龙海氏菌SQJ6的发酵液GC-MS检测结果图；
图5为本发明奥莱龙海氏菌SQJ6强化食醋发酵总酸变化图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
实施例1
菌株的筛选与鉴定
从镇江市收集的镇江香醋醋醅中，经过无菌水梯度稀释后，涂布于GYE固体培养基(葡萄糖2％，酵母粉1％，琼脂粉2％，乙醇3％灭菌后加入)，30℃培养48h。待菌落长出后，挑取单菌落在GYE固体培养基上划线纯化，纯化3次以获得纯培养。
将培养48h的菌落平板，在超净工作台中采用直接嗅闻培养物气味作为初筛。初筛后选取30株菌株进行复筛。复筛采用GYE液体培养基(葡萄糖2％，酵母粉1％，乙醇3％灭菌后加入)培养的方式，选择生长状态良好的菌株，通过嗅闻发酵液的气味筛选。在复筛中部分菌株发酵液气味很弱，部分菌株发酵液有明显杂味，最终，选择发酵液气味呈水果味、无杂味且香气最浓郁的菌株命名为SQJ6为后续研究对象。
菌株SQJ6在GYE培养基上菌落形态呈肉色、湿润、不规则状，如图1(a)所示；将目标菌菌体进行革兰氏染色显微观察，SQJ6菌体细胞呈长杆状，能产生芽孢，革兰氏染色阳性，如图1(b)所示。
菌株SQJ6的鉴定采用16S rDNA快速鉴定，具体的，取适量菌体加入到50μl无菌纯水中在PCR仪上100℃加热10min后上清液作为模板，使用细菌通用引物27F和1492R进行PCR扩增。PCR扩增体系为模板DNA 1μL、引物各1μL、2*PCR HeroTM Mix(dye)(Foregene公司)12.5μL、ddH2O 9.5μL。PCR扩增程序为预变性95℃ 5min，变性95℃ 20s、退火55℃ 20s、延伸72℃ 40s，30次循环，后延伸72℃ 5min。PCR扩增产物送至进金唯智生物科技公司测序，扩增菌株SQJ6的16S rDNA片段，所得长度为1411bp，基因序列如SEQ ID No.1所示。测序序列提交Ezbiocloud的16S数据库比对，并与相似菌株的16S rDNA基因使用MEGA绘制系统发育树。
菌株SQJ6的16S rDNA鉴定结果显示其与Heyndrickxia oleronia DSM 9356的16SrDNA基因相似性为98.93％，结合生理生化特性，鉴定菌株SQJ6为奥莱龙海氏菌(Heyndrickxia oleronia)。图2为本发明菌株SQJ6与其相近菌株的16S rDNA基因的进化树图。将该菌株于2023年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC28772，其分类命名为奥莱龙海氏菌(Heyndrickxia oleronia)，菌株名SQJ6。
实施例2
奥莱龙海氏菌SQJ6的产酶特性与耐受性
将奥莱龙海氏菌SQJ6经GYE液体培养基培养至对数期，吸取5μL菌液点接种于下述固体培养基平板，通过是否产生透明圈，以初步评估其是否具有产酸、产蛋白酶、产淀粉酶、产纤维素酶、产酯酶的性质。
其中，检测产酸能力培养基为GYE加CaCO3固体培养基(葡萄糖2％，酵母粉1％，琼脂粉2％，乙醇3％灭菌后加入，CaCO3 1％)；检测产蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和酯酶能力培养基分别为0.5％脱脂奶粉、0.5％可溶性淀粉、0.5％羧甲基纤维素钠、0.2％三丁酸甘油酯分别加入到基础培养基(葡萄糖1％，酵母粉0.5％，琼脂粉2％)，产蛋白酶和产酯酶通过直接观察平板有无透明圈，产淀粉酶能力在菌体培养72h后加入碘液，观察有无透明圈，产纤维素酶能力在菌体培养72h后加入1mg/mL的刚果红溶液染色10-15min，再加1mol/L NaCl15min，倒掉洗液，观察平板产透明圈情况。实验结果表明奥莱龙海氏菌SQJ6不能水解脱脂奶粉和纤维素，可以水解三丁酸甘油酯和淀粉，因此该菌株无产胞外蛋白酶和纤维素酶的能力，具有产胞外酯酶和淀粉酶的能力。
奥莱龙海氏菌SQJ6经GYE液体培养培养至对数期，以体积比1％的接种量分别接种于含0、1、2、4、6、8、10g/100mL乙酸的基础培养基(葡萄糖1％，酵母粉0.5％)。同样的，以1％的接种量分别接种于含0、2、4、6、8、10、12％(v/v)乙醇的基础培养基(葡萄糖1％，酵母粉0.5％)，30℃培养48h通过测定培养液的OD600吸光度值，以初步评估其对乙酸和乙醇的耐受性。
奥莱龙海氏菌SQJ6的耐酸性如图3(a)显示，在乙酸量为0g/100mL的基础培养基中长势最好，在乙酸量为2-10g/100mL的基础培养基中可以微弱生长，且转接至不含乙酸的GYE培养基后，传代菌株仍可良好生长。奥莱龙海氏菌SQJ6的乙醇耐受性如图3(b)显示，菌株在2％的乙醇含量下长势最好，在0-6％的乙醇含量下均可良好生长，在8％以上的乙醇培养基中无生长。因此，奥莱龙海氏菌SQJ6可以在10g/100mL以内的乙酸中微弱生长，可耐受的乙醇含量为0-6％。
实施例3
菌株SQJ6产挥发性香味物质的分析
将培养至对数期的奥莱龙海氏菌SQJ6以体积比1％接种量，接种于GYE液体培养基，在30℃ 180rpm/min培养48h后，测定发酵液的挥发性风味物质，每个样品做3个平行。
取6mL发酵液，加入2.5g氯化钠，10μL 2-辛醇内标(25mg/L)至20mL的顶空瓶中待测。放入转子后拧紧盖子并放入55℃带有磁力搅拌器的恒温水浴锅中。使用50/30um DVB/CAR/PDMS萃取纤维头(美国Supelco公司)萃取挥发性成分40min，萃取结束后在ISQ单四级杆气质联用仪的进样口中于250℃的条件下解吸5min。
使用气相色谱质谱联用仪(美国Agilent科技有限公司，6890N-5975B)，色谱柱DB-WAX(30m×0.25mm×0.25um)，进样口温度220℃，载气He流速1mL/min，条件：起始温度40℃，以4℃/min升到150℃，然后以8℃/min升到250℃保持6min，分流进样，分流比为5。MS条件：接口温度220℃，离子源温度230℃，数据采集模式全扫描，电子能量70eV，质量扫描范围mlz35～500。
发酵液和灭菌的空白培养基经GC-MS检测后，可见明显化合物峰结果如图4所示，对比培养前后挥发性物质变化，可获得菌株SQJ6经培养48h可产生主要5种挥发性化合物，按照出峰顺序依次为2-甲基丁酸乙酯、异戊酸乙酯、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、6-乙基-2,3,5-三甲基吡嗪、苯乙酸乙酯，详细信息如表1所示，菌株SQJ6的产香性质表明其具有生产香原料的开发潜力。
表1奥莱龙海氏菌SQJ6发酵液中挥发性成分详细信息
实施例4
产香菌株SQJ6在固态发酵食醋中的应用
1、食醋发酵
对照组A：香醋酿造的工艺借鉴镇江香醋传统酿造工艺略有改动。具体如下：酒精发酵：称取1kg糯米，将糯米淘洗干净，浸泡12h，使用蒸饭机将糯米蒸熟，冷水冲淋至糯米温度在40℃左右时，拌入市售安琪黄酒曲6g，撘窝制酒。发酵后24小时加水2kg，搅拌均匀后继续发酵4d。测量发酵液酒精度，将酒精度稀释至9％(v/v)得到稀释后的酒醪液用于投入醋酸发酵。
醋酸发酵：容积为2L的塑料桶中称取240g麸皮，112.8g米糠，加入600mL上述稀释后的酒醪液，搅拌混匀，即制得醋醅。将培养到对数期的巴氏醋杆菌沪酿1.01(购于CICC，编号为CICC 20001)菌液(GYE液体培养基)以体积比1％接种量，点接种于新鲜醋醅中，每日翻醅1次，至总酸度不再上升，加盐将醋醅压实，盖上塑料薄膜封醅7d。封醅结束后淋醋，储存。
实验组B：按照对照组A的食醋发酵方法，在酒精发酵阶段拌入安琪黄酒曲同时以体积比0.5％的接种量接种奥莱龙海氏菌SQJ6对数期活化培养液，再进行上述醋酸发酵。
实验组C：按照对照组A的食醋发酵方法，在上述醋酸发酵阶段接种巴氏醋杆菌沪酿1.01同时以体积比0.5％的接种量接种奥莱龙海氏菌SQJ6对数期活化培养液，进行发酵。
在对照组A、实验组B、实验组C醋酸发酵阶段，每日取卤汁测定总酸度(具体步骤参考GB/T 5009.41-2003《食醋卫生标准的分析方法》)，对发酵结束淋出醋，使用固相微萃取和气质联用技术(方法同实施例3)测定其挥发性风味物质，每个样品做三次平行。
三组醋酸发酵过程总酸含量如图5所示，三组发酵食醋总酸度都随发酵时间增加而升高，在发酵1-4d酸度增速较快，发酵5-6d酸度基本保持不变，最终酸度分别为A组5.89g/100mL，B组5.86g/100mL，C组5.86g/100mL，可见奥莱龙海氏菌SQJ6在酒精发酵阶段和醋酸发酵阶段强化发酵均不影响终产品酸度。
使用奥莱龙海氏菌SQJ6强化发酵后的食醋挥发性风味成分如表2所示，三组中实验组B所含有的挥发性风味成分种类最多，总量也最多。实验组B即酒精阶段强化组与未强化的对照组A相比，可增加食醋中醇类(提高13.1％)、酯类(提高42.3％)、醛类(提高10.3％)和其他类(提高8.6％)挥发性风味物质总量，其中酯类物质增加最为显著，具体的乙酸异戊酯、2-甲基丁酸乙酯、异戊酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸己酯、辛酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸异辛酯、壬酸乙酯、棕榈酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸乙酯、γ-壬内酯含量增加。奥莱龙海氏菌SQJ6在发酵液中产的2-甲基丁酸乙酯、异戊酸乙酯、苯乙酸乙酯在实验组B中被检测到，并且对比对照组含量显著提高，奥莱龙海氏菌SQJ6在发酵液中产的3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、6-乙基-2,3,5-三甲基吡嗪在实验组B中未被检测到，但在实验组B检测到少量的三甲基吡嗪(含量0.0003g/L)和四甲基吡嗪(含量0.0219g/L)。实验组B与对照组A相比检测到的酸类物质总量略有减少(A组9.4541mg/L，B组8.8889mg/L，但几乎不影响)，具体的乙酸、正戊酸、己酸、辛酸、庚酸、2-庚烯酸含量减少，异戊酸、异丁酸、壬酸含量增加。
而实验组C即醋酸发酵阶段强化组对比对照组各挥发性组分含量变化不大，或降低，整体强化后增香效果不明显。因此，奥莱龙海氏菌SQJ6可用于发酵食醋的增香，并且效果显著，且优选的在酒精发酵阶段进行接种强化。
表2奥莱龙海氏菌SQJ6强化发酵食醋的挥发性风味成分
Claims (10)
1.一种产香细菌，经鉴定为奥莱龙海氏菌(Heyndrickxia oleronia)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2023年10月25日，保藏编号为CGMCC28772，命名为SQJ6。
2.一种权利要求1所述的产香细菌在香料生产中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述香料包括3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、异戊酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、6-乙基-2,3,5-三甲基吡嗪、苯乙酸乙酯。
4.一种权利要求1所述的产香细菌在食醋增香中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的产香细菌在固态发酵食醋增香中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述产香细菌在食醋发酵的酒精发酵阶段强化发酵，提升食醋产品的挥发性风味成分的含量。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述酒精发酵阶段拌入安琪酵母黄酒曲和奥莱龙海氏菌SQJ6培养液，再进行醋酸发酵。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述产香细菌在增加食醋中醇类、酯类或醛类中任意一种或几种挥发性风味物质总量中的应用。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述醇类为异丁醇、苯乙醇、2,3-丁二醇中的任意一种或几种。
10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述酯类为乙酸异戊酯、2-甲基丁酸乙酯、异戊酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸己酯、辛酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸异辛酯、壬酸乙酯、棕榈酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸乙酯、γ-壬内酯中的任意一种或几种；所述醛类为3-羟基-2-丁酮、异戊醛、异佛尔酮、糠醛、苯乙醛、3,4-二甲基苯甲醛中的任意一种或几种。
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2023
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