CN110408554B - 一株耐热接合酵母fw60-5及其应用 - Google Patents

一株耐热接合酵母fw60-5及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一株接合酵母FW60‑5及其应用，涉及微生物技术领域。本发明的接合酵母Zygosaccharomyces sp FW60‑5，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510075，保藏编号为GDMCC No：60647。本发明的Zygosaccharomyces sp FW60‑5可以耐受42℃高温，可以在酱油发酵体系中正常生长代谢，合成大量苯乙醇、丁醇、乙醇、2,3‑丁二醇等香气物质，并抑制乙酸、异丁酸、4‑甲基戊酸等有机酸的产生。本发明还涉及风味基料的制备工艺，其在酱油、发酵酱和复合调味料中的应用可以有效改善产品香气和口感，显著提升产品品质。

Description

一株耐热接合酵母FW60-5及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一株耐热接合酵母FW60-5及其应用。
背景技术
发酵调味品是人们日常生活中必备的食品，对食物色香味的形成有不可或缺的作用。随着生活水平的提高，调味品的消费量日益增长，人们对其品质的要求也逐步提高。采用玻璃纤维大罐工艺极大地提高了各大酱油厂的产能，但是也在一定程度上降低了酱油等发酵调味品的品质，出现香气不足或者烹饪过程香气损失严重等问题。对此，人们展开了系列研究，以期从发酵工艺、多菌种混合发酵等方面着手，改善上述问题。中国发明专利ZL200710026423.0公开了一种通过低盐滤液淋入高盐发酵体系提高低盐酱油风味的方法；中国发明专利申请CN105901656A公开了一种米曲霉、甘蔗曲霉、红曲霉联合制曲，在发酵阶段添加乳酸菌、球拟酵母和鲁氏酵母提高酱油风味的方法。然而，生产工艺的变革往往同步增加了设备需求和操作难度，导致生产成本提高，推行难度大；多菌种制曲或者发酵技术也存在本底微生物干扰和批次稳定性差等问题。
近年来，采用生物强化技术在酱油发酵阶段添加耐盐产香酵母，有针对性地提高酱油中挥发性风味成分的含量成为了研究重点。中国发明专利ZL201510849370.7公开了一株异常威克汉姆酵，其可以大量合成乙酸乙酯，并可在酱油、醋、发酵酒生产中应用；中国发明专利申请CN108018218A公开了一株异常威克汉姆酵母Wickerhamomyces anomalusY3604，其可用于酱油发酵，能大量合成乙酸乙酯；中国发明专利申请CN108315271A公开了一株酵母Saccharomyces sp.ZB118，其用于酿造酱油等发酵型调味品，可以产生大量醇类、酯类等小分子物质和4-乙烯基-2-甲氧基苯酚等特征酚类香气物质。生物强化技术在提高酱油风味品质方面具有针对性强、工艺变动小、可控性高等技术优势。但是，目前已经在酱油发酵过程中实际应用的产香酵母菌株并不多，主要原因有：一、目前已经筛选到的可以在酱油发酵醪中正常生长代谢并产生香气物质的菌株较少，可供生产应用选择的菌株远远不够；二、对已分离的菌株基础研究不足，并未充分掌握这些微生物的生长代谢规律以及发酵调控方法，导致应用效果欠佳。
因此，有必要深入分离筛选发酵调味品生产过程中的微生物，研究其生长代谢规律，特别是风味化合物的代谢规律，为大罐发酵酱油等调味品的品质提升，以及新型风味调味品的开发提供技术支撑。
发明内容
基于此，有必要针对现有产香酵母菌株数量少、耐热性差的问题，提供一株耐热接合酵母Zygosaccharomyces sp FW60-5，能够在高盐环境中合成代谢苯乙醇、丁醇、乙醇、2,3-丁二醇等挥发性风味物质，同时抑制乙酸、异丁酸、4-甲基戊酸等有机酸的产生，耐受42℃高温，能够在高温高盐发酵醪中正常生长，不需要额外添加营养源，能够利用酱醪中本源的前体物质代谢合成多种挥发性风味物质，不产生不良气味，以改善酱油或发酵酱风味口感。
一株耐热接合酵母Zygosaccharomyces sp FW60-5，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510075，保藏编号为GDMCC No：60647。
上述耐热接合酵母菌株FW60-5，是从李锦记(新会)食品有限公司发酵酱醪中筛选和分离鉴定获得。根据细胞形态，生理生化特征和18S ITS rDNA测序等实验数据综合分析，该菌株被鉴定为Zygosaccharomyces sp.。
本发明一方面还提供一种上述耐热接合酵母FW60-5在食品发酵中的应用。该菌株来源于传统食品发酵体系，属于传统上用于食品生产加工的菌种，具有较高的安全性。
在其中一个实施例中，所述食品包括：酱油、发酵酱、复合调味料。
本发明一方面还提供一种发酵菌剂，所述发酵菌剂包含上述的耐热接合酵母菌株FW60-5。
本发明一方面还提供一种耐热接合酵母FW60-5种子培养液，通过以下方法制备得到：
将上述耐热接合酵母FW60-5接种至麦芽培养基进行培养，培养温度为22～32℃，培养时间为24～60h。优选地，取1～2环上述接合酵母FW60-5斜面菌种接种至麦芽培养基进行培养。本发明的耐热接合酵母FW60-5适宜生长的温度范围相对较宽，承受环境变化能力强，在相对较低的温度如22～24℃下依然能保持良好的生长和增值速率。本发明的耐热接合酵母FW60-5生长速率较快，在上述生长环境下，培养24～60h即可增殖至较大数量，若生产需要，培养时间可以缩短至24～35h，而且本发明的耐热接合酵母FW60-5用于制备风味基料时，制备时间也能相对缩短，可以减少生产的时间成本。
在其中一个实施例中，所述麦芽汁培养基包括以下质量百分含量的原料：10％～20％氯化钠，3％～6％麦芽浸粉；0.5％～1.5％酵母抽提物，余量为水，pH为5～6。上述菌株可以在含5％～20％氯化钠麦芽汁培养基中正常生长，氯化钠浓度为10％～15％，更优选地，氯化钠浓度为15％，采用发酵14天的酱油发酵醪液培养该株酵母，可得到高活力，菌体浓度107CFU/mL以上的菌种培养液。本发明的耐热接合酵母FW60-5适宜在pH值5～6的范围生长，若不在此范围不利于其细胞生长和产物代谢，对所应用到的产品的品质也有一定影响。
本发明一方面还提供一种风味基料，采用上述发酵菌剂制备得到。
本发明一方面还提供一种上述风味基料的制备方法，包括以下步骤：
制备酱油发酵液：以大豆和/或小麦为原料制曲，将得到的曲料加入盐水发酵，去除固体杂质，保留发酵醪下层液体，即得酱油发酵液；
制备风味基料：向酱油发酵液中加入苯丙氨酸和上述耐热接合酵母FW60-5种子培养液，苯丙氨酸的加入量为酱油发酵液质量的0.5％～2.5％，耐热接合酵母FW60-5种子培养液的接种量为酱油发酵液质量的1％～10％。
向酱油、发酵酱和复合调味料中添加一定比例的风味基料，可以显著提高产品中苯乙醇、丁醇、乙醇、2,3-丁二醇等挥发性风味物质的含量，大幅改善酱油、发酵酱和复合调味料的口感和风味。
本发明一方面还提供一种酱醪发酵方法，包括以下步骤：
预发酵：将曲料加入盐水进行预发酵，得到预发酵液；
发酵：向上述预发酵液中加入上述耐热接合酵母FW60-5种子培养液，发酵，即得酱醪。
在其中一个实施例中，所述预发酵步骤中，当进行酱油发酵时，所述曲料为大豆和/或小麦，所述预发酵时间为10～20天；当进行豆酱发酵时，所述曲料为大豆和面粉，或者为大豆和小麦粉，所述预发酵时间为7～15天；
所述发酵步骤中，所述耐热接合酵母FW60-5种子培养液的加入量为预发酵液质量的2％～5％；加入所述耐热接合酵母FW60-5种子液后10～30天内，每周复料1～2次，每次2～4h，控制发酵料品温为25～32℃，所述复料步骤具体为：将下层发酵液抽出均匀淋入上层发酵醪。
上述曲料中，大豆可以选择为原粒大豆或脱脂大豆，小麦可以选择为原粒小麦或小麦粉。脱脂大豆指原粒大豆经处理脱去油脂后的产品，小麦粉指原粒小麦直接粉碎后的产品，面粉指原粒小麦经研磨、去除或部分去除麸皮后的产品。
本发明的耐热接合酵母FW60-5易于培养，能耐受高盐高温环境，在发酵阶段应用能够显著提高酱醪中的苯乙醇等风味物质的含量，改善酱醪香气。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的耐热接合酵母Zygosaccharomyces sp FW60-5，能够耐受42℃高温，并能在高盐发酵醪中正常生长，该菌株可提高酱油或发酵酱中多种风味成分，如苯乙醇、丁醇、乙醇、2,3-丁二醇苯乙醇的含量；不需要额外添加营养源，能够利用酱醪中本源的前体物质代谢合成多种挥发性风味物质；且抑制酱醪乙酸、异丁酸、4-甲基戊酸等有机酸的产生，发酵过程不产生不良气味。可以通过制备风味基料，再添加酱油、发酵酱、复合调味料等调味品以改善其风味品质。本发明的产品具有较好的生产可操作性和经济效益。
附图说明
图1为实施例1中Zygosaccharomyces sp FW60-5分离筛选流程示意图；
图2为实施例1中Zygosaccharomyces sp FW60-5发酵风味成分GC-MS分析图；
其中，A为实验组；B为空白对照组；
图3为实施例1中Zygosaccharomyces sp FW60-5菌落及菌体形态图；
其中，A为菌落形态照片，B为菌体显微观察照片；
图4为实施例1中Zygosaccharomyces sp FW60-5耐盐性分析图；
图5为实施例1中Zygosaccharomyces sp FW60-5耐热性分析图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
以下实施例中所涉及百分含量均为质量百分含量wt％。
菌种保藏信息：
本发明提供的接合酵母菌株Zygosaccharomyces sp FW60-5，已于2019年4月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码：510075，保藏编号为GDMCC No：60647。
上述接合酵母菌株FW60-5，是从李锦记(新会)食品有限公司发酵酱醪中筛选和分离鉴定获得。根据细胞形态，生理生化特征和18S ITS rDNA测序等实验数据综合分析，该菌株被鉴定为Zygosaccharomyces sp。该菌株的菌落和菌体形态如附图1所示，其中A为菌落形态照片，B菌体显微观察照片，生理生化试验结果如表1所示。
表1生理生化试验结果
Figure BDA0002177214750000041
注：“+”为阳性；“－”为阴性；“w”为弱；“s”为慢；“nd”为未检测。
上述菌株的18S ITS rDNA序列如下所示：
TTCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAATCCTACCTGATTTGAGGTCAAACTTTGAGAATTTTGTCAAGCCAGACGCTGCCTGCTTCTTTTTAAAAAGCAAACCTCTTCACTTTCGCCGAGTCGGTAAAACCTAATACGACTATCGTGGCAAGGCGCCTCCCGCTTTCCCCTGCCACAACCCACAAGGGGAAGTAAGCAGAGGGCCGCAGGATTGGAAAGCAATGCTTCGCCTATGGCCTCCCATTTTCAAGCAAACTCCAGAGTAGAGTATCGCTCACTACCAAACATAAACATAAAAGCTATGTTTGAGAGGGAAATGACGCTCAAACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAAGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCACATTACGTATCGCAGTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGAATATTTTGTTTTAATTCGTTTTTGACTTTTTATAATTTCATAAAAATGTTGTTTGTGTTTACCTCTGGGGACAGACGCCTTTAAAAGCACTTCCCCAAAGAGAACAAAAAAGCAGAAACTCCACTGTGTGTATCAAAGGCGGAGGGTAAATCAAGCCGCGCAATTAAGCGCAGGCTCTCCCCCCCCCCAGCTCTTCGAGATTTTCATTTTCTATAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAA。
实施例1
接合酵母菌株FW60-5的筛选，如图1所示，包括以下筛选流程：
一、样品采集
取李锦记(新会)食品有限公司不同发酵阶段的酱油发酵醪。
二、耐盐酵母分离
取上述不同发酵阶段的酱油发酵醪，生理盐水梯度稀释10-2，10-3，10-4，10-5倍后涂布于酵母筛选平板，30℃静置培养72h，挑取单菌落进行进一步划线分离纯化。纯化后菌株接种麦芽汁培养基，30℃，150r/min振荡培养96h。
上述酵母筛选平板选用酵母分离平板，包含：5％麦芽浸粉，1％酵母抽提物，18％氯化钠，2％琼脂粉，pH 5～6。
上述麦芽汁培养基包含：5％麦芽浸粉，1％酵母抽提物，pH 5～6。
三、酵母产香性能初筛
取上述经纯化和培养后的菌株，进行香气鉴评。
香气鉴评方法：由10位在酱油风味鉴评方面具有丰富经验的技术人员，对不同生酱油样品进行盲评。主要评价香气可接受度和香气类型。
将具有令人愉悦的独特香气发酵液对应的酵母菌株命名为FW60-1，FW60-2，FW60-3，FW60-4，FW60-5，FW60-6，FW60-7，FW60-8，FW60-9，FW60-10，FW60-11，FW60-12，FW60-13，FW60-14，FW60-15，FW60-16，FW60-17，FW60-18，FW60-19。
四、酵母风味成分复筛
1、制备种子培养液
分别挑取FW60-1，FW60-2，FW60-3，FW60-4，FW60-5，FW60-6，FW60-7，FW60-8，FW60-9，FW60-10，FW60-11，FW60-12，FW60-13，FW60-14，FW60-15，FW60-16，FW60-17，FW60-18，FW60-19共19个菌株的单菌落接种于麦芽汁培养基，30℃，200r/min震荡培养48h，得到上述菌株的种子培养液。
上述麦芽汁培养基包含：5％麦芽浸粉，1％酵母抽提物，pH 5～6。
2、发酵
将种子培养液分别按5％接种到酱醪发酵液培养基，30℃，100r/min震荡培养14d(天)。
上述酱醪发酵液培养基的制备方法为，取发酵2周酱油发酵醪，200目纱网过滤，过滤清液5000r/min离心10min，上清液即为酱醪发酵培养基。
3、顶空萃取-气相色谱-质谱(GC-MS)检测
(1)方法
上述发酵液顶空萃取样品进行气相色谱-质谱(GC-MS)分析方法如下：
取2mL样品于4mL样品瓶，采用固相微萃取小柱顶空萃取30min，然后立即进样进行GC-MS分析。气相色谱载气为氦气，流速1.0mL/min，固相微萃取小柱进样时间为2min，不分流，吹扫流量15mL/min，吹扫2min，色谱柱升温程序为：40℃，保持5min；以2℃/min升温到150℃，保留0min；再以5℃/min升温到240℃，保留10min。质谱采用电子轰击电离(EI)方式，电离能为70eV，检测器电压为857V，扫描范围为m/z 20～350，扫描速度为2.00scans/s；进样口和离子源温度分别为250℃和230℃。
(2)结果
得到苯乙醇(tr＝46.380min)含量最高，香气成分种类最丰富的菌株FW60-5，其香气成分GC-MS分析结果如附图2所示。
4、酵母分离平板培养。
挑取FW60-5单菌落接种于酵母分离平板(5％麦芽浸粉，1％酵母抽提物，18％氯化钠，2％琼脂粉，pH 5～6)，30℃培养48d，观察期菌落形态。挑取平板单菌落于光学显微镜观察期菌体形态，结果如附图3所示。
五、酵母耐盐性能分析
挑取FW60-5单菌落接种于麦芽汁培养基30℃，200r/min震荡培养48h，得到FW60-5种子培养液。将种子培养液按5％分别接种至含0％，5％，10％，14％，16％，18％NaCl的麦芽汁培养基，30℃，200r/min震荡培养，按一定时间间隔取培养液在600nm处测定吸光值。
上述麦芽汁培养基包含：5％麦芽浸粉，1％酵母抽提物，pH 5～6。
结果如附图4所示，NaCl浓度对FW60-5生长曲线影响显著，在含5％～10％NaCl的培养基中，FW60-5生长速度较快，细胞浓度较高；随着NaCl浓度的进一步升高，细胞生长受到抑制，细胞浓度相对降低。但是，FW60-5在含18％NaCl培养基中依然可以达到较高的细胞浓度，说明FW60-5具有一定的耐盐性，可以在高含盐发酵食品(18％NaCl)中生长。
六、酵母耐热性能分析
挑取FW60-5单菌落接种于麦芽汁培养基30℃，200r/min震荡培养48h，得到FW60-5种子培养液。将种子培养液按5％接种至含15％NaCl的麦芽汁培养基，分别于30℃，37℃，42℃培养箱200r/min震荡培养，按一定时间间隔取培养液在600nm处测定吸光值。
上述麦芽汁培养基包含：5％麦芽浸粉，1％酵母抽提物，pH 5～6。
结果如附图5所示，培养温度对FW60-5生长曲线影响显著，在30～37℃培养条件下，FW60-5生长速度较快，细胞浓度较高；温度进一步升高到42℃时，延迟期显著延长。但是，FW60-5在42℃培养条件下依然可以达到较高的细胞浓度，说明FW60-5具有一定的耐热性，可以在高温发酵条件下应用。
七、酵母鉴定
根据细胞形态，生理生化特征和18S ITS rDNA测序等实验数据综合分析，该菌株被鉴定为Zygosaccharomyces sp。该菌株的菌落和菌体形态如附图3所示，其中A为菌落形态照片，B为菌体显微观察照片，生理生化试验结果如上表1所示，菌株的18S ITS rDNA序列如上所示。
八、酵母保藏
于2019年4月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码：510075，保藏编号为GDMCC No：60647。
实施例2
接合酵母FW60-5(Zygosaccharomyces sp FW60-5)在酱油发酵中的应用。
1、材料与分析方法
(1)培养基
15％氯化钠的麦芽汁培养基：5％麦芽浸粉；1％酵母抽提物，15％氯化钠，pH 5～6。
(2)酱油或发酵酱常规理化指标检测方法
总酸测定方法参考：GB T 12456-2008食品中总酸的测定；
氨基酸态氮测定方法参考：GB 5009.235-2016食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定；
总氮测定方法参考：GB 5009.5-2016食品安全国家标准食品中蛋白质的测定；
氯化钠测定方法参考：GB T 12457-2008食品中氯化钠的测定。
(3)感官鉴评方法
由10位在酱油风味鉴评方面具有丰富经验的技术人员，对实施例样品进行盲评。香气方面分别从酸味、豆香、麦芽香、焦香、醇香、综合香气6个维度对样品进行评分；口感方面分别从咸味、鲜味、苦味、甜味、酸味、厚味、综合口感7个维度对样品进行评分。
分值为0～10分，分数越高，该项指标越好。结果取各维度评分的平均数。
(4)苯乙醇、丁醇、2,3-丁二醇气相色谱-质谱(GC-MS)测定方法
取5mL发酵样品，加入30mL乙醚，萃取3次；收集上层萃取液真空浓缩，并溶于无水乙醇，根据浓度合理稀释并用GC-MS进行定量分析。GC-MS具体操作方法如下：
气相色谱载气为氦气，流速1.0mL/min.，进样量1.0μL，分流比为10:1，色谱柱升温程序为：60℃，保留1min；以8℃/min升温到220℃，保留0min；再以4℃/min升温到250℃，保留2min。质谱采用电子轰击电离(EI)方式，电离能为70eV，检测器电压为857V，扫描范围为m/z 50～400，扫描速度为2.00scans/s；进样口和离子源温度分别为250℃和230℃。采用SIM模式，苯乙醇以质荷比(m/z)91.1和122.0两个离子为定量离子进行分析，丁醇的定量离子为荷质比(m/z)41.0和56.0两个离子，2,3-丁二醇的定量离子为荷质比(m/z)45.0和57.0两个离子。
2、操作方法
(1)制备种子培养液
采用含15％氯化钠的麦芽汁培养基培养本发明所述的Zygosaccharomyces spFW60-5，培养时间48h，培养温度30℃，得到菌体活性高，菌体密度大的种子培养液。
(2)酱油发酵
采用曲池制曲或者圆盘制曲设备制曲，使用原料为大豆/脱脂大豆和小麦/小麦粉。
曲料加入盐水发酵10-20d后，在发酵液复料过程中在线添加2％～5％Zygosaccharomyces sp FW60-5种子培养液；接种Zygosaccharomyces sp FW60-5之日起至发酵8～25d，每周复料2次，每次3h，控制发酵料品温为25～32℃；盐分管理、发酵周期管理按照常规方法进行。
3、结果
发酵完成后，检测酱油常规理化指标，采用GC-MS测定苯乙醇、丁醇、2,3-丁二醇浓度，并对酱油风味进行鉴评，结果如表2所示。
表2 Zygosaccharomyces sp FW60-5添加酱油发酵实验结果
Figure BDA0002177214750000081
Figure BDA0002177214750000091
上述结果表明Zygosaccharomyces sp FW60-5应用于酱油发酵，不影响其理化指标，可显著提高苯乙醇含量，显著改善酱油醇香和综合香气，提高酱油口感浓厚度。
实施例3
Zygosaccharomyces sp FW60-5在黄豆酱酿造中的应用
1、分析方法和材料
同实施例2。
2、操作方法
(1)制备种子培养液。
采用含15％氯化钠的麦芽汁培养基培养本发明所述的Zygosaccharomyces spFW60-5，培养时间48h，培养温度30℃，得到菌体活性高，菌体密度大的种子培养液。
(2)黄豆酱发酵
采用曲池制曲或者圆盘制曲设备制曲，使用原料为大豆和面粉/小麦粉。
曲料加入盐水发酵7～15d后，在发酵液复料过程中在线添加2％～5％Zygosaccharomyces sp FW60-5种子培养液；接种Zygosaccharomyces sp FW60-5之日起至发酵8～25d，每周复料2次，每次3h，控制发酵料品温为25～32℃；料水比控制、盐分管理、发酵周期管理按照常规方法进行。
3、结果
发酵完成后，检测黄豆酱常规理化指标，采用GC-MS测定苯乙醇、丁醇、2,3-丁二醇浓度，并对黄豆酱风味进行鉴评，结果如表3所示。
表3 Zygosaccharomyces sp FW60-5添加黄豆酱发酵实验结果
Figure BDA0002177214750000092
Figure BDA0002177214750000101
上述结果表明Zygosaccharomyces sp FW60-5应用于黄豆酱发酵，对其理化指标影响不显著，可显著提高苯乙醇含量，所得黄豆酱胚醇香浓郁，综合香气改善，口感厚味增强。
实施例4
Zygosaccharomyces sp FW60-5在风味基料制备中的应用。
1、分析方法和材料
同实施例2。
2、操作方法。
(1)制备种子培养液
采用含15％氯化钠的麦芽汁培养基培养本发明所述的Zygosaccharomyces spFW60-5，培养时间48h，培养温度30℃，得到菌体活性高，菌体密度大的种子培养液。
(2)制备酱油发酵液
采用曲池制曲或者圆盘制曲设备制曲，使用原料为大豆/脱脂大豆和小麦/小麦粉。曲料加入盐水发酵5～90d后，取发酵醪下层液体，3000rpm离心或者板框压滤或者膜过滤除去较大固体杂质，得到酱油发酵液。
(3)制备风味基料。
按照上述酱油发酵液质量加入1％苯丙氨酸，再接种5％Zygosaccharomyces spFW60-5种子培养液，30℃，200r/min震荡培养24h，将转速降为120r/min，继续培养20～60d，获得风味基料。
采用GC-MS测定风味基料苯乙醇、丁醇、2,3-丁二醇浓度，结果如表4所示。
表4 Zygosaccharomyces spFW60-5应用于风味基料制备实验结果
Figure BDA0002177214750000111
结果表明Zygosaccharomyces sp FW60-5可用于制备高浓度苯乙醇风味基料，可应用于酱油、发酵酱、复合调味料等产品中，以提升其香气。
实施例5
Zygosaccharomyces sp FW60-5制备风味基料在酱油、黄豆酱及火锅底料中的应用。
(1)感官鉴评方法
由10位在酱油风味鉴评方面具有丰富经验的技术人员，对实施例样品进行盲评。感官鉴评的评价指标包括酸味、醇香和浓厚感，分值为0～10分，分数越高，该项指标越好。结果取各维度评分的平均数。
(2)Zygosaccharomyces sp FW60-5制备风味基料在酱油、黄豆酱及火锅底料中的应用
在酱油、黄豆酱及火锅底料配方中加入实施例4制备的风味基料，在酱油中的应用方法为：按酱油重量份的5％添加风味基料，对应取代配方中5％重量份的水。黄豆酱和火锅基料中风味基料的添加方法与酱油相同，添加比例分别为3％，2.5％。配兑完成后以不添加风味基料的酱油、黄豆酱和火锅底料为对照进行感官鉴评。结果如表5所示。
表5风味基料应用感官鉴评
Figure BDA0002177214750000112
结果表明Zygosaccharomyces sp FW60-5制备的风味基料可以显著改善酱油、黄豆酱和火锅底料的醇香和浓厚感，一定程度改善酸味，对上述调味品的风味品质提升有重要作用。
对比例1
采用中国发明专利申请CN109370927A的筛选方法，未筛选到本发明的接合酵母。
对比例2
一种假丝酵母菌FW922-1，其18S ITS rDNA序列见中国发明专利申请CN109370927A。
实施例1的耐热接合酵母FW60-5与对比例2的假丝酵母FW922-1属于不同的种属，两者本身存在差异：FW922-1属于假丝酵母属，种名为Candida oceani；FW60-5属于接合酵母属，种名为Zygosaccharomyces sp。
两者的筛选方法也存在差别，例如耐热接合酵母FW60-5的培养时间、温度、pH值、麦芽汁培养基含盐度都有所差异，本发明的培养条件下耐热接合酵母FW60-5生长更好、增殖更快。
而且，两者在性能上也有差异：(1)本发明的耐热接合酵母FW60-5产生的风味物质种类更多，除了苯乙醇，还能产生丁醇、2,3-丁二醇等，而且能抑制乙酸、异丁酸、4-甲基戊酸等有机酸的产生，而假丝酵母菌FW922-1未涉及丁醇、2,3-丁二醇等风味物质；(2)本发明的耐热接合酵母FW60-5具有耐热性能，可以在42℃下依然具有较好的活性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 李锦记(新会)食品有限公司
<120> 一株耐热接合酵母FW60-5及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 730
<212> DNA
<213> 接合酵母 18S ITS rDNA(Zygosaccharomyces sp)
<400> 1
ttcctccgct tattgatatg cttaagttca gcgggtaatc ctacctgatt tgaggtcaaa 60
ctttgagaat tttgtcaagc cagacgctgc ctgcttcttt ttaaaaagca aacctcttca 120
ctttcgccga gtcggtaaaa cctaatacga ctatcgtggc aaggcgcctc ccgctttccc 180
ctgccacaac ccacaagggg aagtaagcag agggccgcag gattggaaag caatgcttcg 240
cctatggcct cccattttca agcaaactcc agagtagagt atcgctcact accaaacata 300
aacataaaag ctatgtttga gagggaaatg acgctcaaac aggcatgccc cccggaatac 360
caaggggcgc aatgtgcgtt caaagattcg atgattcacg gaattctgca attcacatta 420
cgtatcgcag ttcgctgcgt tcttcatcga tgcgagaacc aagagatccg ttgttgaaag 480
ttttgaatat tttgttttaa ttcgtttttg actttttata atttcataaa aatgttgttt 540
gtgtttacct ctggggacag acgcctttaa aagcacttcc ccaaagagaa caaaaaagca 600
gaaactccac tgtgtgtatc aaaggcggag ggtaaatcaa gccgcgcaat taagcgcagg 660
ctctcccccc ccccagctct tcgagatttt cattttctat aatgatcctt ccgcaggttc 720
acctacggaa 730

Claims (10)

1.一株耐热接合酵母(Zygosaccharomyces sp)FW60-5，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510075，保藏编号为GDMCCNo：60647。
2.一种权利要求1所述的耐热接合酵母FW60-5在食品发酵中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述食品包括：酱油、发酵酱、复合调味料。
4.一种发酵菌剂，其特征在于，所述发酵菌剂包含权利要求1所述的耐热接合酵母FW60-5。
5.一种耐热接合酵母FW60-5种子培养液，其特征在于，通过以下方法制备得到：
将权利要求1所述的耐热接合酵母FW60-5接种至麦芽汁培养基进行培养，培养温度为22～32℃，培养时间为24～60h。
6.根据权利要求5所述的种子培养液，其特征在于，所述麦芽汁培养基包括以下质量百分含量的原料：10％～20％氯化钠，3％～6％麦芽浸粉；0.5％～1.5％酵母抽提物，余量为水，pH为5～6。
7.一种风味基料，其特征在于，采用权利要求4所述的发酵菌剂制备得到。
8.一种权利要求7所述的风味基料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备酱油发酵液：以大豆和/或小麦为原料制曲，将得到的曲料加入盐水发酵，去除固体杂质，保留发酵醪下层液体，即得酱油发酵液；
制备风味基料：向酱油发酵液中加入苯丙氨酸和权利要求5或6所述的耐热接合酵母FW60-5种子培养液，苯丙氨酸的加入量为酱油发酵液质量的0.5％～2.5％，耐热接合酵母FW60-5种子培养液的接种量为酱油发酵液质量的1％～10％。
9.一种酱醪发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：
预发酵：将曲料和盐水混合进行预发酵，得到预发酵液；
发酵：向上述预发酵液中加入权利要求5或6所述的耐热接合酵母FW60-5种子培养液，发酵，即得酱醪。
10.根据权利要求9所述的酱醪发酵方法，其特征在于，
所述预发酵步骤中，当进行酱油发酵时，所述曲料为大豆和/或小麦，所述预发酵时间为10～20天；当进行豆酱发酵时，所述曲料为大豆和面粉，或者为大豆和小麦粉，所述预发酵时间为7～15天；
所述发酵步骤中，所述耐热接合酵母FW60-5种子培养液的加入量为预发酵液质量的2％～5％；加入所述耐热接合酵母FW60-5种子液后10～30天内，每周复料1～2次，每次2～4h，控制发酵料品温为25～32℃，所述复料步骤具体为：将下层发酵液抽出均匀淋入上层发酵醪。
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