CN109280625A - 一种鲁氏接合酵母s96及其应用 - Google Patents

一种鲁氏接合酵母s96及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鲁氏接合酵母S96及其应用，所述鲁氏接合酵母S96保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，保藏名称为S96，其保藏号为：CGMCC NO.16313。本发明所述鲁氏接合酵母S96最高耐盐浓度为25％，在高盐胁迫环境下核酸含量有大幅度提升，将该菌株用于酱油酿造，酵母胞内核酸含量达到细胞干重的7.35％。将鲁氏接合酵母S96用于生产零添加高鲜酱油，酱油中IMP和GMP分别达到153‑172mg/L和76‑89mg/L。

Description

一种鲁氏接合酵母S96及其应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种鲁氏接合酵母S96及其应用。
背景技术
鲜味是酱油的基本特征味道，酱油的鲜味接近于肉汤味。氨基酸钠盐，特别是谷氨酸钠 是酱油的主要鲜味物质。天冬氨酸钠也能贡献部分鲜味，但是天冬氨酸钠的鲜味强度仅相当 于谷氨酸钠鲜味强度的四分之一。除此以外，5'-嘌呤核苷酸钠也能增强酱油的鲜味，例如IMP (肌苷酸)和GMP(鸟苷酸)能赋予酱油独特的鲜味，使得酱油鲜味更加饱满柔和。IMP和 GMP在酵母、肉类、海鲜产品、菇类等物质中广泛存在。
市售酱油主要依靠添加味精、酵母抽提物、外加I+G的方式来增强酱油鲜味。通过这种 方式虽然能够强化酱油口感，但会增加操作工序、提高生产成本，额外的添加物也与人们日 益追求的零添加概念相悖。日本在高鲜酱油方面做了深入研究，日本学者发现将磷酸酶失活 之后加入利于耐盐酵母大量繁殖的营养物并使之自溶是提高酱醪中5'-嘌呤核苷酸含量的有效 途径。麦芽汁等营养物的加入会增加生产成本，而且这种操作方法并没有从根本上改变酱油 酵母核酸含量低的事实，因而对于酱醪中呈味核苷酸含量的提升非常有限。
高核酸酵母主要用于生产富含I+G的抽提物，在调味品、饲料等领域有广泛应用。目前， 高核酸酵母都是常规酵母，不具备高耐性特点，在高盐、高温、高浓醪等条件下不具备生产 能力。笔者对广泛应用于酱油生产的高耐盐鲁氏酵母、球拟酵母、假丝酵母的核酸含量进行 了测定，发现在胁迫环境条件下高耐性酵母的核酸含量都不超过2％。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鲁氏接合酵母S96，该鲁氏接合酵母S96不仅具有耐盐特性， 而且在高盐胁迫环境下胞内核酸含量达到7.35％。
此外，本发明还提供上述鲁氏接合酵母S96生产零添加高鲜酱油的应用技术。
本发明通过下述技术方案实现：
一种鲁氏接合酵母S96，所述鲁氏接合酵母S96保藏于中国微生物菌种管理委员会普通 微生物中心，保藏名称为S96，其保藏号为：CGMCC NO.16313。
本发明所述鲁氏接合酵母S96以鲁氏接合酵母(CGMCC 2.181)为出发菌株，经紫外诱 变、筛选，获得高盐胁迫环境条件下的高核酸酵母菌株，该菌株能在高盐胁迫环境下大量积 累核酸，在高盐胁迫环境下胞内核酸含量达到7.35％。所述鲁氏接合酵母S96于2018年8月 17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，分类命名为Zygosaccharomyces rouxii，保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。
紫外诱变的具体步骤为：
1)、取5mL培养24～48h的鲁氏接合酵母至无菌培养皿中，用15W紫外灯下照射的同时 控制磁力搅拌器搅拌，适宜照射时间。将诱变后的菌悬液稀释后，涂布培养皿，每个培养皿 加入0.1mL，30℃下高盐培养基避光培养5d；
2)、以菌落直径为筛选标志，挑取直径大且表面光滑圆润的菌落进行摇瓶发酵复筛。
通过紫外诱变，在22％盐浓度条件下筛得一株耐盐高核酸鲁氏接合酵母(鲁氏接合酵母 S96)，该菌株最高耐盐浓度为25％，在高盐胁迫环境下核酸含量有大幅度提升，将该菌株用 于酱油酿造，酵母胞内核酸含量达到细胞干重的7.35％。
一种鲁氏接合酵母S96的应用，将鲁氏接合酵母S96应用于生产零添加高鲜酱油。
鲁氏接合酵母S96应用于生产零添加高鲜酱油时，酱油中IMP和GMP分别达到 153-172mg/L和76-89mg/L。
进一步地，鲁氏接合酵母S96应用于生产零添加高鲜酱油的具体步骤为：
1)、接种酵母种子液的制备：斜面菌种经转种子接培养基中培养获得种子液；
2)、发酵培养：将种子液按照0.2～1.2％的接种量接入发酵培养基中发酵培养；
3)、将接种酵母接种于酱醪中。
所述发酵培养基为：酱油成曲和相对于所述酱油成曲为1.5～3倍(W/W)的23％的食盐 水混合物；所述酱油成曲为大豆和小麦的混合物接种米曲霉制成，大豆和小麦的配比为大豆 相当于小麦含量的1～4倍(W/W)。
进一步地，接种酵母包括鲁氏接合酵母S96、嗜盐乳酸菌和球拟酵母，接种于酱醪中时 采用单独接种鲁氏接合酵母S96，或混合接种鲁氏接合酵母S96和球拟酵母，或混合接种鲁 氏接合酵母S96、嗜盐乳酸菌和球拟酵母。
进一步地，鲁氏接合酵母S96接种到酱醪中的接种量为104～107个g/酱醪，所述球拟酵 母接种量为103～104个g/酱醪，所述嗜盐乳酸菌的接种量为103～104个g/酱醪。
进一步地，嗜盐乳酸菌的接种时间为发酵第1d，所述鲁氏接合酵母S96的接种时间为发 酵第25～35d，所述球拟酵母的接种时间为发酵第30～35d。
进一步地，鲁氏接合酵母S96接种前将酱醪温度升高到80～85℃并维持3～5h。
酱醪温度升高到80～85℃并维持3～5h以使酱醪中磷酸酶失活，防止形成的呈味核苷酸 被降解。
进一步地，种子培养基由以下组分组成：葡萄糖20～80g/L、NaCl 80～120g/L、酵母浸 粉0.6～1.0g/L、酱油原油15～20％，其余为水。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明所述鲁氏接合酵母S96最高耐盐浓度为25％，在高盐胁迫环境下核酸含量有大 幅度提升，将该菌株用于酱油酿造，酵母胞内核酸含量达到细胞干重的7.35％。
2、将鲁氏接合酵母S96用于生产零添加高鲜酱油，酱油中IMP和GMP分别达到 153-172mg/L和76-89mg/L。研究利用鲁氏接合酵母S96生产高鲜酱油，能为零添加高鲜酱油 的生产提供新的途径，也能为高盐胁迫环境下高核酸酵母的生产提供有益借鉴。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一 步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的 限定。
鲁氏接合酵母S96的制备：
以鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)CGMCC 2.181为出发菌株，选择致死率为 90％的紫外诱变剂量(照射5min)对鲁氏接合酵母进行诱变，将诱变后的菌液稀释后均匀涂 布于高浓度氯化钠平板(氯化钠浓度100g/L)上，30℃避光培养2-3d后挑取突变株。测定突 变株的胞内核酸含量，与出发株做对照，获得一株高盐胁迫环境下高核酸酵母菌株(鲁氏接 合酵母S96)，胞外核酸含量和菌体干重较出发菌株有大幅提升，结果见表1。
表1.突变菌株S96与出发菌株胞内核酸含量比较
实施例1：
本实施例采用单独接种鲁氏接合酵母S96生产零添加高鲜酱油。
将大豆和小麦加热变性，按照7:3的比例混合，并将水分调整为45％，而后接种米曲霉， 33℃培养3d得到酱油成曲。
将酱油成曲和23％的食盐水按照质量比1:2的比例配制，混匀后加入发酵罐发酵，发酵 温度为33℃。
以鲁氏接合酵母S96为实验菌株，从斜面上将S96菌株接种到种子培养基中扩培；种子 培养基组分为：葡萄糖50g/L、NaCl 120g/L、酵母浸粉0.8g/L、酱油原油20％，其余补水， 121℃高压蒸汽灭菌20min。培养条件为：接种量按照0.8％，酱醪，转速200r/min，通气量2V/V·min，温度30℃，pH值5.5，培养时间为36h。
发酵30天后将酱醪温度升高至85℃并维持4h使磷酸酶失活，而后降温至33℃再将培养 好的鲁氏接合酵母按照106个/g酱醪的接种量接入酱醪中，至发酵180d结束发酵。发酵结束 后酱油原油和接种CGMCC 2.181菌株(对照菌株)所得酱油原油参数进行比较，如表2所示。 由表2可知，实施例1所得酱油原油IMP和GMP含量较对照有了较大提升。
表2.接种S96酵母所得酱油原油参数与单独接种对照菌株CGMCC 2.181比较
实施例2：
本实施例采用混合接种鲁氏接合酵母S96和球拟酵母生产零添加高鲜酱油。
将大豆和小麦加热变性，按照7:3的比例混合，并将水分调整为45％，而后接种米曲霉， 33℃培养3d得到酱油成曲。
将酱油成曲和23％的食盐水按照质量比1:2的比例配制，混匀后加入发酵罐发酵，发酵 温度为33℃。
以鲁氏接合酵母S96、球拟酵母CICC1379为实验菌株，从斜面上将酵母菌株分别接种到 种子培养基中扩培；种子培养基组分为：葡萄糖50g/L、NaCl 120g/L、酵母浸粉0.8g/L、酱 油原油20％，其余补水，121℃高压蒸汽灭菌20min。培养条件为：接种量按照106个/g酱醪， 转速200r/min，通气量2V/V·min，温度30℃，pH值5.5，培养时间为36h。
发酵30天后将酱醪温度升高至85℃并维持4h使磷酸酶失活，而后降温至33℃再将培养 好的鲁氏接合酵母S96按照106个/g酱醪的接种量接入酱醪中，而后发酵1个月接种球拟酵 母CICC 1379(104个/g酱醪)，直至180d结束发酵。发酵结束后酱油原油和单独接种鲁氏接 合酵母CGMCC 2.181(接入时间和方式与S96菌株一致)所得酱油原油的参数进行比较，如 表3所示。由表3可知，实施例2所得酱油原油IMP和GMP含量较对照有了较大提升。
表3.接种S96和球拟酵母CICC 1379所得酱油原油参数与单独接种对照菌株CGMCC2.181比较
实施例3：
本实施例采用混合接种鲁氏接合酵母S96、球拟酵母和嗜盐乳酸菌生产零添加高鲜酱油。
将大豆和小麦加热变性，按照7:3的比例混合，并将水分调整为45％，而后接种米曲霉， 33℃培养3d得到酱油成曲。
将酱油成曲和23％的食盐水按照质量比1:2的比例配制，混匀后加入发酵罐发酵，发酵 温度为33℃。
以突变株S96、球拟酵母CICC 1379、嗜盐乳酸菌为实验菌株，从斜面上分别将S96、嗜 盐乳酸菌和球拟酵母CICC 1379菌株接种到种子培养基中扩培；种子培养基组分为：葡萄糖 50g/L、NaCl 120g/L、酵母浸粉0.8g/L、酱油原油20％，其余补水，121℃高压蒸汽灭菌20min。 酵母菌培养条件为：接种量按照106个/g酱醪，转速200r/min，通气量2V/V·min，温度30℃，pH值5.5，培养时间为36h。嗜盐乳酸菌培养条件为：接种量按照103个/g 酱醪，温度30℃，pH值6.5，培养时间为72h。
将培养好的嗜盐乳酸菌按照103个/g酱醪在发酵第1d接入酱醪。发酵30天后将酱醪温 度升高至85℃并维持4h使磷酸酶失活，降温至33℃再将培养好的鲁氏接合酵母S6按照106个/g酱醪的接种量接入酱醪中，而后发酵1个月接种球拟酵母CICC 1379(104个/g酱醪)， 直至180d结束发酵。发酵结束后酱油原油和单独接种鲁氏接合酵母CGMCC 2.181(接入时 间和方式与S96菌株一致)所得酱油原油的参数进行比较，如表4所示。由表4可知，实施 例3所得酱油原油IMP和GMP含量较对照有了较大提升。
表4.接种嗜盐乳酸菌、S96和球拟酵母CICC 1379所得酱油原油参数与单独接种对照菌株CGMCC
2.181比较
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说 明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护 范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本 发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种鲁氏接合酵母S96，其特征在于，所述鲁氏接合酵母S96保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，保藏名称为S96，其保藏号为：CGMCC NO.16313。
2.一种如权利要求1所述的一种鲁氏接合酵母S96的应用，其特征在于，将鲁氏接合酵母S96应用于生产零添加高鲜酱油。
3.根据权利要求2所述一种鲁氏接合酵母S96的应用，其特征在于，鲁氏接合酵母S96应用于生产零添加高鲜酱油的具体步骤为：
1)、接种酵母种子液的制备：斜面菌种经转种子接培养基中培养获得种子液；
2)、发酵培养：将种子液按照0.2～1.2％的接种量接入发酵培养基中发酵培养；
3)、将接种酵母接种于酱醪中。
4.根据权利要求3所述一种鲁氏接合酵母S96的应用，其特征在于，所述接种酵母包括鲁氏接合酵母S96、嗜盐乳酸菌和球拟酵母，接种于酱醪中时采用单独接种鲁氏接合酵母S96，或混合接种鲁氏接合酵母S96和球拟酵母，或混合接种鲁氏接合酵母S96、嗜盐乳酸菌和球拟酵母。
5.根据权利要求4所述一种鲁氏接合酵母S96的应用，其特征在于，所述鲁氏接合酵母S96接种到酱醪中的接种量为104～107个g/酱醪，所述球拟酵母接种量为103～104个g/酱醪，所述嗜盐乳酸菌的接种量为103～104个g/酱醪。
6.根据权利要求4所述一种鲁氏接合酵母S96的应用，其特征在于，所述嗜盐乳酸菌的接种时间为发酵第1d，所述鲁氏接合酵母S96的接种时间为发酵第25～35d，所述球拟酵母的接种时间为发酵第30～35d。
7.根据权利要求4所述一种鲁氏接合酵母S96的应用，其特征在于，鲁氏接合酵母S96接种前将酱醪温度升高到80～85℃并维持3～5h。
8.根据权利要求3所述一种鲁氏接合酵母S96的应用，其特征在于，所述种子培养基由以下组分组成：葡萄糖20～80g/L、NaCl 80～120g/L、酵母浸粉0.6～1.0g/L、酱油原油15～20％，其余为水。
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