CN113481112B - 一种鲁氏接合酵母及其在降低酱油中生物胺上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鲁氏接合酵母及其在降低酱油中生物胺含量方面的应用，属于微生物发酵技术领域。鉴于目前还没有将鲁氏接合酵母用于降低酱油中生物胺的报道，本发明提供了一种鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)QH‑17，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC 21865。本发明将鲁氏接合酵母以及复合菌——嗜盐四联球菌和鲁氏接合酵母分别应用于酱油的生产过程，在酱油酿造过程中接种相应菌株,发酵结束后可显著降低酱油中的生物胺含量，具有广阔的应用前景。

Description

一种鲁氏接合酵母及其在降低酱油中生物胺上的应用

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种鲁氏接合酵母及其在降低酱油中生物胺上的应用。

背景技术

生物胺由游离氨基酸脱羧生成，是具有生物活性的内源性成分。它们具有重要的生理作用，如细胞增殖、分化和信号转导。然而，当口服过量时，它们会诱发不良反应，如恶心、头痛、皮疹和血压变化。目前，尽管许多国家没有明确的法律限制，但发酵食品中生物胺的残留量是一个越来越受关注的问题。

酱油是一种以大豆和小麦为主原料的传统发酵调味品，含有丰富的蛋白质，较长的发酵周期及开放的发酵环境可能导致酱油生物胺含量增加的风险。目前对食品中的生物胺进行防控主要从两方面入手：一是控制食品在生产过程中生物胺的形成，如生产工艺控制、食品添加剂控制、超高压控制、辐照控制等；二是降解食品在生产过程中已经产生的生物胺，如开发添加具有生物胺氧化酶活性微生物的新型发酵剂。利用微生物对食品中生物胺进行防控的方法相比其他方法更加切实可行，并且稳定安全。目前，还没有将鲁氏接合酵母用于降低酱油中生物胺的报道。

发明内容

本发明为解决上述现有技术存在的问题，首先提供了一种鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)QH-17，该菌株已于2021年3月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC 21865。

显微镜观察分离株菌体呈卵圆形、出芽生殖、有细胞核，而菌落为圆形、乳白色、表面干燥光滑。基于可靠分析，对它们进行分子生物学鉴定，通过软件MEGA 7以近连接法(Neighbor-Joiningmethod，N-J)构建系统发育树，结果如图1所示。

本发明进一步提供了上述鲁氏接合酵母在降低酱油中生物胺含量方面的应用，包括以下步骤：酱油酿造过程中，将成曲与盐水混合，然后接种鲁氏接合酵母，继续发酵至酿造结束。

本发明进一步提供了上述鲁氏接合酵母在降低酱油中生物胺含量方面的应用，包括以下步骤：酱油酿造过程中，将成曲与盐水混合，然后接种嗜盐四联球菌与鲁氏接合酵母，继续发酵至酿造结束。

优选的，成曲与盐水进行混合后，先接种嗜盐四联球菌，混合均匀后发酵3～5天，然后接种鲁氏接合酵母，继续发酵至结束。

其中，嗜盐四联球菌和鲁氏接合酵母的接种量均为1％-2％，嗜盐四联球菌和鲁氏接合酵母的菌体浓度均为10⁷-10⁸CFU/mL。其中，接种量指的是菌悬液相对酱醪的体积。

其中，发酵的温度为28-32℃。

其中，盐水的质量浓度为22％-25％，成曲与盐水的质量比为1:(2～2.5)。

其中，成曲的制备具体为称取黄豆经浸泡蒸煮后，加入面粉，并接种米曲霉，混匀后在33-40℃温度下培养36-48h得到黄豆曲。

其中，面粉的添加量为干黄豆重量的15％-20％。

其中，米曲霉的添加量为干黄豆重量的0.3％-0.5％。

本发明涉及的嗜盐四联球菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 3792。

本发明的有益效果：

本发明提供了鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)QH-17，该菌株已于2021年3月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC21865，并将该鲁氏接合酵母用于酱油酿造过程降低生物胺含量；

本发明所用的菌株是从酱油中筛选所得，将其应用于酱油发酵更具安全性，实施规模不限于实验室，已应用于工厂，且取得较好效果；

本发明在酱油酿造过程中添加复合菌——嗜盐四联球菌和鲁氏接合酵母,发酵结束酱油中生物胺含量相比接种单一菌株，生物胺含量降低更加明显。

附图说明

图1为本发明鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)QH-17的系统发育树。

具体实施方式

菌株的筛选

菌株分离：称取5.0g发酵1个月的酱醪于装有45mL无菌水和玻珠的无菌三角瓶中摇匀打散后，用血球计数板计数菌体数量后进行梯度稀释，然后取合适浓度涂布在分离平板上，置于30±2℃恒温培养箱中培养2d后挑选菌体，然后在平板纯化3次，转接斜面培养基，4℃保存。

菌株初筛：先将待筛选菌株接种于5mL液体活化培养基中，30℃活化24h后，接种于装有100mL含12％NaCl的初筛培养基中，于30±2℃恒温培养箱中培养14d，测定其乙醇含量，每两天震荡一次。挑选乙醇含量较高的进行进一步筛选。

菌株复筛：筛选的分离株活化后，接种到含18％NaCl的发酵培养基中(装液量为2/3)，于30±2℃恒温培养箱中培养25d后，测定其乙醇含量。将乙醇含量最高的用于进一步鉴定。

分离株的鉴定

菌落和个体形态学观察：将复筛所选分离株制成菌悬液后，稀释涂布，于30±2℃下培养48h，用超景深显微镜观察菌落形态，用生物显微镜观察菌体形态。

分子生物学鉴定

(1)菌株DNA提取：将分离株于麦芽汁液体培养基中30±2℃下培养2d后，将菌液离心(8000r/min，4℃)分离后，弃上清，并用无菌生理盐水洗涤3次后收集菌体。液氮研磨破壁，按照试剂盒操作步骤提取总DNA，并于-20℃冰箱中保存。

(2)PCR扩增(基于ITS序列)：反应体系：DNA提取物、正反引物ITSIF和ITS4R各2μL，25μL Mix，19μL ddH₂O；反应条件：96℃预变性1min，95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，重复35个循环后，72℃延伸10min。

测序与分析：用琼脂糖凝胶电泳来检测扩增片段质量和纯度后，送至擎科生物有限公司测序。将所得结果于NCBI上Blast比对，比较目标序列与已知菌株的同源性。然后以同源性为基础，用MEGA7绘制系统发育树。

生物胺按照GB 5009.208-2016检测：准确量取1.0mL稀释50倍的酱油样品于10mL塑料离心管中，依次加入250μL内标溶液(100mg/L)、1mL饱和碳酸氢钠溶液、100μL氢氧化钠溶液(1mol/L)、1mL衍生试剂，涡旋混匀1min后置于60℃恒温水浴锅中衍生15min，取出,分别加入100μL谷氨酸钠溶液,振荡混匀，60℃恒温反应15min,取出冷却至室温，于每个离心管中加入1mL超纯水,涡旋混合1min，40℃水浴下氮吹除去丙酮(约1mL)，加入0.5g氯化钠涡旋振荡至完全溶解，再加5mL乙醚，涡旋振荡2min，静置分层后,转移上层有机相(乙醚层)于15mL离心管中，水相(下层)再萃取一次，合并两次乙醚萃取液，40℃水浴下氮气吹干。加入1mL乙腈振荡混匀，使残留物溶解，0.22μm滤膜针头滤器过滤，待测定。

检测条件：色谱柱为C18柱(5um,4.6×250mm,Agilent,USA)，柱温35℃，紫外检测波长254nm，梯度洗脱程序参考GB 5009.208-2016。

实施例1

实验室中，先以黄豆和小麦粉为酱油酿造原料按照质量比5：1，在密闭制曲机中制曲，成曲与质量浓度25％的NaCl溶液按照质量比为1：2混匀后分装至5L的广口瓶中，在30℃发酵约90天。对照组1接种嗜盐四联球菌，对照组2接种鲁氏接合酵母，实验组接种复合菌株，具体为在发酵0d时加入1％嗜盐四联球菌，发酵第三天时添加1.5％鲁氏接合酵母，空白对照未进行任何处理。发酵90天左右取样分析，分别测定发酵液中生物胺的含量，结果见表1。从结果可以看到，相比不添加任何菌株的空白组，单独添加嗜盐四联球菌或鲁氏接合酵母，生物胺总量均有明显降低，其中单独添加鲁氏接合酵母时，生物胺总量降低了26.87％，当同时添加嗜盐四联球菌和鲁氏接合酵母时，生物胺总量降低最显著，生物胺总量降低了42.74％。

表1添加单一菌株以及复合菌株对酱油发酵中生物胺含量的影响

实施例2

实际酱油酿造过程中，先以黄豆和小麦粉为酱油酿造原料按照质量比5：1，在密闭制曲机中制曲，成曲与质量浓度25％的NaCl溶液(质量比为1：2)混匀后分装至100L的陶缸中，晒露发酵约90天。实验组在发酵0d时加入1％嗜盐四联球菌，发酵第三天时添加1.5％鲁氏接合酵母，空白对照未进行任何处理。发酵90天左右取样分析，测定发酵液中生物胺的含量，结果见表2。由结果可知，添加了嗜盐四联球菌与鲁氏接合酵母的实验组生物胺含量显著低于空白组，色胺降低了100％，苯乙胺降低了52.06％，腐胺降低了57.17％，酪胺降低了69.02％，亚精胺降低了94.52％，精胺降低了100％，总胺降低了74.41％。综上所述，可见在酱油发酵初始复合添加了嗜盐四联球菌和鲁氏接合酵母以后，可以有效抑制生物胺的产生。

表2放大生产中添加复合菌株对酱油发酵中生物胺含量的影响

以上内容是结合具体/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施方式做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种鲁氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）QH-17，该菌株已于2021年3月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 21865。

2.权利要求1所述鲁氏接合酵母在降低酱油中生物胺含量方面的应用。

3.权利要求1所述鲁氏接合酵母在降低酱油中生物胺含量方面的应用，其特征在于：酱油酿造过程中，将成曲与盐水混合，然后接种鲁氏接合酵母，继续发酵至酿造结束。

4.权利要求1所述鲁氏接合酵母在降低酱油中生物胺含量方面的应用，其特征在于：酱油酿造过程中，将成曲与盐水混合，然后接种嗜盐四联球菌与鲁氏接合酵母，继续发酵至酿造结束。

5.根据权利要求4所述鲁氏接合酵母在降低酱油中生物胺含量方面的应用，其特征在于：成曲与盐水进行混合后，先接种嗜盐四联球菌，混合均匀后发酵3~5天，然后接种鲁氏接合酵母，继续发酵至酿造结束。

6.根据权利要求4～5任一项所述鲁氏接合酵母在降低酱油中生物胺含量方面的应用，其特征在于：所述嗜盐四联球菌和鲁氏接合酵母的接种量均为1%-2%，嗜盐四联球菌和鲁氏接合酵母的菌体浓度均为107-108 CFU/mL。

7.根据权利要求3～5任一项所述鲁氏接合酵母在降低酱油中生物胺含量方面的应用，其特征在于：所述盐水的质量浓度为22%-25%；成曲与盐水的质量比为1:（2~2.5）。

8.根据权利要求3～5任一项所述鲁氏接合酵母在降低酱油中生物胺含量方面的应用，其特征在于：所述发酵的温度为28-32℃。

9.根据权利要求3～5任一项所述鲁氏接合酵母在降低酱油中生物胺含量方面的应用，其特征在于：所述成曲的制备具体为称取黄豆经浸泡蒸煮后，加入面粉，并接种米曲霉，混匀后在33-40℃温度下培养36-48h得到黄豆曲。

10.根据权利要求9所述鲁氏接合酵母在降低酱油中生物胺含量方面的应用，其特征在于：所述面粉的添加量为干黄豆重量的15%-20%；所述米曲霉的添加量为干黄豆重量的0.3%-0.5%。

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