CN116536209B - 一株高产愈创木酚的产氮假单胞菌yf-58及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株高产愈创木酚产氮假单胞菌YF‑58及其应用，属于菌株筛选技术领域。本发明提供的产氮假单胞菌(Pseudomonasazotoformans)YF‑58，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为：2023年3月23日，保藏编号为：CGMCCNo.26879。该菌株为高产愈创木酚的原生菌种，通过发酵工艺提升白酒中功效物质愈创木酚的含量，提高白酒中的健康因子。
Description
技术领域
本发明涉及菌株筛选技术领域，尤其涉及一株高产愈创木酚的产氮假单胞菌YF-58及其应用。
背景技术
白酒有五千多年的深厚历史，风格特征独特。大曲作为白酒酿造的发酵剂，可以为白酒提供众多有益微生物、酶及风味物质。同时研究结果表明，白酒中含有众多对人体有益的微量成分，适量饮用白酒对人们的身体健康有诸多好处。近年来，人们对饮食健康的日益重视，白酒作为日常不可缺少的饮品，也朝着健康、安全的方面进行发展。
在白酒的生产过程中，会产生一些酚类物质如愈创木酚、香草醛、香草酸等酚类化合物，它们具有良好的抗氧化的功效，可以降低血糖、抗血栓、抗炎镇痛、抗自由基、预防心血管疾病等功能。提高白酒中酚类物质的含量对白酒品质的提升具有重要意义。
当前关于提高白酒中愈创木酚的研究较少。为此提出本发明。
发明内容
为解决上述问题，本申请从酒曲中筛选可高产愈创木酚的原生菌种，通过发酵提升白酒中愈创木酚功效物质的含量，为提高白酒健康因子含量提供新的发酵菌源。
本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)YF-58，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为：2023年3月23日，保藏编号为：CGMCC No.26879。
本发明还提供了一种愈创木酚功能麸曲，所述麸曲中添加有产氮假单胞菌YF-58。
本发明还提供了一种所述的愈创木酚功能麸曲的制备方法，包括如下步骤：
(1)将麸皮与水按照质量比0.5～1.5:0.5～1.5混合，灭菌，得到麸皮培养物；
(2)将所述产氮假单胞菌YF-58接种至LB液体培养基中，制备种子液：
(3)将所述种子液按照体积百分比8～12％接种到所述麸皮培养物中，于28～32℃下培养3～4d。
优选的，所述产氮假单胞菌YF-58接种至LB液体培养基的接种量为种子液体积的1～2％。
优选的，所述LB液体培养基的配方为：每1000mL水中包括胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化钠8～12g。
优选的，所述种子液的培养条件为：温度30～34℃，转速150～170rpm，时间20～28h。
本发明还提供了一种利用所述产氮假单胞菌YF-58或所述愈创木酚功能麸曲或按照所述的制备方法得到的愈创木酚功能麸曲发酵白酒的应用。
优选的，发酵白酒时所述愈创木酚功能麸曲的添加量为发酵原料质量的2～3％。
本发明提供的菌株YF-58为高产愈创木酚的原生菌种，通过发酵工艺提升白酒中功效物质愈创木酚的含量，与对照组相比实验组的愈创木酚含量提高了34.10％，提高白酒中的健康因子。
附图说明
图1为实施例1绘制的愈创木酚的标准曲线。
图2为实施例2培养的产氮假单胞菌YF-58的菌落生长情况。
图3为实施例2中产氮假单胞菌YF-58的革兰氏染色结果。
图4为实施例2的16S对比的系统进化树。
保藏说明
一株产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)YF-58，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2023年3月23日，保藏编号为：CGMCCNo.26879。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
产氮假单胞菌YF-58的筛选
本发明提供的产氮假单胞菌YF-58是从丹泉酒业有限公司的酒曲中分离获得，分离过程如下：
1、称取1g酒曲，加入10ml无菌水中，在32℃摇床以160rpm洗脱30min，沉淀，吸取1ml上清液，加入100ml的LB液体培养基中，在摇床中以32℃、160rpm的条件培养24h，获得培养液。
LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，水1000mL。
2、将步骤1获得的培养液进行梯度稀释，取0.5mL稀释倍数为10-4、10-5、10-6的培养液涂布于阿魏酸乙酯培养基中，于32℃下培养3天；选取透明圈较大且生长良好的菌株纯种划线分离后，将其接种于刚果红培养基中，于32℃下在培养3天，挑取透明圈较大且生长良好的单菌落进行划线保存。
阿魏酸乙酯培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，15mL阿魏酸乙酯(10％(v/v)溶于二甲基甲酰胺)，琼脂18g，水1000mL。
刚果红培养基：羧甲基纤维素钠5g，(NH4)2SO42g，MgSO40.5g，KH2PO41g，NaCl 0.5g，琼脂18g，水1000mL。
3、最后将透明圈初筛优选菌株(YF-11、YF-24、YF-37、YF-52、YF-58)分别接种于LB液体培养基中，32℃、160rpm培养24h，将得到的各种子液按5％的接种量再分别接入麸皮培养基中，于32℃、160rpm的条件下培养6d后，得到各菌株的麸皮发酵液。
麸皮培养基：麸皮5g，水95mL。
4、GCMS检测
样品处理：取上述麸皮发酵液分别于10000rpm下离心10min，取上清液按体积比1：9与无水乙醇(GC级)混合。
采用外标法对愈创木酚进行定量检测：
(1)愈创木酚标准液的配制：取不同体积的愈创木酚(GC级，上海麦克林生化科技股份有限公司)溶于无水乙醇(GC级，上海麦克林生化科技股份有限公司)中，得到浓度为560μg/L、1120μg/L、1680μg/L、2240μg/L、2800μg/L的标准溶液，用于绘制标准曲线，标准曲线见图1。
(2)采取直接进样法进行定量检测：气象色谱条件为：色谱柱型号：DB-5ms，进样口温度250℃，不分流模式，初始柱温50℃，保持0min；以20℃/min速度升温至150℃，保持0min；以10℃/min速度升温至220℃，保持5min；总分析时间为17min。载气为氦气，恒定流速为1.0mL/min。质谱条件：电离方式：EI；扫描类型：SIM扫描；电离能量：70eV；离子源温度230℃；MS四级杆温度150℃；定性定量离子m/z为81、109、124。
检测结果如表1。
表1愈创木酚功能菌愈产量
| 编号 | 愈创木酚产量μg/ml |
| YF-11 | 0.93±0.19 |
| YF-24 | 0.73±0.01 |
| YF-37 | 1.96±0.22 |
| YF-52 | 0.02±0.09 |
| YF-58 | 3.30±0.25 |
由表1的检测结果可知，本发明筛选的菌株YF-58具有高产愈创木酚的特性，其产量可以达到3.30±0.25mg/L。
实施例2
产氮假单胞菌YF-58的鉴定
1、生理生化鉴定
本实施例利用对产氮假单胞菌YF-58的生理生化鉴定结果参照《伯杰细菌鉴定手册》进行，结果如表2所示。
表2产氮假单胞菌YF-58主要生理生化特征
由表2的鉴定结果可知，YF-58菌株属于假单胞菌属。
2、菌种形态观察
将产氮假单胞菌YF-58菌种接种至LB培养基中。在30℃、160r/min的条件下培养24h，结果如图2所示。从图2中可以看出，菌落呈灰白色，不规则圆形，边缘不整齐，不透明，表面光滑，质地湿润、粘稠。
对产氮假单胞菌YF-58菌进行革兰氏染色，结果如图3所示。经显微镜观察，呈阴性反应，细胞呈杆状，无运动性，细胞大小为(0.5～1.0)μm×(3.0～5.0)μm。
3、序列分析鉴定
细菌16S扩增序列：采用细菌鉴定引物27f/1492r(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’/5’-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3’)进行PCR扩增。扩增体系：1×TSE101金牌mix 45μl，27F(10P)2μl，1492R(10P)2μl，DNA模板1μl。PCR扩增程序：98℃预变性3min，98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸10s/kb，39个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR扩增产物经电泳后送至北京擎科生物公司测序。
测序结果如SEQ ID NO：1所示。
将测得的序列通过NCBI数据库中的BLAST程序与GenBank数据库中已登录的序列进行在线同源性分析，如图4。结果表明，菌株YF-58的16S区域与产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)同源性达100.00％。结合生理生化特性，鉴定菌种YF-58为产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)。
实施例3
酿酒应用实验
工艺流程：高粱原料浸泡—蒸煮—打量水—蒸煮—降温—加曲—装坛发酵—蒸酒，具体操作如下：
原料浸泡：将高粱于室温(25℃)下浸泡24h，浸泡的水要淹过原料20cm，期间翻动3次。
蒸煮：在锅中添加自来水烧开，将浸泡好的高粱沥干后放于锅中，开火蒸煮30min，再关火焖粮30min。
打量水：蒸煮后需补充水分，打量水的温度在90℃以上，添加量以不外流为准。
蒸煮：将高粱放于蒸笼上进行蒸粮，做到内无生心，外微开花。
降温：高粱煮熟后进行降温，温度降至35℃。
加曲：添加曲量为高粱原料量的10％(w/w)，其中愈创木酚功能麸曲占大曲量的25％，其余的是酱香大曲。
发酵：入坛密封发酵，发酵温度控制在30～35℃之间，发酵时间30d。每个陶坛中高粱的重量为1kg。
蒸馏：加入适量自来水于蒸酒锅中，酒醅均匀撒在隔层上，加热蒸馏，取前100ml酒样作为样品。
愈创木酚功能麸曲的制作：取麸皮与等质量的水分混合搅匀，灭菌，得到麸皮培养物，备用；利用LB液体培养基制作种子液，接种后在30℃、160rpm下培养24小时后，菌液浓度为6×107CFU/ml，按体积比10％的接种量加入麸皮培养物中，此时麸皮培养物菌种数量约为于6*106CFU/g，于30℃培养3d。
本实施例同时以未加愈创木酚功能麸曲的处理为对照组。发酵结束后，取实验组和对照组的酒样进行GCMS检测。
GCMS检测：采用直接进样法进行定量检测，气象色谱条件为：色谱柱型号：DB-5ms，进样口温度250℃，不分流模式，初始柱温50℃，保持0min；以20℃/min速度升温至150℃，保持0min；以10℃/min速度升温至220℃，保持5min；总分析时间为17min。载气为氦气，恒定流速为1.0mL/min。质谱条件：电离方式：EI；扫描类型：SIM扫描；电离能量：70eV；离子源温度230℃；MS四级杆温度150℃；定性定量离子m/z为81、109、124。
检测结果如表3所示。
表3酿酒实验结果
| 组别 | 愈创木酚含量(ug/L) |
| 实验组 | 311.74±31.69 |
| 对照组 | 232.47±5.05 |
由表3可知，实验组的愈创木酚含量相比起对照组提高了34.10％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一株产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)YF-58，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为：2023年3月23日，保藏编号为：CGMCCNo.26879。
2.一种愈创木酚功能麸曲，其特征在于，所述麸曲中添加有权利要求1所述的产氮假单胞菌YF-58。
3.一种权利要求2所述愈创木酚功能麸曲的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将麸皮与水按照质量比0.5～1.5:0.5～1.5混合，灭菌，得到麸皮培养物；
(2)将所述产氮假单胞菌YF-58接种至LB液体培养基中，制备种子液：
(3)将所述种子液按照体积百分比8～12％接种到所述麸皮培养物中，于28～32℃下培养3～4d。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述产氮假单胞菌YF-58接种至LB液体培养基的接种量为种子液体积的1～2％。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述LB液体培养基的配方为：每1000mL水中包括胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化钠8～12g。
6.如权利要求3～5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述种子液的培养条件为：温度30～34℃，转速150～170rpm，时间20～28h。
7.一种利用权利要求1所述的产氮假单胞菌YF-58或权利要求2所述的愈创木酚功能麸曲或按照权利要求3～6任一项所述的制备方法得到的愈创木酚功能麸曲发酵白酒的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，发酵白酒时愈创木酚功能麸曲的添加量为发酵原料质量的2～3％。
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