CN111876360B - 一株氧化葡糖酸醋杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明从无花果中分离筛选得到一株非挥发性有机酸含量高、可耐受高温、高醇的氧化葡糖杆菌菌株，该菌株的保藏编号为CGMCC NO：18500。本发明分离筛选出一株氧化葡糖杆菌W‑1菌株，该菌株具有产非挥发性有机酸高、较好的高温耐受性和高醇耐受性且产酸量较高、酿醋风味好，可以提高食醋生产效率，节约生产成本，生产优质食醋，显著提高企业的经济效益。

Description

一株氧化葡糖酸醋杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物应用和食品酿造技术领域，具体涉及一株氧化葡糖杆菌及其应用。

背景技术

食醋是一种传统的酸性调味品，具有缓解疲劳、促进食欲、调节血糖、抗氧化、降低血压及血中胆固醇、预防动脉硬化及某些癌症等多重功效。因此，食醋的酿造与深加工愈来愈受到人们的重视。

液态发酵法酿醋因具有生产周期短、劳动强度小、经济效益高等特点，而被广泛应用于食醋生产。而醋酸菌是液态发酵法酿醋的核心，醋酸菌种的发酵效果极大的影响醋酸发酵效率、食醋产量和食醋风味。

食醋酿造的常用菌种有醋杆菌属、葡糖醋杆菌属、葡糖杆菌属等。其中，葡糖杆菌属的菌株由于不会对乙酸过氧化，因此不存在醋杆菌属、葡糖醋杆菌属菌株发酵中存在的产量下降的问题。

目前，我国液态发酵法酿醋常用的菌种为沪酿1.01和AS1.41，二者均属于巴氏醋酸杆菌，它们所酿造的液态发酵食醋非挥发性有机酸含量低，酸味刺激，口感不够柔和，风味较为单一，品质有待提高。

氧化葡糖杆菌可利用糖类产生葡萄糖酸等非挥发性有机酸，调和食醋酸味的刺激感，改善风味。李云等(“一株果醋发酵氧化葡糖杆菌的鉴定及发酵特性”,李云等，中国酿造，第31卷第5期，公开日为2012年5月15日)从果醋中得到一株氧化葡糖杆菌E3菌株，其在5％乙醇中发酵5d产酸达到3.35g/100mL，6％乙醇中发酵6d产酸达到4.12g/100mL；廖延智等(“紫外诱变选育葡糖杆菌及高产醋酸发酵条件优化”,廖延智等，食品科技，第39卷第6期，公开日为2014年6月20日)对一株葡糖杆菌紫外诱变后，选育出一株在5％乙醇中产酸为35.68g/L的突变株；中国专利“一株产棕色素的葡糖杆菌及其在液态发酵食醋中的应用、申请号201610853676.4”，该专利中的葡糖杆菌FBFS82单独发酵时，总酸为3％，该菌株能产生柠檬酸和少量酒石酸并几乎不产醋酸。但上述菌株存在产非挥发性有机酸种类少且含量低、产总酸和乙酸能力弱、耐乙醇和高温能力等缺陷。

因此，选育非挥发性有机酸含量高、耐受性好、产酸能力强、酿醋风味好的氧化葡糖杆菌对我国食醋产业的发展具有重要的实际意义。

发明内容

本发明从无花果中分离筛选得到一株非挥发性有机酸含量高、可耐受高温、高醇的氧化葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter oxydans)菌株，该菌株所酿食醋产量高，风味品质好。

本发明所提供的氧化葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter oxydans)为氧化葡糖酸醋杆菌W-1株。该菌株于2019年09月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO：18500。

本发明还要解决的技术问题是提供氧化葡糖酸醋杆菌W-1在液态食醋酿造中的应用。

本发明还提供一种食醋的酿造方法，是使用上述的氧化葡糖酸醋杆菌W-1作为发酵菌株来制备食醋；

所述食醋的酿造方法包括如下步骤：

1)将食醋酿造原料糯米或高粱进行蒸熟处理，然后加入酒曲进行糖化处理获得糯米或高粱糖化醪；

蒸熟处理的条件如下：润水量110％～120％，100℃煮熟20min；

糖化条件是60℃糖化2h，降温到30℃；

2)在糯米或高粱糖化醪中接种酵母种子液进行酒精发酵，获得发酵液；

发酵条件是30℃发酵2-5天；

所述的酵母种子液，是将酿酒酵母接种于YPD培养基，30℃培养24h，制得酵母种子液；

3)制备醋酸菌种子液；

将氧化葡糖酸醋杆菌W-1菌株接种于液体种子培养基，发酵获得醋酸菌种子液，

所述液体种子培养基的成分为：葡萄糖、酵母提取物、乙醇和蒸馏水，pH 6.0，

具体地，该液体种子培养基的一种具体组成为：葡萄糖20g/L，酵母浸粉10g/L，乙醇30mL/L，pH6.0。

发酵条件是30℃，180rpm培养20h，制得醋酸菌种子液。

4)液态食醋发酵

将步骤3制备的醋酸菌种子液接种到2)中制备的发酵液中进行液态食醋的发酵，30～39℃，180rpm培养2～10天。

本发明分离筛选出一株氧化葡糖酸醋杆菌W-1，该菌株具有产非挥发性有机酸高、较好的高温耐受性和高醇耐受性且产酸量较高、酿醋风味好，可以提高食醋生产效率，节约生产成本，生产优质食醋，显著提高企业的经济效益。

附图说明

图1：固体培养基菌株复筛菌落图(30℃)。

图2：发酵培养基4株菌株复筛产酸图(30℃)。

图3：固体培养基氧化葡糖酸醋杆菌W-1高温胁迫菌落图(2％乙醇)。

图4：固体培养基氧化葡糖酸醋杆菌W-1高醇胁迫菌落图(30℃)。

图5：有机酸混合标准液高效液相色谱图。

图6：菌株W-1革兰氏染色结果图。

图7：琼脂糖凝胶电泳图。

图8：菌株W-1系统发育树图。

图9：菌株W-1发酵曲线图。

具体实施方式

下面申请人将结合具体的实施例对本发明产品的制备过程及应用过程做详细说明，便于本领域技术人员清楚地理解本发明。但应该理解，以下实施例不应以任何方式被解释为对本申请权利要求书请求保护范围的限制。

实施例1：菌株W-1的分离与筛选

1)原料

选取山东威海8月份成熟的具有较大酸味的腐烂无花果。

2)菌种分离

①菌株富集培养

将无花果腐烂部分置于液体种子培养基，30℃，180rpm，富集培养20h，得到富集培养液。

液体种子培养基组成：葡萄糖20g/L、酵母浸粉10g/L、乙醇30mL/L，pH6.0。

②菌株分离

将无花果腐烂部分的富集培养液梯度稀释，涂布于普通固体培养基平板上，30℃倒置培养72h。挑取出产生透明圈的菌株，并命名。

普通固体培养基组成：葡萄糖20g/L、酵母浸粉10g/L、琼脂粉20g/L、碳酸钙20g/L、乙醇20ml/L。

3)菌株初筛

挑取产生透明圈的153株菌株分别接种于6％乙醇固体培养基(30℃)和37℃(普通固体培养基)培养72h，挑选在6％乙醇固体培养基(30℃)和37℃(普通固体培养基)条件下菌落透明圈圈径比(透明圈直径与菌落直径之比)均较大的菌落，分别为W-1、W-9、X-1、X-7、、Y-3、Z-3、Z-8、Z-11。

6％乙醇固体培养基的组成如下：葡萄糖20g/L、酵母浸粉10g/L、琼脂粉20g/L、碳酸钙20g/L、乙醇60ml/L。

4)固体培养基菌株复筛

将初筛获得的8株菌株进行富集培养后，点接到普通固体培养基，30℃培养48h，测定菌落透明圈圈径比，结果见图1和表1。

表1固体培养基菌株复筛(30℃)透明圈圈径比

如图1和表1所示，菌落透明圈圈径比较大的菌株分别是W-1、Z-8、Y-3和W-9，其中菌株W-1的圈径比最大，为3.16±0.08。

5)菌株耐高温复筛

将W-1、Z-8、Y-3和W-9菌株富集培养后，点接于普通固体培养基上，分别于30℃、35℃、37℃、39℃倒置培养3d，菌株W-1实验结果见图2。

如图2所示，在30℃～39℃之间，菌株W-1的生长没有明显差异。培养第3d，39℃的透明圈圈径比为3.12±0.15，比30℃的透明圈圈径比(2.94±0.12)还高了6.12％，说明菌株W-1具有很强的高温耐受能力和高温发酵产酸能力。

6)菌株耐高醇复筛

将菌株富集培养后，分别点接于含有8％、10％高醇胁迫培养基，30℃倒置培养3d，菌株W-1实验结果见图3。

8％和10％高醇胁迫培养基组成如下：葡萄糖20g/L、酵母浸粉10g/L、琼脂粉20g/L、碳酸钙20g/L、乙醇80mL/L或100mL/L。

如图3所示，菌株W-1在8％和10％乙醇中可以快速生长且产酸，表明该菌株具有较强的乙醇耐受能力和高醇发酵产酸能力。

7)液体发酵培养基菌株复筛

将W-1、Z-8、Y-3、W-9菌株进行富集培养，取富集培养液5mL接种于液体发酵培养基，30℃，180rpm，摇床培养96h，测定产酸量，结果见图4。

液体发酵培养基组成如下：葡萄糖20g/L，酵母浸粉10g/L，乙醇50mL/L，pH6.0。

如图4所示，4株菌株发酵产酸能力依次为W-1、Z-8、Y-3、W-9，其中，菌株W-1总酸含量最高，为4.22±0.07g/100mL。进一步分析4株菌株有机酸含量，结果表明，菌株W-1发酵液中非挥发性有机酸葡萄糖酸、乳酸、酒石酸、柠檬酸、丁二酸含量分别为2519.51±79.36mg/L、201.73±11.12mg/L、135.57±7.55mg/L、151.32±5.28mg/L、76.83±2.07mg/L，非挥发性有机酸含量占总酸的7.31％，非挥发性有机酸含量和占比均为最高。

其中有机酸含量的测定条件如下：高效液相色谱法，Syncronis C18(Dim 250mm×4.6mm,5μm)色谱柱，于紫外波长210nm处检测，柱温30℃。流动相为0.05mol/L KH2PO4-H3PO4缓冲液(pH2.68)，流速0.5mL/min，进样20μL。有机酸溶液和离心去菌体的食醋样品经0.22μm的水系膜过滤后进样检测。有机酸混合标准液色谱图如图5所示。

实施例2：菌株W-1的鉴定

1)菌株W-1生理生化鉴定

对菌株W-1进行革兰氏染色、氧化乙醇试验、氧化乙酸试验、氧化乳酸试验、检测过氧化氢酶和氧化酶试验生理生化鉴定，结果如图6和表2所示。

表2：菌株W-1生理生化鉴定结果表

注：表中“+”代表阳性，“－”代表阴性。

由图6和表2可以看出，菌株W-1为革兰氏阴性菌株，菌体呈短杆状，大小为0.63～0.76μm×1.19～1.51μm，可以氧化乙醇产生乙酸，不能氧化乙酸和乳酸，其他试验结果也均符合《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版中葡糖杆菌属的生理生化特征。

2)菌株W-1 16S rRNA鉴定

①DNA提取

取2mL菌株W-1富集培养液于离心管中，12000r/min离心2min，去上清液，使用细菌DNA基因组提取试剂盒，按照说明书的试验步骤提取菌株的基因组DNA。

②PCR扩增

建立PCR反应体系(50μL)：上游引物(27F)1μL，下游引物(1492R)1μL，DNA模板(基因组)1μL，dNTP 0.5μL，Taq(5U/μL)0.2μL，10×反应缓冲液2.5μL，最后加水补充至25μL。

27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；

1492R:5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'

设定PCR程序:在高温94℃下预变性5min后进入循环程序:94℃变性30s，55℃退火35s，72℃延伸1.5min，共计29个循环，72℃保温10min后冷却至4℃。

③葡萄糖凝胶电泳

用1％(w/v)琼脂糖和1×TAE缓冲液电泳分离扩增DNA。溴化乙锭染色后，用荧光-可见凝胶成像分析系统对PCR产物进行检测，结果见图7，在电泳图上，在1500bp左右有一条清晰的条带。

④扩增产物测序及序列分析

将PCR样品委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行16S rRNA基因扩增序列测序。菌株W-1的16S rDNA序列如下(SEQ ID NO:1)：

CGGGGGGGGCTGCCTTACACATGCAAGTCGCACGAAGGTTTCGGCCTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTAGGGATCTATCCACGGGTGGGGGACAACTTCGGGAAACTGGAGCTAATACCGCATGATACCTGAGGGTCAAAGGCGCAAGTCGCCTGTGGAGGAACCTGCGTTCGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGATGATCGATAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTCGACGGGGACGATGATGACGGTACCCGTAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAATGACTGGGCGTAAAGGGCGCGTAGGCGGTTGTTACAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTTGATACGTGACGACTAGAGTTCGAGAGAGGGTTGTGGAATTCCCAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTGGGAAGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCAACCTGGCTCGATACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTGTGCTGGATGTTGGGAAACTTAGTTTCTCAGTGTCGAAGCTAACGCGCTAAGCACACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGGGCTTGCATGGGGAGGACCGGTTCAGAGATGGACCTTTCTTCGGACCTCCCGCACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTTTAGTTGCCAGCACTTTCAGGTGGGCACTCTAGAGAGACTGCCGGTGACAAGCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGTCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGGTGACAGTGGGAAGCTACATGGTGACATGGTGCTGATCTCTAAAAGCCGTCTCAGTTCGGATTGTACTCTGCAACTCGAGTACATGAAGGTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTCGACCTTAAGCCGGTGAGCGAACCGCAAGGACGCAGCCGACCACGGACGGTCAGCAATGGT。

在NCBI数据库中比对分析，菌株W-1的系统发育树见图8。由图8所示，本发明菌株W-1与菌株Gluconobacter oxydans strain DSM 3503的16S rRNA同源性为99.64％，通过分子标记检测，并结合生理生化特征，最终将本发明菌株命名为氧化葡糖酸醋杆菌W-1(Gluconacetobacter oxydans W-1)。

该菌株于2019年09月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏登记入册的编号为CGMCC NO.18500，保藏日期为2019年09月17日，其分类命名为Gluconacetobacteroxydans。

实施例3氧化葡糖酸醋杆菌W-1产酸特性实验

1)种子液的制备

经W-1菌株接入液体种子培养基，于30℃、180rpm培养20h，得种子液。

2)分批发酵实验

取5mL菌株W-1的种子液接于液体发酵培养基，于30℃、180rpm发酵培养，每隔1d测定细胞浓度(波长540nm处的吸光值)和总酸(检验方法参照GB/T 5009.41)含量，并计算产酸率，结果见图9。

由图9所示，菌株W-1发酵过程中，细胞浓度和总酸含量呈现逐渐增长的趋势，发酵6d，总酸含量达到4.70±0.02g/100mL。产酸率则先上升后下降。在发酵前3d产酸率呈快速上升的趋势，3d时产酸率达到最高，为13.5±0.52g/L/d。

3)补料发酵实验

取5mL菌株W-1的种子液接于液体发酵培养基(含2％乙醇)，于30℃、180rpm发酵培养，培养后的第2-9d分别补加1％的乙醇，继续30℃培养，第10d测定产酸量，最终菌株W-1产酸可达10.05±0.37g/100mL。

实施例4氧化葡糖酸醋杆菌W-1在液态发酵法酿醋中的应用

1)糯米选料和处理：糯米颗粒均匀，润水量110％～120％，蒸米条件：100℃，20min

2)糯米糖化：糯米中加入2％酒曲，60℃糖化2h，降温到30℃。

3)酵母种子液制备：接种酿酒酵母于YPD培养基，30℃培养24h，制得酵母种子液。

4)醋酸菌种子液制备：所述的醋酸菌种子液，是将氧化葡糖酸醋杆菌W-1菌株接种于液体种子培养基，所述液体种子培养基的成分为：葡萄糖、酵母提取物、乙醇和蒸馏水，pH6.0，30℃，180rpm培养20h，制得醋酸菌种子液。

具体地，该液体种子培养基的一种具体组成为：葡萄糖20g/L，酵母浸粉10g/L，乙醇30mL/L，pH6.0。

5)按照5％接种量加入步骤3)酵母种子液进行酒精发酵，30℃发酵2天。

6)按照5％接种量加入步骤4)的醋酸菌种子液，30℃，180rpm培养4天。

7)压榨、过滤：将步骤6)的醋发酵醪利用压榨机进行压榨，硅澡土过滤，制得食醋。

8)灭菌：将步骤7的食醋加热到85℃灭菌3h。将灭菌后的食醋装入经蒸汽杀菌的包装容器中，加盖密封，80℃灭菌1h，制得成品食醋，检验后入库，销售。

表3氧化葡糖酸醋杆菌W-1与巴氏醋杆菌沪酿1.01酿造食醋有机酸含量(4d)

如表3所示，菌株W-1酿造食醋总酸含量为44814.56mg/L(4.48g/100mL)，比沪酿1.01高了12.28％。菌株W-1酿造食醋非挥发性有机酸含量为5238.63mg/L，是沪酿1.01的6.16倍。其中葡萄糖酸、乳酸、酒石酸、柠檬酸、丁二酸含量较高，分别为4142.77±32.61mg/L、548.24±10.27mg/L、232.50±7.29mg/L、179.04±5.92mg/L、119.03±2.82mg/L，分别是沪酿1.01酿造食醋的27.36倍、1.13倍、5.71倍、3.60倍、1.57倍。非挥发性有机酸总量占总酸含量的11.69％，是沪酿1.01酿造食醋(占比为2.13％)的5.49倍，能够调和乙酸等挥发性酸带来的刺激感，使食醋口感更加绵柔，改善液态食醋风味，提升液态食醋质量。

本发明菌株不仅可应用于上述食醋的酿造，也可应用于其它液态发酵食醋(果醋)和固态食醋的酿造。

以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对发明进行了详细的描述，但本领域的技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一株氧化葡糖杆菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1394

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cggggggggc tgccttacac atgcaagtcg cacgaaggtt tcggccttag tggcggacgg 60

gtgagtaacg cgtagggatc tatccacggg tgggggacaa cttcgggaaa ctggagctaa 120

taccgcatga tacctgaggg tcaaaggcgc aagtcgcctg tggaggaacc tgcgttcgat 180

tagctagttg gtggggtaaa ggcctaccaa ggcgatgatc gatagctggt ttgagaggat 240

gatcagccac actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa 300

tattggacaa tgggcgaaag cctgatccag caatgccgcg tgtgtgaaga aggtcttcgg 360

attgtaaagc actttcgacg gggacgatga tgacggtacc cgtagaagaa gccccggcta 420

acttcgtgcc agcagccgcg gtaatacgaa gggggctagc gttgctcgga atgactgggc 480

gtaaagggcg cgtaggcggt tgttacagtc agatgtgaaa tccccgggct taacctggga 540

actgcatttg atacgtgacg actagagttc gagagagggt tgtggaattc ccagtgtaga 600

ggtgaaattc gtagatattg ggaagaacac cggtggcgaa ggcggcaacc tggctcgata 660

ctgacgctga ggcgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg 720

ctgtaaacga tgtgtgctgg atgttgggaa acttagtttc tcagtgtcga agctaacgcg 780

ctaagcacac cgcctgggga gtacggccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 840

cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgcagaac cttaccaggg 900

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gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac 1020

ccttgtcttt agttgccagc actttcaggt gggcactcta gagagactgc cggtgacaag 1080

ccggaggaag gtggggatga cgtcaagtcc tcatggccct tatgtcctgg gctacacacg 1140

tgctacaatg gcggtgacag tgggaagcta catggtgaca tggtgctgat ctctaaaagc 1200

cgtctcagtt cggattgtac tctgcaactc gagtacatga aggtggaatc gctagtaatc 1260

gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc 1320

atgggagttg gttcgacctt aagccggtga gcgaaccgca aggacgcagc cgaccacgga 1380

cggtcagcaa tggt 1394

Claims (9)

1.一株氧化葡糖酸醋杆菌，其特征在于，所述的氧化葡糖酸醋杆菌（Gluconacetobacter oxydans）的保藏编号为CGMCC NO：18500。

2.权利要求1所述的氧化葡糖酸醋杆菌在食醋酿造中的应用。

3.一种食醋的酿造方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1所述的氧化葡糖酸醋杆菌作为发酵菌株来制备食醋。

4.如权利要求3所述的酿造方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

1)将食醋酿造原料进行蒸熟处理，然后加入酒曲进行糖化处理获得糖化醪；

2)在糖化醪中接种酵母种子液进行酒精发酵，获得发酵液；

3) 制备醋酸菌种子液；

将权利要求1所述的氧化葡糖酸醋杆菌接种于液体种子培养基，发酵获得醋酸菌种子液，

4) 液态食醋发酵

将步骤3）制备的醋酸菌种子液接种到步骤2）中制备的发酵液中进行液态食醋的发酵，30~39℃，180rpm培养2~10天。

5.如权利要求4所述的酿造方法，其特征在于，所述的2）中发酵条件是30℃发酵2-5天。

6.如权利要求4所述的酿造方法，其特征在于，所述的2）中所述的酵母种子液，是将酿酒酵母接种于YPD培养基，30℃培养24h，制得酵母种子液。

7.如权利要求4所述的酿造方法，其特征在于，所述的3）中所述液体种子培养基的成分为葡萄糖、酵母提取物、乙醇和蒸馏水，pH 6.0。

8.如权利要求7所述的酿造方法，其特征在于，所述的3）中所述液体种子培养基的组成如下：葡萄糖20 g/L，酵母浸粉10 g/L，乙醇30 mL/L，pH6.0。

9.如权利要求4所述的酿造方法，其特征在于，所述的3）中是30℃，180 rpm培养20 h制得醋酸菌种子液。

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