CN109735464B - 一株用于将乙醇转化为乙酸的巴氏醋杆菌及其在果醋酿造中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株可以将乙醇有效转化为乙酸的巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)WH11240754(4B)，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2019009。本发明还公开了一种果醋发酵方法，它是向经过酶解和酒精发酵的果汁中接种所述巴氏醋杆菌WH11240754(4B)，然后进行醋酸发酵。采用本发明提供的醋酸菌和果醋酿造方法，不仅酒精转化率高达95％以上，而且果醋中具有较高的黄酮类化合物含量和风味物质含量，从而使果醋具有更高的营养价值和香气口感。
Description
技术领域
本发明属于食品饮料和生物技术领域，涉及一株用于将乙醇转化为乙酸的醋酸菌―巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)，本发明还涉及该菌株在果醋酿造中的应用。
背景技术
果醋是以水果(如山楂、葡萄、柑橘、苹果、猕猴桃等)，或者以水果加工下脚料为主要原料，经酒精发酵、醋酸发酵酿制而成的一种营养丰富、风味优良的酸味调味品，兼有水果和食醋的保健功能。同时，果醋还保留了水果中丰富的维生素、矿物质、氨基酸等营养成分，从而极大程度上提高了果醋的保健功能(如促进新陈代谢、调节酸碱平衡、降血脂、降胆固醇等)。
醋酸发酵过程对果醋的生产和品质影响较大，因而优良的醋酸菌菌株对果醋的品质具有至关重要的作用。醋酸菌包括醋酸杆菌和葡萄糖杆菌两类，而生产中常用的醋酸菌多为醋酸杆菌属。近年来，国内果醋(多为苹果醋)酿造过程多采用食醋菌种AS1.41(Acetobacter rancebs var.tubidans)和沪酿1.01(A.pasteurianussubsp.Pastrurianus)。然而这两种菌的产酸能力和耐酒精能力还有所不足，且发酵形成的果醋风味不佳，因此，需要选育发酵性能优良的醋酸菌菌株应用于果醋生产中。本发明通过从未灭菌的橙醋中分离得到一株醋酸菌并将其应用于醋酸发酵过程，将乙醇有效转化为乙酸，从而得到乙酸含量较高的果醋产品。
发明内容
针对现有醋酸菌发酵能力的不足，本发明的目的是提供一株用于将乙醇转化为乙酸的醋酸菌―巴氏醋杆菌，以期利用该菌株的高酒精转化能力克服上述菌株发酵能力的缺陷，从而更好地应用于果醋酿造。
上述目的是通过如下技术方案实现的：
一株用于将乙醇转化为乙酸的巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)WH11240754(4B)，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2019009。
巴氏醋杆菌WH11240754(4B)可耐受9～11％的酒精度；此外，将该菌株活化液以2％接种于酒精含量为7％(v/v)的液体基础发酵培养基中，于30℃、150rpm条件下培养72h后，可产生22.90g/L总酸(以醋酸计)。
一种果醋酿造方法，包括以下步骤：
1)先将水果制成果浆，并向果浆中加入果胶酶和/或纤维素酶进行酶解；
2)向酶解后的果浆中加入酿酒酵母，进行厌氧发酵；
3)将步骤2)的发酵产物进行过滤，向滤液中加入醋酸菌进行醋酸发酵。
优选地，所述醋酸菌为巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)WH11240754(4B)，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2019009。
优选地，所述果胶酶和/或纤维素酶的用量为果浆重量的0.1-0.5％，最佳为0.24％。
优选地，所述酿酒酵母的用量为100-500mg/L果浆，最佳为300mg/L果浆。
优选地，所述醋酸菌的用量为滤液重量的0.5-5％，最佳为1.5％。
优选地，所述厌氧发酵的温度为25-35℃，最佳为28℃。
本发明的有益效果是：
(1)本发明提供的巴氏醋杆菌WH11240754(4B)具有较好的酒精耐受性，同时能更充分地将酒精有效转化为乙酸。
(2)采用本发明提供的醋酸菌和果醋酿造方法，不仅酒精转化率高达95％以上，而且果醋中具有较高的黄酮类化合物含量和风味物质含量，从而使果醋具有更高的营养价值和香气口感。
附图说明
图1为基于菌株WH11240754(4B)的16S rDNA序列同源性构建的系统发育树。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1醋酸菌的分离与鉴定
(1)醋酸菌的分离
取橙醋原醋进行10倍和100倍的梯度浓度稀释，将原醋和稀释后的原醋涂于倒有醋酸菌固体分离培养基的平板上，每个梯度涂三个平板，倒置于恒温培养箱中30℃培养3天。
(2)醋酸菌的筛选
选取菌落分离较好的平板，在平板上挑取多个单菌落分别进行平板划线，再置于培养箱中30℃培养3天，挑取单菌落，同一菌落分别接种于醋酸菌液体培养基和加有乙醇的初步鉴定培养基中，于摇床中30℃、150rpm培养两天后，若含乙醇的培养基出现酸化，则接种的很有可能是醋酸菌。
(3)醋酸菌的鉴定
将有可能是醋酸菌的菌落涂于醋酸菌固体斜面培养基上，培养3天后以煮沸法提取总DNA，然后进行16S rDNA基因序列扩增并对扩增产物进行电泳鉴定，若出现一条清晰地条带，则扩增成功，对应产物送公司进行测序。
结果显示该菌株与Acetobacter pasteurianus的16S rDNA序列同源性超过98％，因此，所得菌株在分子系统发育分类学上属于巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)。
申请人将该菌命名为巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)WH11240754(4B)，并于2019年1月3日保存于位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M2019009。
(4)醋酸菌酒精耐受性实验
挑取醋酸菌菌株接种于30mL基础发酵培养基中，30℃、150rpm摇床培养12h后活化菌株，向液体基础发酵培养基中添加无水乙醇使酒精最终浓度(v/v)为3％、5％、7％、11％、13％，然后以2％的接种量接种醋酸菌活化菌液于以上不同酒精浓度的培养基中，30℃、150rpm条件下培养24h，在600nm波长处测定发酵液的吸光度值。结果显示，巴氏醋杆菌WH11240754(4B)在酒精度为11％时吸光度值(为0.0547±0.0018)明显减少，因此，该醋酸菌可耐受9～11％的酒精度。
(5)醋酸菌产酸量测定实验
挑取醋酸菌菌株接种于30mL基础发酵培养基中，30℃、150rpm摇床培养12h后活化菌株，向液体基础发酵培养基中添加无水乙醇使酒精最终浓度(v/v)为7％，然后以2％的接种量接种醋酸菌活化菌液于上述培养基中，30℃、150rpm条件下培养72h，用指示剂法(参照GB/T 15038-2006)测得发酵液中总酸(以醋酸计)含量为22.90g/L。
液体基础发酵培养：1％葡萄糖，1％酵母浸粉，3％无水乙醇。
实施例2红枣果醋的酿造
1)酶解：取红枣肉，加入6倍重量的水，用榨汁机打浆，然后向果浆中按重量添加0.24％的纤维素酶和果胶酶的混合酶(纤维素酶：果胶酶的质量比为2:1)，搅拌后在常温下酶解2h，得红枣果浆。
2)酒精发酵：按300mg/L的比例将酿酒酵母加入到红枣果浆中，混匀，密封，然后置于28℃恒温培养箱中进行厌氧发酵。在发酵过程中定时取样，样品经5000rpm处理5min后用3，5-二硝基水杨酸法测定发酵液中还原糖的含量，当还原糖含量不再明显下降时结束发酵，过滤后得酒精发酵液，经气相色谱法检测发酵液中乙醇含量为5.79％(v/v)。
3)醋酸发酵：将冻存的巴氏醋杆菌WH11240754(4B)解冻复苏后，接入液体培养基(1％葡萄糖，1％酵母浸粉，3％无水乙醇，pH4.5)中，在30℃、150rpm条件下进行活化和扩大培养，培养时间为两天，培养结束后6000rpm离心，取菌体沉淀并按1.5％(重量)的接种量接种到酒精发酵液中进行醋酸发酵。醋酸发酵过程中每隔两天取少量样品进行酸碱滴定，待样品酸度不再升高时判断发酵结束，同时取样用高效液相色谱法检测乙酸含量，最终乙酸含量为57.44g/L，酒精转化率达95.1％。
实施例3猕猴桃果醋的酿造
1)酶解：取猕猴桃，用清水将表皮洗净，沥干，切碎，打浆，然后向果浆中按重量添加0.24％的果胶酶，搅拌后在常温下酶解2h，制得猕猴桃果浆。
2)酒精发酵：按300mg/L的比例将酿酒酵母加入到猕猴桃果浆中，混匀，密封，然后置于28℃恒温培养箱中进行厌氧发酵。在发酵过程中定时取样，样品经5000rpm处理5min后用3,5-二硝基水杨酸法测定发酵液中还原糖的含量，当还原糖含量不再明显下降时结束发酵，过滤后得酒精发酵液，经气相色谱法检测发酵液中乙醇含量为2.44％(v/v)。
3)醋酸发酵：将冻存的巴氏醋杆菌WH11240754(4B)解冻复苏后，进行活化扩大培养，将培养后的菌体沉淀按1.5％(重量)的接种量接种到酒精发酵液中进行醋酸发酵。醋酸发酵过程中每隔两天取少量样品进行酸碱滴定，待样品酸度不再升高时判断发酵结束，同时取样用高效液相色谱法检测乙酸含量，最终乙酸含量为24.32g/L，酒精转化率达95.5％。经检测，猕猴桃原果中黄酮类化合物含量为1.12g/L，经醋酸发酵得到的果醋中黄酮类化合物含量增加至8倍(即8.96g/L)。
实施例4猕猴桃果醋的酿造
1)酶解：取猕猴桃，用清水将表皮洗净，沥干，切碎，打浆，然后向果浆中按重量添加0.5％的果胶酶，搅拌后在常温下酶解1h，制得猕猴桃果浆。
2)酒精发酵：按150mg/L的比例将酿酒酵母加入到猕猴桃果浆中，混匀，密封，然后置于32℃恒温培养箱中进行厌氧发酵。当还原糖含量不再明显下降时结束发酵，过滤后得酒精发酵液。
3)醋酸发酵：将冻存的巴氏醋杆菌WH11240754(4B)解冻复苏后，进行活化扩大培养，取培养后的菌体沉淀按0.5％(重量)的接种量接种到酒精发酵液中进行醋酸发酵，待样品酸度不再升高时结束发酵。
经检测，果醋中黄酮类化合物含量为8.11g/L。
实施例5猕猴桃果醋的酿造
1)酶解：取猕猴桃，用清水将表皮洗净，沥干，切碎，打浆，然后向果浆中按重量添加0.1％的果胶酶，搅拌后在常温下酶解3h，制得猕猴桃果浆。
2)酒精发酵：按500mg/L的比例将酿酒酵母加入到猕猴桃果浆中，混匀，密封，然后置于25℃恒温培养箱中进行厌氧发酵。当还原糖含量不再明显下降时结束发酵，过滤后得酒精发酵液。
3)醋酸发酵：将冻存的巴氏醋杆菌WH11240754(4B)解冻复苏后，进行活化扩大培养，取培养后的菌体沉淀按3％(重量)的接种量接种到酒精发酵液中进行醋酸发酵，待样品酸度不再升高时结束发酵。
经检测，果醋中黄酮类化合物含量为8.37g/L。
试验例
发酵结束后，利用GC-MS对果醋进行风味物质分析，得到猕猴桃果醋中含有18种风味物质，其中，酯类(乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯等)4种，醇类(苯甲醇、苯乙醇等)7种，醛类(苯甲醛、2-苯基巴豆醛)2种，酸类有辛酸1种，酚类(4-乙基-2-甲氧基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚等)3种，酮类((E)-1-(2,6,6-三甲基-1,3-环己二烯-1-基)-2-丁烯-1-酮)1种。含量较高的有：乙酸乙酯、苯乙醇、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯。这些具有花香与果香的风味物质使猕猴桃果醋的风味更佳。实施例3-5的主要风味物质含量检测结果见表1，其中对比例使用的是目前常用于果醋酿造的普通醋酸菌。
表1实施例3-5猕猴桃果醋中的主要风味物质含量(mg/mL)
| 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 对比例 | |
| 乙酸乙酯 | 23.82 | 21.16 | 22.15 | 18.06 |
| 苯乙醇 | 6.64 | 6.28 | 6.37 | 5.17 |
| 乙酸异戊酯 | 5.32 | 5.17 | 5.22 | 4.56 |
| 乙酸苯乙酯 | 1.75 | 1.82 | 1.49 | 1.39 |
从以上结果可以得出，采用本发明提供的醋酸菌和果醋酿造方法，不仅酒精转化率高达95％以上，而且果醋中具有较高的黄酮类化合物含量和风味物质含量，从而使果醋具有更高的营养价值和香气口感。
Claims (7)
1.一株用于将乙醇转化为乙酸的巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)WH11240754(4B)，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2019009。
2.权利要求1所述的巴氏醋杆菌在果醋酿造中的应用。
3.一种果醋酿造方法，其特征在于包括以下步骤：
1)先将水果制成果浆，并向果浆中加入果胶酶和/或纤维素酶进行酶解；
2)向酶解后的果浆中加入酿酒酵母，进行厌氧发酵；
3)将步骤2)的发酵产物进行过滤，向滤液中加入醋酸菌进行醋酸发酵，
所述醋酸菌为巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)WH11240754(4B)，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2019009。
4.根据权利要求3所述的果醋酿造方法，其特征在于：所述果胶酶和/或纤维素酶的用量为果浆重量的0.1-0.5％。
5.根据权利要求3所述的果醋酿造方法，其特征在于：所述酿酒酵母的用量为100-500mg/L果浆。
6.根据权利要求3所述的果醋酿造方法，其特征在于：所述醋酸菌的用量为滤液重量的0.5-5％。
7.根据权利要求3所述的果醋酿造方法，其特征在于：所述厌氧发酵的温度为25-35℃。
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