CN110218663B - 高产α-糖苷酶抑制剂的解淀粉芽孢杆菌Q4菌株及功能性黄酒和制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于食品加工技术领域，尤其涉及一种高产α‑糖苷酶抑制剂的解淀粉芽孢杆菌Q4菌株及功能性黄酒和制备方法。本申请公开了一种高产α‑糖苷酶抑制剂的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Q4菌株，Q4菌株为可协助麦曲中的霉菌进行原料液化、糖化作用的高产α‑糖苷酶抑制剂菌种。本申请还提供了一种可与传统黄酒酿造麦曲相配合的Q4菌株麸曲作为黄酒生产的糖化发酵剂的方法，通过该方法可以降低产品在食品加工和直接饮用时可吸收性葡萄糖的吸收速度,缓解餐后血糖的上升速度和幅度，发挥控制高热量摄入而又不改变黄酒(料酒)饮用特性的目的。

Description

高产α-糖苷酶抑制剂的解淀粉芽孢杆菌Q4菌株及功能性黄酒 和制备方法

技术领域

本发明属于食品加工技术领域，尤其涉及一种高产α-糖苷酶抑制剂的解淀粉芽孢杆菌Q4菌株及功能性黄酒和制备方法。

背景技术

黄酒是源于中国古老的酒种之一，以大米、黍米、粟等原料酿造而成，一般酒精含量为14%—20%，属于低度酿造酒。黄酒含有丰富的营养，有“液体蛋糕”之称谓。 黄酒除了可直接引用外，还可以用于食物烹调过程中的调味品，具有增香、去腥、提味的功效。

当前随着生活水平的提高，公众对食品营养性和功能性的需求正在不断的提高。目前我国人群中的“三高”发病率很高，总人数达到4亿以上，严重影响广大人民群众的身体健康。为了解决这一问题，需要从治疗和预防等多条途径研究解决这一问题，其中通过食物营养干预也是其中的一条重要途径。

国内外的研究表明，黄酒由于其长期发酵，使得酒体中含有除乙醇和水外的丰富氨基酸组成，在黄酒中的含量比同量啤酒.葡萄酒多一至数倍。黄酒含有许多易被人体消化的营养物质，如：糊精、麦芽糖、葡萄糖、脂类、甘油、高级醇、维生素及有机酸等。这些成分经贮存，最终使黄酒成为营养价值极高的低酒精度饮品。在GB/T13662-2008《黄酒》标准中，黄酒中含有不同的总糖含量，使得黄酒的热量比起其他种类的酒种要高很多，造成人们在享受黄酒的美味的同时也会摄入过多的热量，因此设法在不改变黄酒质量而能降低高糖对于饮用者健康的可能的不良影响成为一个重要的课题和研究方向。

目前新型的功能性黄酒和料酒生产工艺有中国发明专利申请号为CN201610526530的“一种辅助阵血糖料酒及其制作方法”，通过在料酒中添加大量的荞麦粉、木瓜粉和枳实、罗汉果、甘草和川|贝母等中药以突出这种特殊料酒的保健功能。在申请号为CN 201710361466的“一种菌菇料酒的制备方法”中，在料酒中添加茶树菇、鸡腿菇、牛肝菌、竹荪、杏鲍菇、黄豆、红枣、酒曲、葡萄糖、红糟、菊花、百合、西洋参等获得具有菌菇香气并具有促进肠蠕动的作用，可以缓解便秘，同时还可以减少人体对碳水化合物的吸收，降低血糖含量的料酒产品。

中国发明专利CN201510748577“一种溶菌酶保健料酒及其制备方法”中使用黄酒、草莓酒、食用酒精、食用菌、香辛料、中草药、食盐、新鲜苦瓜、新鲜桑叶、低聚乳果糖、富晒酵母粉、溶菌酶等原料，用食用酒精以超声的方式提取中草药，提取率高，与加入的苦瓜桑叶汁互补，保健功能明显增强，能够起到明显的双向调节血糖的作用，预防心脑血管疾病，达到延年益寿的效果，并通过添加溶菌酶杀死料酒中的细菌，延长料酒的货架期。

中国发明专利CN201810255758——“一种降血糖血脂的保健黄酒及其制备方法”中，使用糯米粉、黄瓜、黑茶、羊栖菜、黑枸杞、葛根、青钱柳叶、兰香子、酸溶性大豆蛋白等原料酿造黄酒，具有降血糖、降血脂的天然原料，在传统黄酒生产工艺的基础上进行改进，能够充分保留原料的有效成分，提高了黄酒的营养保健价值，稳定性高。

同样采用添加重要成分的黄酒工艺还包括中国发明专利CN201510689774的“一种降血糖葛根黄酒及其制备方法”，是在元红酒中添加葛根、枸杞、罗汉果甜苷、茯苓、肉桂、桑甚子提取物进行调配，得到一种降血糖葛根黄酒。

另外在中国发明专利CN201610387336，“酵素黄酒及制备工艺方法”中，则是将酵素与黄酒相配合，极大提升了酵素和黄酒各自原有的养生抗衰美容的功效;复合叠加了新的抗癌、抗衰老、抗病毒、降血脂、降血压、降血糖、缓解更年期综合征，预防老年痴呆等特殊疗效。

由于黄酒是一个复杂的发酵体系，其功能性的改变无外乎通过原料的增减和发酵菌种和工艺的改进两个方面，以上的方法都是通过外加非传统酿酒原料以赋予黄酒以新的功能，而发酵过程中有效成分的改变和与酒体的相互作用非常复杂，仅从原料成分的加减较难获得理想的结果和功效。

α-葡萄糖苷酶抑制剂是广泛存在于如苦瓜、桑椹等瓜果中的一类天然生理活性物质，他们通过抑制小肠黏膜刷状缘的α-葡萄糖苷酶以延缓葡萄糖等单糖的吸收，降低餐后高血糖。主要特点包括平稳降糖、安全性高，以及可降低心血管并发症的发生率。由于天然原料中的抑制活性受到多种因素的限制，难以稳定发挥作用，故开发微生物来源的α-葡萄糖苷酶抑制剂来源成为优选的途径。

传统的黄酒基料酒工艺中，大米等原料经过浸米、蒸饭、冷却、发酵、压榨、过滤、煎酒、陈酿、调配等工序制备而成，其中蒸煮糊化的原料的发酵过程借助了特制的酒曲作为糖化剂以协助酵母菌进行后续的酒精发酵。由于黄酒酿造过程中使用多种微生物菌种参与进行混合发酵，而芽孢杆菌通常被认为是对酿造过程不利的有害菌，其原因主要是因为芽孢杆菌会产生丰富的α-淀粉酶，使得发酵过程中可发酵性糖分增加太快，造成酒精发酵速度与黄酒生香过程不匹配造成的。因此设法选择能够控制后续糖化速度的酒曲糖化菌种，包括可以产生α-葡萄糖苷酶抑制剂的芽孢杆菌，就可克服这些不利的影响，同时这些微生物产生的活性成分也会在调控人体血糖方面发挥其重要的功能。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种高产α-糖苷酶抑制剂的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Q4菌株，该菌株的保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为：CCTCC M 2019217，保藏日期为2019年4月1日。

本申请的Q4菌株为可协助麦曲中的霉菌进行原料液化、糖化作用的高产α-糖苷酶抑制剂菌种。

本发明的第二个目的是提供一种细菌麸曲，该细菌麸曲包含所述的Q4菌株。

作为一种实施方式，所述的细菌麸曲的制备方法，该方法将分离得到的Q4菌株用培养基进行扩培后，按照1%的接种量接种于含水量为50%的蒸煮后的灭菌麦麸中，混合均匀后置于37℃下培养72小时，得到细菌麸曲。

本发明的第三个目的是提供一种复合酒曲，该复合酒曲包括所述的细菌麸曲。

优选，该复合酒曲还包括通用酒曲，通用酒曲和细菌麸曲的质量比为5:1~1:1。再优选，通用酒曲和细菌麸曲的质量比为3:1~2:1。

本发明的第三个目的是提供一种功能性黄酒，该功能性黄酒具有α-葡萄糖苷酶抑制活性和低聚糖含量，采用所述的复合酒曲和麦曲协同发酵制得。

作为优选，复合酒曲的加入量为发酵物总质量的0.2~1.5%。

作为优选，麦曲的加入量为发酵物总质量的5~10%。

作为一种实施方式，所述的功能性黄酒的制备方法，该方法包括以下步骤：

1）取大米，加入浸米罐中用清水保持浸没10-24h，待米粒吸水至无硬心时完成浸米；

2）将浸好的米加入蒸饭机中，通蒸汽蒸至米粒外硬内软无白心完成蒸饭并进入发酵工序；3）用水淋冷却至28℃后加入大米质量0.2~1%的通用酒曲和0.1~0.5%的细菌麸曲，拌匀后加入发酵缸中，搭窝糖化30~40小时拌入大米质量5~10%麦曲开始发酵，发酵25~35天后经过压榨、澄清和煎酒后得到功能性黄酒。

本发明的第四个目的是提供一种功能性料酒，其由所述的功能性黄酒勾调生产制得。

本申请提供了一种可与传统黄酒酿造麦曲相配合的Q4菌株麸曲作为黄酒生产的糖化发酵剂的方法，通过该方法可以降低产品在食品加工和直接饮用时可吸收性葡萄糖的吸收速度,缓解餐后血糖的上升速度和幅度，发挥控制高热量摄入而又不改变黄酒(料酒)饮用特性的目的。使得黄酒具有抑制血糖升高和改善肠道健康的保健功能。

本发明具有的特点是：

（1）筛选具有α-糖苷酶抑制活性的芽孢杆菌与糖化用霉菌制备复合黄酒糖化发酵剂，可以平缓黄酒的发酵过程，增加非发酵性的碳水化合物和黄酒风味成分的产量，丰富黄酒的酒体口感。

（2）由于保留酒曲的α-糖苷酶抑制活性，产品在饮用或者作为烹调料酒使用中可抑制碳水化合物分解葡萄糖的速度，从而延缓淀粉、蔗糖等高葡萄糖值（GI）食物消化时的血糖上升，对食用者尤其是II型糖尿病患者具有显著的保健功能。

附图说明

图1为Q4菌株NCBI系统发育树图。

具体实施方式

下面通过实施例进一步阐明本发明，但不仅限于此。

实施例1具有α-糖苷酶抑制活性的芽孢杆菌的分离和鉴定

(1) 菌种筛选

取老恒和公司曲房的酒曲和原料若干份，用适量无菌水悬浮，震荡分散，在60℃的水浴中热处理30min后，在含2%葡萄糖，1.5%的蛋白胨，0.5的氯化钠，0.5%的牛肉膏及2%的琼脂的固体培养基平板上划线菌种。平板在37℃下培养3d，将经过再次纯化后的好氧细菌菌落保存与同上的固体培养基斜面上。

（2）菌种的鉴定

利用SK8225试剂盒进行分离菌种的基因组的提取，利用7F引物（CAGAGTTTGATCCTGGCT）和1540R引物（AGGAGGTGATCCAGCCGCA）进行PCR扩增，然后通过对扩增产物进行基因比对以进行菌种鉴定。

利用特定引物扩增Q4菌种基因组中的16SrDNA序列为：

GGCGGTGGCG CTGCTATACA TGCAGTCGAG CGGACAGATG GGAGCTTGCT CCCTGATGTT

AGCGGCGGAC GGGTGAGTAA CACGTGGGTA ACCTGCCTGT AAGACTGGGA TAACTCCGGG

AAACCGGGGC TAATACCGGA TGGTTGTCTG AACCGCATGG TTCAGACATA AAAGGTGGCT

TCGGCTACCA CTTACAGATG GACCCGCGGC GCATTAGCTA GTTGGTGAGG TAACGGCTCA

CCAAGGCGAC GATGCGTAGC CGACCTGAGA GGGTGATCGG CCACACTGGG ACTGAGACAC

GGCCCAGACT CCTACGGGAG GCAGCAGTAG GGAATCTTCC GCAATGGACG AAAGTCTGAC

GGAGCAACGC CGCGTGAGTG ATGAAGGTTT TCGGATCGTA AAGCTCTGTT GTTAGGGAAG

AACAAGTGCC GTTCAAATAG GGCGGCACCT TGACGGTACC TAACCAGAAA GCCACGGCTA

ACTACGTGCC AGCAGCCGCG GTAATACGTA GGTGGCAAGC GTTGTCCGGA ATTATTGGGC

GTAAAGGGCT CGCAGGCGGT TTCTTAAGTC TGATGTGAAA GCCCCCGGCT CAACCGGGGA

GGGTCATTGG AAACTGGGGA ACTTGAGTGC AGAAGAGGAG AGTGGAATTC CACGTGTAGC

GGTGAAATGC GTAGAGATGT GGAGGAACAC CAGTGGCGAA GGCGACTCTC TGGTCTGTAA

CTGACGCTGA GGAGCGAAAG CGTGGGGAGC GAACAGGATT AGATACCCTG GTAGTCCACG

CCGTAAACGA TGAGTGCTAA GTGTTAGGGG GTTTCCGCCC CTTAGTGCTG CAGCTAACGC

ATTAAGCACT CCGCCTGGGG AGTACGGTCG CAAGACTGAA ACTCAAAGGA ATTGACGGGG

GCCCGCACAA GCGGTGGAGC ATGTGGTTTA ATTCGAAGCA ACGCGAAGAA CCTTACCAGG

TCTTGACATC CTCTGACAAT CCTAGAGATA GGACGTCCCC TTCGGGGGCA GAGTGACAGG

TGGTGCATGG TTGTCGTCAG CTCGTGTCGT GAGATGTTGG GTTAAGTCCC GCAACGAGCG

CAACCCTTGA TCTTAGTTGC CAGCATTCAG TTGGGCACTC TAAGGTGACT GCCGGTGACA

AACCGGAGGA AGGTGGGGAT GACGTCAAAT CATCATGCCC CTTATGACCT GGGCTACCAC

G。

根据此序列构建的NCBI系统发育树如图1所示。

从而确定该菌种为解淀粉芽孢杆菌，为一种食用安全的芽孢杆菌菌种。

（3）细菌麸曲的制备

将分离得到的芽孢杆菌菌株用培养基进行扩培后，按照1%的接种量接种于含水量为50%的蒸煮后的灭菌麦麸中，混合均匀后置于37℃下培养72小时，得到细菌麸曲。

（4）用复合曲进行新型黄酒酿造

按照传统黄酒酿造工艺使用复合酒曲进行黄酒的酿造，具体步骤见各实施例中。

（5）菌种及产品中α-葡萄糖苷酶抑制性的测定

将分离得到的芽孢杆菌接种于灭菌后的含2%可溶性淀粉，1.5%的蛋白胨，0.5的氯化钠，0.5%的牛肉膏的无菌培养基50mL的250mL三角瓶中，摇瓶培养36小时后，进行α-糖苷酶抑制活性的测定。

将每个菌种的培养液或成品黄酒在96孔酶标板上进行7次连续2倍的稀释，得到一系列样品稀释液。在稀释的样品孔中分别加入50μL的标准α-糖苷酶溶液(25mg/mL)， 50μL4-PNPG (0.6 mg/mL)及120μL的0.05mol/L 的磷酸缓冲液(pH6.7)。混匀后在37℃培养箱中准确反应45 min。迅即加入5 0μL的0.6M的碳酸钠溶液终止反应，在波长405nm下用酶标仪测定吸光度。α-糖苷酶抑制活性通过读出的吸光度的变化斜率来表示。

结果见下表：

芽孢杆菌的α-糖苷酶抑制活性

其中只有Q4具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，经过定性分析证明该菌种代谢产物中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的为1-脱氧野尻霉素。故选取该菌作为制备黄酒糖化混合曲的生产菌种。

实施例2 利用Q4菌种进行混合曲功能性黄酒的发酵生产

取大米150kg，加入浸米罐中用清水保持浸没10-24h，待米粒吸水至无硬心时完成浸米；将浸好的米加入蒸饭机中，通蒸汽蒸至米粒外硬内软无白心完成蒸饭并进入发酵工序；用水淋冷却至28℃后加入0.5%的酒曲和0.2%的细菌麸曲，拌匀后加入发酵缸中，搭窝糖化36小时拌入10kg麦曲开始发酵，发酵30天后经过压榨、澄清和煎酒后得到产品功能性黄酒。其组成分析结果见下表，其中的α-葡萄糖苷酶抑制活性和具有益生活性的低聚糖的含量都比对照组有显著的提高。

*利用发明内容部分的方法检测的非稀释原酒对α-葡萄糖苷酶活力抑制的百分率。

实施例3 （对照组）的常规黄酒的发酵生产

取大米150kg，加入浸米罐中用清水保持浸没10-24h，待米粒吸水至无硬心时完成浸米；将浸好的米加入蒸饭机中，通蒸汽蒸至米粒外硬内软无白心完成蒸饭并进入发酵工序；用水淋冷却至28℃后加入0.5%的酒曲，拌匀后加入发酵缸中，搭窝糖化36小时拌入10kg麦曲开始发酵，发酵30天后经过压榨、澄清和煎酒后得到产品黄酒。

以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 湖州老恒和酒业有限公司

<120> 高产α-糖苷酶抑制剂的解淀粉芽孢杆菌Q4菌株及功能性黄酒和制备方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1201

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)

<400> 1

ggcggtggcg ctgctataca tgcagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt 60

agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg 120

aaaccggggc taataccgga tggttgtctg aaccgcatgg ttcagacata aaaggtggct 180

tcggctacca cttacagatg gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca 240

ccaaggcgac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac 300

ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac 360

ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag 420

aacaagtgcc gttcaaatag ggcggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta 480

actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc 540

gtaaagggct cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga 600

gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc 660

ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa 720

ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780

ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc 840

attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg 900

gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg 960

tcttgacatc ctctgacaat cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca gagtgacagg 1020

tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg 1080

caacccttga tcttagttgc cagcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca 1140

aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctaccac 1200

g 1201

Claims (8)

1.高产α-糖苷酶抑制剂的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Q4菌株用制备具有α-葡萄糖苷酶抑制活性和低聚糖含量的功能性黄酒中的应用，该菌株的保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为：CCTCC M2019217，保藏日期为2019年4月1日。

2.一种复合酒曲，该复合酒曲包括细菌麸曲和通用酒曲，通用酒曲和细菌麸曲的质量比为5:1~1:1；所述的细菌麸曲包含高产α-糖苷酶抑制剂的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Q4菌株，该菌株的保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为：CCTCC M 2019217，保藏日期为2019年4月1日。

3.根据权利要求2所述的一种复合酒曲，其特征在于，将分离得到的Q4菌株用培养基进行扩培后，按照1%的接种量接种于含水量为50%的蒸煮后的灭菌麦麸中，混合均匀后置于37℃下培养72小时，得到细菌麸曲。

4.一种功能性黄酒，该功能性黄酒具有α-葡萄糖苷酶抑制活性和低聚糖含量，采用权利要求2或3所述的复合酒曲和麦曲协同发酵制得。

5.根据权利要求4所述的一种功能性黄酒，其特征在于，复合酒曲的加入量为发酵物总质量的0.2~1.5%。

6.根据权利要求4所述的一种功能性黄酒，其特征在于，麦曲的加入量为发酵物总质量的5~10%。

7.一种制备权利要求4~6任意一项权利要求所述的功能性黄酒的制备方法，该方法包括以下步骤：

1）取大米，加入浸米罐中用清水保持浸没10-24h，待米粒吸水至无硬心时完成浸米；

2）将浸好的米加入蒸饭机中，通蒸汽蒸至米粒外硬内软无白心完成蒸饭并进入发酵工序；3）用水淋冷却至28℃后加入大米质量0.2~1%的通用酒曲和0.1~0.5%的细菌麸曲，拌匀后加入发酵缸中，搭窝糖化30~40小时拌入大米质量5~10%麦曲开始发酵，发酵25~35天后经过压榨、澄清和煎酒后得到功能性黄酒。

8.一种功能性料酒，其由权利要求4~6任意一项权利要求所述的功能性黄酒勾调生产制得。

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