CN110923270A - 一种利用化工乙醇发酵生产乙酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用化工乙醇发酵生产乙酸的方法，涉及微生物发酵技术领域。该方法包括活化培养、种子培养和发酵培养三步，使用了巴氏醋杆菌、产纤维二糖梭菌和棕榈发酵杆菌三种混合菌，利用化工乙醇发酵生产乙酸。通过调整三种菌的接种比例，明显提高了耐乙醇程度；通过调整培养基的配比，提高了乙醇的转化率；通过控制发酵条件有效的缩短了发酵时间，降低了生产成本，且有效利用了化工乙醇，变废为宝。
Description
技术领域：
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种利用化工乙醇发酵生产乙酸的方法。
背景技术：
乙酸是一种重要的有机酸，作为基本的有机化工原料，它主要作为橡胶、塑料和染料等生产过程的溶剂，也是生产对苯二甲酸（PTA）、乙酸乙烯单体（VAM）、乙酸纤维、乙酸盐等的基本化工原料，乙酸同样也在食品、医药、农药化纤等方面有广泛的用途。乙酸的制备可以通过化学合成和生物发酵两种方法，发酵法生产乙酸或食醋是乙醇在醋酸菌的作用下氧化成乙酸的过程。
能够发酵生产乙酸的醋酸菌主要是醋酸杆菌属(Acetobaeter)，其需氧呼吸，在有氧、中性和酸性条件下可将乙醇（酒精）氧化成醋酸。乙醇和乳酸盐是良好的碳源，在发酵过程中，代谢产物有CO2和H2、乙酸、乳酸、丙酸、丁酸和丙酮等。由于醋酸发酵所需要的代谢产物主要为乙酸，因此一般使用醋酸杆菌进行乙酸发酵。但在工业乙酸的生产过程中，常用醋酸菌的生长和代谢都会受到较高浓度的乙醇和乙酸的抑制，一般低至0.5%的乙酸可对大多数微生物生长产生抑制作用，高浓度酒精也导致弱的细胞活力和发酵效率低(Ardhana etal. 2003)，因此用于乙酸发酵的初始乙醇浓度一般不超过8%。醋酸菌种比较单一，易发生过氧化反应，使得乙醇转化率较低，乙酸发酵周期也较长。因此，利用发酵法生产乙酸的发展就受到了极大的限制。
另外，随着化工行业的快速发展和化工原料的广泛使用，工业污染也来越严重，人们也越来越重视环境污染，工业废气废水经过处理进行再次合理利用，其中就包括化工乙醇。因此，本发明提供了一种利用化工乙醇发酵生产乙酸的方法，该方法所生产的乙酸含量和乙醇转化率高，使用的混合菌更耐乙醇，且将化工乙醇有效利用，能够变废为宝。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种利用化工乙醇发酵生产乙酸的方法，该方法使用了保藏编号为ATCC23758的巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）、保藏编号为ATCC35319产纤维二糖梭菌（Clostridium cellulolyticum）和保藏编号为ATCC51623的棕榈发酵杆菌（Zymobacter palmae）混合菌，利用化工乙醇发酵生产乙酸。
本发明提供了一种利用化工乙醇发酵生产乙酸的方法，所述的方法包括以下步骤：
（1）活化培养：别活化培养巴氏醋杆菌、产纤维二糖梭菌和棕榈发酵杆菌；
（2）种子培养：将步骤（1）活化后的巴氏醋杆菌、产纤维二糖梭菌和棕榈发酵杆菌分别接种于种子培养基中进行种子培养，至菌体OD 600值达到1.0，得到巴氏醋杆菌种子液、产纤维二糖梭菌种子液和棕榈发酵杆菌种子液；
所述的种子培养基包括：葡萄糖1-6g/L、蛋白胨3-8g/L、酵母膏2-5g/L、KH2PO4 0.2-0.6g/L、硫酸铵0.1-0.5g/L、柠檬酸钠0.5-1.2g/L、乙酸0.5%-1.0%(v/v)、化工乙醇5%-15%(v/v)；
（3）发酵培养：将步骤（2）得到的巴氏醋杆菌种子液、产纤维二糖梭菌种子液和棕榈发酵杆菌种子液混合接种到发酵培养基中培养，接种量为10%-20%，当酸度不再增加时结束发酵；
所述的巴氏醋杆菌种子液、产纤维二糖梭菌种子液和棕榈发酵杆菌种子液的体积比为2-5:0.5:1；
所述的发酵培养基包括：葡萄糖2-8g/L、蛋白胨3-8g/L、酵母膏3-6g/L、KH2PO4 0.2-0.6g/L、硫酸铵0.2-0.6g/L、柠檬酸钠0.5-1.2g/L、乙酸1.0%-2.5%(v/v)、化工乙醇5%-15%(v/v)，消泡剂0.3% (v/v)。
优选地，所述的化工乙醇中乙醇含量为75%-90%。
优选地，所述的种子培养的条件为温度28-32℃，160-200r/min摇瓶培养。
进一步优选地，所述的种子培养的条件为温度30℃，180r/min摇瓶培养。
优选地，所述的发酵培养的条件为温度28-32℃，搅拌速度为180-220r/min，通气量160-200L/h。
进一步优选地，所述的发酵培养的条件为温度30℃，搅拌速度为200r/min，通气量180L/h。
优选地，步骤（3）中巴氏醋杆菌种子液、产纤维二糖梭菌种子液和棕榈发酵杆菌种子液的体积比为3:0.5:1。
优选地，所述的种子培养基包括：葡萄糖4g/L、蛋白胨5g/L、酵母膏3g/L、KH2PO40.4g/L、硫酸铵0.3g/L、柠檬酸钠0.8g/L、乙酸0.8%(v/v)、化工乙醇10%(v/v)。
优选地，所述的发酵培养基包括：葡萄糖5g/L、蛋白胨5g/L、酵母膏4g/L、KH2PO40.4g/L、硫酸铵0.4g/L、柠檬酸钠0.8g/L、乙酸1.5%(v/v)、化工乙醇10%(v/v)，消泡剂0.3%(v/v)。
具体地，一种利用化工乙醇发酵生产乙酸的方法，包括以下步骤：
（1）活化培养：将保藏编号为ATCC23758的巴氏醋杆菌、保藏编号为ATCC35319产纤维二糖梭菌和保藏编号为ATCC51623的棕榈发酵杆菌接种到活化培养基上，培养箱中30℃活化培养20h，得到活化菌；
所述的活化培养基：葡萄糖1g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 2.5g/L、琼脂粉20g/L。
（2）种子培养：取一环生长良好的活化菌，巴氏醋杆菌、产纤维二糖梭菌和棕榈发酵杆菌分别接种于含有种子培养基的摇瓶中进行培养，装液量为200mL/500mL，温度28-32℃，160-200r/min摇瓶培养，至菌体OD600值达到1.0，得到巴氏醋杆菌种子液、产纤维二糖梭菌种子液和棕榈发酵杆菌种子液；
所述的种子培养基包括：葡萄糖1-6g/L、蛋白胨3-8g/L、酵母膏2-5g/L、KH2PO4 0.2-0.6g/L、硫酸铵0.1-0.5g/L、柠檬酸钠0.5-1.2g/L、乙酸0.5%-1.0%(v/v)、化工乙醇5%-15%(v/v)；
（3）发酵培养：按照10%-20%的接种量将步骤（2）得到的种子液接种至发含有发酵培养基的10L发酵罐中，巴氏醋杆菌种子液、产纤维二糖梭菌种子液和棕榈发酵杆菌种子液的体积比为2-5:0.5:1，装液量为6L/10L，培养温度28-32℃，搅拌速度为180-220r/min，通气量160-200L/h，当酸度不再增加时结束发酵；
所述的发酵培养基包括：葡萄糖2-8g/L、蛋白胨3-8g/L、酵母膏3-6g/L、KH2PO4 0.2-0.6g/L、硫酸铵0.2-0.6g/L、柠檬酸钠0.5-1.2g/L、乙酸1.0%-2.5%(v/v)、化工乙醇5%-15%(v/v)，消泡剂0.3% (v/v)；
所述的化工乙醇中乙醇含量为75%-90%。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种利用化工乙醇发酵生产乙酸的方法，使用了巴氏醋杆菌、产纤维二糖梭菌和棕榈发酵杆菌三种混合菌，利用化工乙醇发酵生产乙酸。通过调整三种菌的接种比例，明显提高了耐乙醇程度；所产乙酸含量高，能够有效的利用化工乙醇，变废为宝，并缩短发酵时间，降低了生产成本；另外，在培养基中添加适量的柠檬酸钠提高了乙醇的转化率。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的菌种、药品、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一种利用化工乙醇发酵生产乙酸的方法，包括以下步骤：
（1）活化培养：将保藏编号为ATCC23758的巴氏醋杆菌、保藏编号为ATCC35319产纤维二糖梭菌和保藏编号为ATCC51623的棕榈发酵杆菌接种到活化培养基上，培养箱中30℃活化培养20h，得到活化菌；
所述的活化培养基：葡萄糖1g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 2.5g/L、琼脂粉20g/L。
（2）种子培养：取一环生长良好的活化菌，巴氏醋杆菌、产纤维二糖梭菌和棕榈发酵杆菌分别接种于含有种子培养基的摇瓶中进行培养，装液量为200mL/500mL，温度28℃，160r/min摇瓶培养，至菌体OD600值达到1.0，得到巴氏醋杆菌种子液、产纤维二糖梭菌种子液和棕榈发酵杆菌种子液；
所述的种子培养基包括：葡萄糖1g/L、蛋白胨3g/L、酵母膏2g/L、KH2PO4 0.2g/L、硫酸铵0.1g/L、柠檬酸钠0.5g/L、乙酸0.5% (v/v)、化工乙醇5% (v/v)；
（3）发酵培养：按照10%的接种量将步骤（2）得到的种子液接种至发含有发酵培养基的10L发酵罐中，巴氏醋杆菌种子液、产纤维二糖梭菌种子液和棕榈发酵杆菌种子液的体积比为2:0.5:1，装液量为6L/10L，培养温度28℃，搅拌速度为180r/min，通气量160L/h，当酸度不再增加时结束发酵；
所述的发酵培养基包括：葡萄糖2g/L、蛋白胨3g/L、酵母膏3g/L、KH2PO4 0.2g/L、硫酸铵0.2g/L、柠檬酸钠0.5g/L、乙酸1.0% (v/v)、化工乙醇5% (v/v)，消泡剂0.3% (v/v)；
所述的化工乙醇中乙醇含量为75%，即培养基中起始乙醇含量为3.75%。
实施例2
一种利用化工乙醇发酵生产乙酸的方法，包括以下步骤：
（1）活化培养：将保藏编号为ATCC23758的巴氏醋杆菌、保藏编号为ATCC35319产纤维二糖梭菌和保藏编号为ATCC51623的棕榈发酵杆菌接种到活化培养基上，培养箱中30℃活化培养20h，得到活化菌；
所述的活化培养基：葡萄糖1g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 2.5g/L、琼脂粉20g/L。
（2）种子培养：取一环生长良好的活化菌，巴氏醋杆菌、产纤维二糖梭菌和棕榈发酵杆菌分别接种于含有种子培养基的摇瓶中进行培养，装液量为200mL/500mL，温度30℃，180r/min摇瓶培养，至菌体OD600值达到1.0，得到巴氏醋杆菌种子液、产纤维二糖梭菌种子液和棕榈发酵杆菌种子液；
所述的种子培养基包括：葡萄糖4g/L、蛋白胨5g/L、酵母膏3g/L、KH2PO4 0.4g/L、硫酸铵0.3g/L、柠檬酸钠0.8g/L、乙酸0.8%(v/v)、化工乙醇10%(v/v)；
（3）发酵培养：按照15%的接种量将步骤（2）得到的种子液接种至发含有发酵培养基的10L发酵罐中，巴氏醋杆菌种子液、产纤维二糖梭菌种子液和棕榈发酵杆菌种子液的体积比为3:0.5:1，装液量为6L/10L，培养温度30℃，搅拌速度为200r/min，通气量180L/h，当酸度不再增加时结束发酵；
所述的发酵培养基包括：葡萄糖5g/L、蛋白胨5g/L、酵母膏4g/L、KH2PO4 0.4g/L、硫酸铵0.4g/L、柠檬酸钠0.8g/L、乙酸1.5%(v/v)、化工乙醇10%(v/v)，消泡剂0.3% (v/v)。；
所述的化工乙醇中乙醇含量为82%，，即培养基中起始乙醇含量为8.2%。
实施例3
一种利用化工乙醇发酵生产乙酸的方法，包括以下步骤：
（1）活化培养：将保藏编号为ATCC23758的巴氏醋杆菌、保藏编号为ATCC35319产纤维二糖梭菌和保藏编号为ATCC51623的棕榈发酵杆菌接种到活化培养基上，培养箱中30℃活化培养20h，得到活化菌；
所述的活化培养基：葡萄糖1g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 2.5g/L、琼脂粉20g/L。
（2）种子培养：取一环生长良好的活化菌，巴氏醋杆菌、产纤维二糖梭菌和棕榈发酵杆菌分别接种于含有种子培养基的摇瓶中进行培养，装液量为200mL/500mL，温度32℃，200r/min摇瓶培养，至菌体OD600值达到1.0，得到巴氏醋杆菌种子液、产纤维二糖梭菌种子液和棕榈发酵杆菌种子液；
所述的种子培养基包括：葡萄糖6g/L、蛋白胨8g/L、酵母膏5g/L、KH2PO4 0.6g/L、硫酸铵0.5g/L、柠檬酸钠1.2g/L、乙酸1.0%(v/v)、化工乙醇15%(v/v)；
（3）发酵培养：按照20%的接种量将步骤（2）得到的种子液接种至发含有发酵培养基的10L发酵罐中，巴氏醋杆菌种子液、产纤维二糖梭菌种子液和棕榈发酵杆菌种子液的体积比为5:0.5:1，装液量为6L/10L，培养温度32℃，搅拌速度为220r/min，通气量200L/h，当酸度不再增加时结束发酵；
所述的发酵培养基包括：葡萄糖8g/L、蛋白胨8g/L、酵母膏6g/L、KH2PO4 0.6g/L、硫酸铵0.6g/L、柠檬酸钠1.2g/L、乙酸2.5%(v/v)、化工乙醇15%(v/v)，消泡剂0.3% (v/v)；
所述的化工乙醇中乙醇含量为90%，即培养基中起始乙醇含量为13.5%。
对比例1
一种利用化工乙醇发酵生产乙酸的方法，与实施例2区别仅在于，所用的混合菌中不添加产纤维二糖梭菌。
对比例2
一种利用化工乙醇发酵生产乙酸的方法，与实施例2区别仅在于，所用的混合菌中不添加棕榈发酵杆菌。
对比例3
一种利用化工乙醇发酵生产乙酸的方法，与实施例2的区别仅在于，种子培养基和发酵培养基中不添加柠檬酸钠。
对比例4
一种利用化工乙醇发酵生产乙酸的方法，与实施例2的区别仅在于，步骤（3）发酵培养的条件为培养温度26℃，搅拌速度为160r/min，通气量150L/h。
本发明提供的利用化工乙醇发酵生产乙酸的方法效果评价：
对实施例1-3和对比例1-4的发酵培养前后，用高效液相色谱法测定乙酸和乙醇含量，统计发酵生产所用的时间，计算发酵培养过程中产生的乙酸含量和乙醇的转化率；利用紫外分光光度计检测发酵结束时菌种含量OD600，OD600值越大说明菌种的耐乙醇能力越强。
由表1可知，利用本发明提供的方法发酵生产乙酸，所用的混合菌耐乙醇能力强，可耐受13.5%浓度的乙酸，且乙酸产量高，均能达到55g/L以上。
由表2可知，利用本发明提供的方法发酵生产乙酸，能够有效利用化工乙醇，在培养集中加入适量的柠檬酸钠，可以明显提高乙醇的转化率。
由表3可知，利用本发明提供的方法发酵生产乙酸，所用的发酵时间较短，通过调整发酵培养条件，可有效缩短发酵时间，从而降低成本。
综上，本发明提供的利用化工乙醇发酵生产乙酸的方法，所使用的混合菌能够耐受高浓度的乙醇，所产的乙酸含量高，能够有效的利用化工乙醇，可变废为宝，且缩短了发酵时间，降低了生产成本。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种利用化工乙醇发酵生产乙酸的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
（1）活化培养：分别活化培养巴氏醋杆菌、产纤维二糖梭菌和棕榈发酵杆菌；
（2）种子培养：将步骤（1）活化后的巴氏醋杆菌、产纤维二糖梭菌和棕榈发酵杆菌分别接种于种子培养基中进行种子培养，至菌体OD 600值达到1.0，得到巴氏醋杆菌种子液、产纤维二糖梭菌种子液和棕榈发酵杆菌种子液；
所述的种子培养基包括：葡萄糖1-6g/L、蛋白胨3-8g/L、酵母膏2-5g/L、KH2PO4 0.2-0.6g/L、硫酸铵0.1-0.5g/L、柠檬酸钠0.5-1.2g/L、乙酸0.5%-1.0%(v/v)、化工乙醇5%-15%(v/v)；
（3）发酵培养：将步骤（2）得到的巴氏醋杆菌种子液、产纤维二糖梭菌种子液和棕榈发酵杆菌种子液混合接种到发酵培养基中培养，接种量为10%-20%，当酸度不再增加时结束发酵；
所述的巴氏醋杆菌种子液、产纤维二糖梭菌种子液和棕榈发酵杆菌种子液的体积比为2-5:0.5:1；
所述的发酵培养基包括：葡萄糖2-8g/L、蛋白胨3-8g/L、酵母膏3-6g/L、KH2PO4 0.2-0.6g/L、硫酸铵0.2-0.6g/L、柠檬酸钠0.5-1.2g/L、乙酸1.0%-2.5%(v/v)、化工乙醇5%-15%(v/v)，消泡剂0.3% (v/v)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的化工乙醇中乙醇含量为80%-95%。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的种子培养的条件为温度28-32℃，160-200r/min摇瓶培养。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养的条件为温度28-32℃，搅拌速度为180-220r/min，通气量160-200L/h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中巴氏醋杆菌种子液、产纤维二糖梭菌种子液和棕榈发酵杆菌种子液的体积比为3:0.5:1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的种子培养基包括：葡萄糖4g/L、蛋白胨5g/L、酵母膏3g/L、KH2PO4 0.4g/L、硫酸铵0.3g/L、柠檬酸钠0.8g/L、乙酸0.8%(v/v)、化工乙醇10%(v/v)。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基包括：葡萄糖5g/L、蛋白胨5g/L、酵母膏4g/L、KH2PO4 0.4g/L、硫酸铵0.4g/L、柠檬酸钠0.8g/L、乙酸1.5%(v/v)、化工乙醇10%(v/v)，消泡剂0.3% (v/v)。
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