CN103555638A

CN103555638A - 一种乙醇耐性产乙酸微生物复合菌及其用途

Info

Publication number: CN103555638A
Application number: CN201310569057.9A
Authority: CN
Inventors: 程辉彩; 习彦花; 张丽萍; 崔冠慧; 尹淑丽; 张根伟; 张飞燕; 董玉兰; 段普凡; 李书生
Original assignee: Institute of Biology of Hebei Academy of Sciences
Current assignee: Hebei green biochemical science and Technology Co., Ltd.
Priority date: 2013-11-15
Filing date: 2013-11-15
Publication date: 2014-02-05
Anticipated expiration: 2033-11-15
Also published as: CN103555638B

Abstract

本发明涉及一种乙醇耐性产乙酸微生物复合菌，其可应用于醇提中药药渣厌氧发酵，其包括保藏编号为ATCCBAA-990的甲醇醋酸杆菌（Acetobacteriumcarbinolicum）、保藏编号为ATCC25756的不规则梭菌(Clostridiumirregularic)、保藏编号为ATCC15832的产纤维二糖梭菌(Clostridiumcellobioparum)以及保藏编号为ATCC29797的乙二醇梭菌（Clostridiumglycolicum），并按一定比例复配而成。该复合菌可以有效解除醇提中药渣为原料进行厌氧消化时乙醇对沼气微生物的抑制作用，快速启动发酵并提高原料的沼气产气率，使生物质资源得到深度开发和循环利用，为中药企业节约大量资金，经济、社会效益和生态效益显著。

Description

一种乙醇耐性产乙酸微生物复合菌及其用途

技术领域

本发明涉及一种乙醇耐性产乙酸微生物复合菌，其可应用于醇提中药药渣厌氧发酵，属于厌氧发酵技术领域。

背景技术

随着中医药卫生产业的快速发展，中草药、中成药的应用日益广泛，中药渣废弃量日渐增加，其年排放量多达3000万吨，约占固废资源的11%。由于中药渣来源和配方的多样性，不同来源不同产品中所用药材差异很大，因而药渣的处理是一项复杂的工作。传统的焚烧、填埋、固定区域堆放等处理方法，不仅要投入大量的资金，而且也造成了资源浪费和严重的环境污染。

厌氧发酵是当前有机废弃物无害化、资源化、能源化处理的一种有效途径。醇提中药渣在中药渣中占很大比例，除了大量的粗纤维、粗脂肪，还含丰富的多糖、植物蛋白等多种有机质，采用厌氧消化处理，其丰富的营养物质可以为产甲烷微生物的大量繁殖提供营养基础，生产沼气，获得可观的经济效益。然而新鲜的醇提药渣中高浓度的乙醇含量对厌氧消化微生物会产生一定的抑制作用，导致发酵系统启动缓慢，产气率低，甚至无法启动，严重影响了中药渣的沼气资源化利用进程。

因此，筛选具有乙醇高耐受力，同时可以利用乙醇产生乙酸的复合微生物菌系，从而解决醇提药渣难启动的问题，使生物质资源得到深度开发和循环利用，为中药企业节约大量资金。同时对缓解能源危机、保护生态环境、减少疾病发生等方面都具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以解决新鲜醇提中药渣作为厌氧发酵原料时的乙醇抑制问题，同时将乙醇转化为乙酸，明显改善水解效率，增加产甲烷菌可利用底物，提高中药渣厌氧发酵沼气产气率，降低生产成本的高乙酸产生量的乙醇耐性产乙酸微生物复合菌。

本发明的目的还在于提供一种可明显改善水解效率，显著增加产甲烷菌可利用底物—乙酸，提高中药渣厌氧发酵沼气产气率，降低醇提中药药渣厌氧发酵生产成本的乙醇耐性产乙酸微生物复合菌的用途。

为了实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：

本发明的乙醇耐性产乙酸微生物复合菌包括保藏编号为ATCC BAA-990的甲醇醋酸杆菌（Acetobacterium carbinolicum）、保藏编号为ATCC 25756的不规则梭菌(Clostridium irregularic)、保藏编号为ATCC 15832的产纤维二糖梭菌(Clostridium cellobioparum)以及保藏编号为ATCC 29797的乙二醇梭菌（Clostridium glycolicum）；其中保藏编号为ATCC BAA-990的甲醇醋酸杆菌的菌数占所述复合菌总数的20～40%，保藏编号为ATCC 25756的不规则梭菌的菌数占所述复合菌总数的10～30%，保藏编号为ATCC 15832的产纤维二糖梭菌的菌数占所述复合菌总数的15～30%，保藏编号为ATCC 29797的乙二醇梭菌占所述复合菌总数的15～35%。

进一步的，本发明的乙醇耐性产乙酸微生物复合菌中的细菌总数不低于1.0×10¹⁰ cfu/mL。

进一步的，本发明的乙醇耐性产乙酸微生物复合菌采用下述组分制得的培养基进行培养：胰蛋白胨5.0～10.0 g/L，牛肉膏5.0～10.0 g/L，葡萄糖1.0～5.0 g/L，酵母浸粉1.0～5.0 g/L，可溶性淀粉 0.1～1.0 g/L，氯化钠 1.0～5.0 g/L，无水乙酸钠1.0～3.0 g/L，L-半胱氨酸盐酸盐 0.1～0.5 g/L，水1000 mL，pH 7.0±0.2。

进一步的，本发明的乙醇耐性产乙酸微生物复合菌在醇提中药药渣厌氧发酵中应用。

本发明的乙醇耐性产乙酸微生物复合菌的用途为将权利要求1～3中的任意一项所述的乙醇耐性产乙酸微生物复合菌接种于中药药渣厌氧发酵系统中进行发酵。

进一步的，本发明的乙醇耐性产乙酸微生物复合菌的用途，其特征在于所述发酵系统的初始有机负荷为6～8%（以VS计）；所述发酵系统的接种物为正常运行的中药渣厌氧发酵系统发酵液，接种量为所述反应器有效容积的25～30%（体积比）；向发酵系统中添加反应器有效容积的8～15%所述复合菌的菌液，菌液包括所述复合菌和培养基，菌液含细菌总数不低于1.0×10¹⁰cfu/mL。

进一步的，本发明的乙醇耐性产乙酸微生物复合菌的用途，其中所述的培养基包括下述组分：胰蛋白胨5.0～10.0 g/L，牛肉膏5.0～10.0 g/L，葡萄糖1.0～5.0 g/L，酵母浸粉1.0～5.0 g/L，可溶性淀粉 0.1～1.0 g/L，氯化钠 1.0～5.0 g/L，无水乙酸钠1.0～3.0 g/L，L-半胱氨酸盐酸盐 0.1～0.5 g/L，水1000 mL，pH 7.0±0.2。

本发明所述的甲醇醋酸杆菌（Acetobacterium carbinolicum）：细胞短杆状或椭圆，单生或成短链状，无芽孢，严格厌氧，可发酵乙醇、乙二醇等产乙酸。菌株保藏编号ATCC BAA-990。

本发明所述的不规则梭菌(Clostridium irregularic)：菌体呈杆状或略弯，产芽胞。专性厌氧。能利用多种碳源产乙酸。菌株保藏编号ATCC 25756。

本发明所述的产纤维二糖梭菌(Clostridium cellobioparum)：菌体杆状，稍弯曲，单个或成长链，严格厌氧，可水解纤维素产生纤维二糖、乙酸、甲酸等。菌株保藏编号ATCC 15832。

本发明所述的乙二醇梭菌（Clostridium glycolicum）：菌体杆状，单个或成长链，芽孢椭圆，革兰氏染色阳性，严格厌氧，可利用葡萄糖和碳水化合物产氢气、乙酸等。菌株保藏编号 ATCC 29797。

以上菌株均可通过美国典型培养物中心（ATCC）获得。

本发明所述的醇提中药药渣是指：以乙醇作为提取介质提取中药时产生的中药药渣。

本发明的积极效果为：在以醇提中药渣为原料的厌氧反应过程中，加入本发明的复合菌，可将乙醇快速转化为乙酸，不仅有效解除乙醇抑制，而且显著增加发酵系统中甲烷菌利用底物—乙酸含量，有效提高醇提中药渣厌氧发酵产沼气效率。

与现有技术相比，首先，醇提中药渣由于乙醇浓度含量过高，直接用于厌氧发酵很难快速启动发酵甚至无法启动，本发明利用添加高乙醇耐受乙酸产生微生物复合菌，可快速启动发酵。

其次，本发明采用的微生物为复合菌，除具有高乙醇耐受力外，还可高效利用乙醇转化为乙酸。显著增加产甲烷菌可利用底物，进而提高沼气产气率。

相对于单一菌株，该复合菌在厌氧发酵微生态环境中充分利用菌株间的互利互惠、各种代谢产物间的协同作用，来克服单菌种发酵及应用的缺点，具有更大的缓冲能力与环境适应能力。

因此，本发明的实现，不仅可以解决大量中药渣尤其是醇提药渣再利用和环境污染问题，而且对促进农业可持续发展、保护生态环境具有重要意义，有着切实的经济、社会效益和广阔的应用前景。

具体实施方式

在本发明中，保藏编号为ATCC BAA-990的甲醇醋酸杆菌、保藏编号为ATCC 25756的不规则梭菌、保藏编号为ATCC 15832的产纤维二糖梭菌以及保藏编号为ATCC 29797的乙二醇梭菌可以商购获得。

本发明涉及的四种菌的培养基的种类可以在很大范围内改变，可以为各种能够用于培养甲醇醋酸杆菌、不规则梭菌、产纤维二糖梭菌和乙二醇梭菌的培养基，例如，可以为强化梭菌培养基RCM，也可以为本发明所公开的培养基，当采用本发明所公开的培养基进行培养时，可适应上述四种菌的生长要求，生长效率快。所述强化梭菌培养基RCM为本领域技术人员所公知。

本发明各实施例的复合菌的制备方法为：分别培养甲醇醋酸杆菌、不规则梭菌、产纤维二糖梭菌和乙二醇梭菌，再按照比例进行混合。

本发明中甲醇醋酸杆菌、不规则梭菌、产纤维二糖梭菌和乙二醇梭菌的培养方法为本领域技术人员所公知。

本发明复合菌的制备方法中所述的混合条件没有特别的限制，只要能够使得到的复合菌满足以下条件即可：保藏编号为ATCC BAA-990的甲醇醋酸杆菌的菌数占所述复合菌总数的20～40%，保藏编号为ATCC 25756的不规则梭菌的菌数占所述复合菌总数的10～30%，保藏编号为ATCC 15832的产纤维二糖梭菌的菌数占所述复合菌总数的15～30%，保藏编号为ATCC 29797的乙二醇梭菌占所述复合菌总数的15～35%。

本发明的复合菌可以进一步制作成菌剂。所述的菌剂，包括复合菌和培养基。

本发明各实施例的醇提中药药渣厌氧发酵的方法，实验装置采用5 L全混式厌氧发酵系统，以新鲜醇提中药渣为原料，设计厌氧消化的初始有机负荷VS含量为6～8%（VS即挥发性固体，指总固体中能在550 ℃高温下挥发的那部分固体，代表原料中可通过生物降解的有机物含量水平）；接种物采用正常运行的中药渣厌氧发酵系统发酵液，设计接种量25～30%（体积比）；处理组向发酵系统中添加反应器有效容积5～15%的复合菌液，菌液含细菌总数≥1.0×10¹⁰ cfu/mL；对照组添加等体积的空白培养基。用自来水补充发酵料液总体积为4.0 L，进行序批式中温（35±1℃）厌氧发酵，发酵周期为30 d。产沼气情况如下：厌氧消化系统于第3～5 d启动发酵，比对照组缩短8～12 d达产气峰值并稳定运行，25 d后气量迅速降低。发酵过程中甲烷百分含量（指甲烷在所产混合气体中的体积百分含量）在55～65%之间，原料平均产气率（指平均每消化1 gVS所产生的混合气体积）为0.26～0.30 L/gVS。

下面，通过实施例对本发明进行更加详细的说明，但是不作为对本发明的限制。

实施例1

一种乙醇耐性产乙酸微生物复合菌，包括保藏编号为ATCC BAA-990的甲醇醋酸杆菌、保藏编号为ATCC 25756的不规则梭菌、保藏编号为ATCC 15832的产纤维二糖梭菌以及保藏编号为ATCC 29797的乙二醇梭菌。

上述各种微生物在复合菌中的细菌数含量分别为：甲醇醋酸杆菌占35%、不规则梭菌占12%、产纤维二糖梭菌占25%、乙二醇梭菌占28%。

厌氧发酵产沼气试验：实验装置采用5 L全混式厌氧发酵系统，以新鲜醇提中药渣为原料，设计厌氧消化的初始有机负荷为6～8%（以VS计）；接种物采用正常运行的中药渣厌氧发酵系统发酵液，设计接种量25～30%（体积比）。

实验设6个处理，具体见表1，分别为对照、添加单一菌和复合菌。具体如下：添加中药渣后，处理组添加反应器有效容积10%的单一菌或实施例1制得的复合菌液，原接种菌液含细菌总数≥1.0×10¹⁰ cfu/mL，对照组添加等体积的空白培养基。用自来水补充发酵料液总体积为4.0 L，进行序批式中温（35±1℃）厌氧发酵，发酵周期为30 d。具体结果见表2，添加复合菌的处理发酵启动时间为3～5 d，添加甲醇醋酸杆菌的处理发酵启动时间为7～9 d，其他几个处理发酵启动时间均大于10 d。说明添加复合菌的处理可以有效缩短发酵启动时间。同时，添加复合菌的处理平均甲烷含量和沼气产量也显著高于对照和添加单一菌的处理，进一步说明添加复合菌的处理确实可有效提高醇提中药渣厌氧发酵效率和沼气产气率。

表1 实验设计。

表2 实验结果

实施例2～8

上述各种微生物在复合菌中的细菌数含量分别见表3。

厌氧发酵产沼气试验：实验装置采用5 L全混式厌氧发酵系统，以新鲜醇提中药渣为原料，设计厌氧消化的初始有机负荷为6～8%（以VS计）；接种物采用正常运行的中药渣厌氧发酵系统发酵液，设计接种量25～30%（体积比）；

添加中药渣后，处理组添加反应器有效容积5～15%的复合菌液，菌液含细菌总数≥1.0×10¹⁰ cfu/mL；对照组添加等体积的空白培养基。用自来水补充发酵料液总体积为4.0 L，进行序批式中温（35±1℃）厌氧发酵，发酵周期为30 d。具体结果见表4：添加复合菌厌氧消化系统于第3～5 d启动发酵，比对照提前8～12 d达产气峰值后稳定运行，25 d后产气量迅速降低。添加复合菌后，发酵过程中甲烷百分含量（指甲烷在所产混合气体中的体积百分含量）在55～65%之间，明显高于对照。添加复合菌的原料平均产气率（指平均每消化1 gVS所产生的混合气体积）为0.26～0.30 L/gVS，而对照为0.17～0.19 L/gVS。

表3 实施例2～8的复合菌组成。

表4 实施例2～8对中药渣厌氧发酵产沼气的影响

Claims

1.一种乙醇耐性产乙酸微生物复合菌，其特征在于：所述复合菌包括保藏编号为ATCC BAA-990的甲醇醋酸杆菌、保藏编号为ATCC 25756的不规则梭菌、保藏编号为ATCC 15832的产纤维二糖梭菌以及保藏编号为ATCC 29797的乙二醇梭菌；其中保藏编号为ATCC BAA-990的甲醇醋酸杆菌的菌数占所述复合菌总数的20～40%，保藏编号为ATCC 25756的不规则梭菌的菌数占所述复合菌总数的10～30%，保藏编号为ATCC 15832的产纤维二糖梭菌的菌数占所述复合菌总数的15～30%，保藏编号为ATCC 29797的乙二醇梭菌占所述复合菌总数的15～35%。

2.根据权利要求1所述的乙醇耐性产乙酸微生物复合菌，其特征在于所述复合菌中的细菌总数不低于1.0×10¹⁰ cfu/mL。

3.根据权利要求1所述的乙醇耐性产乙酸微生物复合菌，其特征在于采用下述组分制得的培养基进行培养：胰蛋白胨5.0～10.0 g/L，牛肉膏5.0～10.0 g/L，葡萄糖1.0～5.0 g/L，酵母浸粉1.0～5.0 g/L，可溶性淀粉 0.1～1.0 g/L，氯化钠 1.0～5.0 g/L，无水乙酸钠1.0～3.0 g/L，L-半胱氨酸盐酸盐 0.1～0.5 g/L，水1000 mL，pH 7.0±0.2。

4.根据权利要求1～3的任意一项所述的乙醇耐性产乙酸微生物复合菌，其特征在于其在醇提中药药渣厌氧发酵中应用。

5.一种乙醇耐性产乙酸微生物复合菌的用途，其特征在于将权利要求1～3中的任意一项所述的乙醇耐性产乙酸微生物复合菌接种于中药药渣厌氧发酵系统中进行发酵。

6.根据权利要求5所述的乙醇耐性产乙酸微生物复合菌的用途，其特征在于所述发酵系统的初始有机负荷为6～8%（以VS计）；所述发酵系统的接种物为正常运行的中药渣厌氧发酵系统发酵液，接种量为所述发酵系统有效容积的25～30%（体积比）；向发酵系统中添加反应器有效容积的8～15%所述复合菌的菌液，菌液包括所述复合菌和培养基，菌液含细菌总数不低于1.0×10¹⁰ cfu/mL。

7.根据权利要求6所述的乙醇耐性产乙酸微生物复合菌的用途，其特征在于所述的培养基包括下述组分：胰蛋白胨5.0～10.0 g/L，牛肉膏5.0～10.0 g/L，葡萄糖1.0～5.0 g/L，酵母浸粉1.0～5.0 g/L，可溶性淀粉 0.1～1.0 g/L，氯化钠 1.0～5.0 g/L，无水乙酸钠1.0～3.0 g/L，L-半胱氨酸盐酸盐 0.1～0.5 g/L，水1000 mL，pH 7.0±0.2。