CN101948752B

CN101948752B - 一种用于沼气发酵的复合菌剂

Info

Publication number: CN101948752B
Application number: CN2010102482797A
Authority: CN
Inventors: 王彦杰; 王伟东; 戚桂娜; 高亚梅; 张波; 荆瑞勇
Original assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Current assignee: Heilongjiang haoqian Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2010-08-05
Filing date: 2010-08-05
Publication date: 2011-12-14
Anticipated expiration: 2030-08-05
Also published as: CN101948752A

Abstract

一种用于沼气发酵的复合菌剂。它涉及一种微生物发酵菌液的复合制剂。本发明解决了目前缺少适用于以牛粪为主要原料进行沼气发酵的菌剂及适用于大中型沼气发酵工程的菌剂的问题。该复合菌剂按重量份数比包括8～15份溶纤维素拟杆菌发酵液、12～20份巴氏芽孢梭菌发酵液、30～45份黑海甲烷袋状菌发酵液及20～50份马氏甲烷八叠球菌发酵液；以上四种菌的发酵液中的有效活菌数均为10 ⁹个/ml以上。本发明的复合菌剂针对以牛粪为主要原料的沼气发酵能够有效地提前的产气时间、提高产气量及产甲烷量。

Description

一种用于沼气发酵的复合菌剂

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种微生物发酵菌液的复合制剂。

背景技术

生物质能一直是人类赖以生存的重要能源，是仅次于煤炭、石油和天然气而居于世界能源消费总量的第四位的能源。沼气在生物质能领域占有很重要地位，而沼气发酵技术也是生物质能转化中最重要的技术之一。沼气发酵又称为厌氧消化、厌氧发酵，是指有机物质在一定的水分、温度和厌氧条件下，通过各类微生物的分解代谢，最终形成甲烷和二氧化碳等可燃性混合气体(沼气)的过程。可用于沼气发酵的有机物通常有农作物秸杆、杂草、动物粪便、食物残渣、纸浆、市政垃圾及工农业有机废水等。因此，沼气发酵技术在能够为我们提供清洁能源的同时，更有利于环境的保护。

目前，沼气发酵存在着初次发酵启动时间慢、产气量低等问题。其主要原因之一是传统的沼气发酵技术所利用的菌种是自然界中自然存在的菌群，其产气能力通常较低、产气时间较晚。为此，人们开始寻找产气时间早、产气能力高的菌种并进行多菌种的优化组合。专利号为200810140400.7“一种沼气池用复合微生物菌剂及其制备方法”的中国专利公开了一种将荧光假单胞杆菌、蜡质芽孢杆菌、枯草芽胞杆菌及环状芽孢杆菌的发酵液混合制成的复合菌剂，该复合菌剂适用于小型农村用户沼气池，是以秸杆为主要原料进行发酵，发酵温度为9℃以上，属于非恒温发酵，该复合菌液可以缩短沼气发酵的启动时间、提高产气量。公开号为CN101475926的“一种厌氧降解纤维素产甲烷复合菌”的专利申请公开了一种分属于兼性厌氧及严格厌氧的发酵性细菌、产氢产乙酸细菌及产甲烷菌的13株菌的发酵液混合制备出的复合菌剂，该复合菌剂在以稻草、秸杆为主要原料进行发酵时，能够得到较好的效果，即可以提高甲烷产率及纤维素的降解率，但其未对该复合菌剂使用时的发酵温度进行说明。而目前尚未见有用于加快和提高以牛粪为主要原料进行沼气发酵的启动时间及产气量的菌剂。

目前，国外的沼气生产技术多已达到商业化应用程度，基本实现了规模化产业经营。而在国内，具有一定规模的大、中型沼气工程还处于起步阶段。大、中型沼气工程的发酵温度多为恒定温度，且要求菌剂的发酵启动时间短、产气能力强，而现有报导的各类用于沼气发酵的菌剂大多只适用于农民用户所使用的小型沼气发酵池，而无法应用于规模化的发酵工程。目前尚未见有适用于大、中型沼气工程的发酵菌剂的报导。

发明内容

本发明的目的是为了解决目前缺少适用于以牛粪为主要原料进行沼气发酵的菌剂及适用于大中型沼气发酵工程的菌剂的问题，而提供一种用于沼气发酵的复合菌剂。

该用于沼气发酵的复合菌剂按重量份数比包括8～15份溶纤维素拟杆菌(Bacteroides cellulosolvens)发酵液、12～20份巴氏芽孢梭菌(Clostridiumpasteurianum)发酵液、30～45份黑海甲烷袋状菌(Methanoculleus marisnigri)发酵液及20～50份马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)发酵液；以上四种菌的发酵液中的有效活菌数均为10⁹个/mL以上。

按照微生物在发酵过程中所起到的不同作用，沼气的发酵过程可分为有机物降解阶段和甲烷生成阶段。有机物降解阶段主要是指有机废物在微生物的作用下水解和酸化，该阶段尚未产生出甲烷，在这个阶段起主要作用的微生物统称为不产甲烷菌；甲烷生成阶段主要是指一群生理上高度专业化的古细菌在厌氧条件下将不产烷菌的代谢产物转化为甲烷，在这个阶段起主要作用的微生物统称为产甲烷菌。

本发明的复合菌剂中的溶纤维素拟杆菌(Bacteroides cellulosolvens)及巴氏芽孢梭菌(Clostridium pasteurianum)属于不产甲烷菌。其中，溶纤维素拟杆菌(Bacteroides cellulosolvens)在厌氧发酵过程中能将纤维素降解成双糖或单糖并使其溶于水中，该菌种保藏于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)，保藏号DSM No.2933；巴氏芽孢梭菌(Clostridium pasteurianum)能够利用糖类物质产生H₂、CO₂、乳酸、乙酸、丁酸、乙醇及丁醇等物质，该菌种保藏于美国标准菌种收藏所(ATCC)，保藏号ATCC No.6013。

本发明的复合菌剂中的黑海甲烷袋状菌(Methanoculleus marisnigri)及马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)属于产甲烷菌。其中，黑海甲烷袋状菌(Methanoculleus marisnigri)能够利用甲酸钠及巴氏芽孢梭菌(Clostridiumpasteurianum)的代谢产物即H₂和CO₂产生甲烷，该菌种保藏于美国标准菌种收藏所(ATCC)，保藏号ATCC No.35101；马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinamazei)，可以利用甲醇及甲酸钠及巴氏芽孢梭菌(Clostridium pasteurianum)的代谢产物即H₂、CO₂、乙酸、乙醇等产生甲烷，该菌种保藏于美国标准菌种收藏所(ATCC)，保藏号ATCC No.43340。

以上四个菌种均可以通过其相应的保藏机构购买获得。

本发明的复合菌剂中的四个菌种在整个沼气发酵过程中通过能够协同作用，溶纤维素拟杆菌(Bacteroides cellulosolvens)及巴氏芽孢梭菌(Clostridiumpasteurianum)的发酵产物能够作为黑海甲烷袋状菌(Methanoculleusmarisnigri)及马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)的发酵底物，从而在整个沼气发酵过程中形成了一个微生物代谢产物链，实现了沼气发酵菌种的优化组合。

本发明的复合菌剂在实际应用中，将其接种于以TS(总固体浓度)为8～10％的牛粪为主要原料的沼气发酵罐中，进行35℃厌氧发酵，日产气率高峰期出现在第4天，其峰值为1.6～2.0m³·m^-3·d^-1，甲烷产气率高峰期出现在第5～8天，其峰值为0.7～0.8m³·m^-3·d^-1；而以自然发酵的沼气池中的沼液为接种物的对照组，其日产气率高峰期一般出现在第9～13天，其峰值为1.0～1.5m³·m^-3·d^-1，甲烷产气率高峰期出现在第11天以后，其峰值为0.5～0.6m³·m^-3·d^-1。在沼气发酵的30天内，相对于以自然发酵的沼气池中的沼液为接种物的对照组，接种本发明的复合菌剂的发酵罐可提高平均日产气率20％～22.8％，提高平均甲烷日产气率22.2％～27.8％。以上数据可以说明，本发明的复合菌剂针对以牛粪为主要原料的沼气发酵能够有效地提前的产气时间、提高产气量及产甲烷量。并且本复合菌剂的发酵条件为35℃恒温发酵，因此适用于发酵温度恒定的大中型沼气发酵工程。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的用于沼气发酵的复合菌剂按重量份数比由8份溶纤维素拟杆菌(Bacteroides cellulosolvens)发酵液、12份巴氏芽孢梭菌(Clostridium pasteurianum)发酵液、30份黑海甲烷袋状菌(Methanoculleusmarisnigri)发酵液及20份马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)发酵液组成；以上四种菌的发酵液中的有效活菌数均为10⁹个/mL以上。

该复合菌剂的制备方法的步骤如下：

(一)菌种的活化：将保藏的溶纤维素拟杆菌(Bacteroides cellulosolvens)、巴氏芽孢梭菌(Clostridium pasteurianum)、黑海甲烷袋状菌(Methanoculleusmarisnigri)及马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)分别接种到装有活化培养基的厌氧管中，然后用6×10^-2pa的真空泵抽真空后将纯度为99.999％的氮气充入厌氧管中，反复抽真空和充入氮气，直至加入指示剂树脂刃天青的活化培养基变为无色为止；所述的活化培养基每升中含NH₄Cl1～2g，MgCl₂1～2g，K₂HPO₄0.3～0.5g，KH₂PO₄0.3～0.5g，酵母膏1～2g，0.1％树脂刃天青15～25mL，微量元素液8～12mL，余量为水；所述的微量元素液每升中含MgSO₄·7H₂O 3.0～3.5mg，CoCl₂0.1～0.2mg，MnSO₄·2H₂O 0.3～0.5mg，CaCl₂·H₂O 0.1～0.3mg，ZnSO₄·7H₂O 0.1～0.2mg，NaCl 0.8～1.2mg，FeSO₄·7H₂O 0.1～0.3mg，CuSO₄·5H₂O 0.01～0.02mg，AlK(SO₄)20.01～0.02mg，H₃BO₃0.01～0.02mg，NaMoO₄·2H₂O 0.01～0.02mg，余量为水。

(二)菌种的扩大培养：将步骤(一)中经活化的四个菌种分别接种于增殖培养基中，在30～35℃的厌氧瓶或厌氧发酵罐中分别逐级厌氧扩大培养，扩大培养过程中按5～10％的体积比转接，增殖培养基的pH值为6.0～7.0，当发酵液中有效活菌数达到10⁹个/mL时终止培养；所述的增殖培养基每升中含NH₄Cl 1～2g，MgCl₂1～2g，K₂HPO₄0.3～0.5g，KH₂PO₄0.3～0.5g，酵母膏1～2g，微量元素液8～12mL，余量为水；所述的微量元素液每升中含MgSO₄·7H₂O 3.0～3.5mg，CoCl₂0.1～0.2mg，MnSO₄·2H₂O 0.3～0.5mg，CaCl₂·H₂O0.1～0.3mg，ZnSO₄·7H₂O 0.1～0.2mg，NaCl 0.8～1.2mg，FeSO₄·7H₂O 0.1～0.3mg，CuSO₄·5H₂O 0.01～0.02mg，AlK(SO₄)20.01～0.02mg，H₃BO₃0.01～0.02mg，NaMoO₄·2H₂O 0.01～0.02mg，余量为水。

(三)复合菌剂的制备：将步骤(二)中得到的四个菌种的发酵液按所述的重量份数比混合后即得到本实施方式的复合菌剂。

将本实施方式的复合菌剂接种于以TS(总固体浓度)为8～10％的牛粪为主要原料的沼气发酵罐中，35℃厌氧发酵，日产气率高峰期出现在第4天，其峰值为1.6m³·m^-3·d^-1，甲烷产气率高峰期出现在第6天，其峰值为0.7m³·m^-3·d^-1；而以自然发酵的沼气池中的沼液为接种物的对照组，其日产气率高峰期出现在第9天，其峰值为1.0m³·m^-3·d^-1，甲烷产气率高峰期出现在第12天，其峰值为0.5m³·m^-3·d^-1。在沼气发酵30天内，相对于对照组，接种本发明的复合菌剂的发酵罐可提高平均日产气率21.5％，提高平均甲烷日产气率22.2％。以上数据可以说明，本实施方式的复合菌剂针对以牛粪为主要原料的沼气发酵能够有效地提前的产气时间、提高产气量及产甲烷量，适用于发酵温度恒定的大中型沼气发酵工程。

具体实施方式二：本实施方式的用于沼气发酵的复合菌剂按重量份数比由15份溶纤维素拟杆菌(Bacteroides cellulosolvens)发酵液、20份巴氏芽孢梭菌(Clostridium pasteurianum)发酵液、45份黑海甲烷袋状菌(Methanoculleusmarisnigri)发酵液及20～50份马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)发酵液组成；以上四种菌的发酵液中的有效活菌数均为10⁹个/mL以上。本实施方式的复合菌剂的制备方法与具体实施方式一相同。

将本实施方式的复合菌剂接种于以TS(总固体浓度)为8～10％的牛粪为主要原料的沼气发酵罐中，35℃厌氧发酵，日产气率高峰期出现在第5天，其峰值为1.9m³·m^-3·d^-1，甲烷产气率高峰期出现在第8天，其峰值为0.8m³·m^-3·d^-1；而以自然发酵的沼气池中的沼液为接种物的对照组，其日产气率高峰期出现在第10天，其峰值为1.5m³·m^-3·d^-1，甲烷产气率高峰期出现在第14天，其峰值为0.54m³·m^-3·d^-1。沼气发酵30天内，相对于对照组，接种本发明的复合菌剂的发酵罐可提高平均日产气率20％，提高平均甲烷日产气率25.4％。以上数据可以说明，本发明的复合菌剂针对以牛粪为主要原料的沼气发酵能够有效地提前的产气时间、提高产气量及产甲烷量。

具体实施方式三：本实施方式的用于沼气发酵的复合菌剂按重量份数比由11份溶纤维素拟杆菌(Bacteroides cellulosolvens)发酵液、16份巴氏芽孢梭菌(Clostridium pasteurianum)发酵液、38份黑海甲烷袋状菌(Methanoculleusmarisnigri)发酵液及35份马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)发酵液组成；以上四种菌的发酵液中的有效活菌数均为10⁹个/mL以上。本实施方式的复合菌剂的制备方法与具体实施方式一相同。

将本实施方式的复合菌剂接种于以TS(总固体浓度)为8～10％的牛粪为主要原料的沼气发酵罐中，35℃厌氧发酵，日产气率高峰期出现在第4天，其峰值为2.0m³·m^-3·d^-1，甲烷产气率高峰期出现在第5天，其峰值为0.73m³·m^-3·d^-1；而以自然发酵的沼气池中的沼液为接种物的对照组，其日产气率高峰期出现在第13天，其峰值为1.2m³·m^-3·d^-1，甲烷产气率高峰期出现在第12天，其峰值为0.6m³·m^-3·d^-1。在沼气发酵30天内，相对于对照组，接种本发明的复合菌剂的发酵罐可提高平均日产气率22.8％，提高平均甲烷日产气率27.8％。以上数据可以说明，本发明的复合菌剂针对以牛粪为主要原料的沼气发酵能够有效地提前的产气时间、提高产气量及产甲烷量。

具体实施方式四：本实施方式的用于沼气发酵的复合菌剂按重量份数比由9份溶纤维素拟杆菌(Bacteroides cellulosolvens)发酵液、13份巴氏芽孢梭菌(Clostridium pasteurianum)发酵液、32份黑海甲烷袋状菌(Methanoculleusmarisnigri)发酵液、25份马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)发酵液及15份的甘油组成；以上四种菌的发酵液中的有效活菌数均为10⁹个/mL以上。本实施方式的制备方法与具体实施方式一的不同之处在于最后向复合菌剂中加入所述重量比的甘油并混合，其他步骤均与具体实施方式一相同。甘油的作用是使复合菌剂隔绝空气及调节渗透压。

具体实施方式五：本实施方式的用于沼气发酵的复合菌剂按重量份数比由14份溶纤维素拟杆菌(Bacteroides cellulosolvens)发酵液、19份巴氏芽孢梭菌(Clostridium pasteurianum)发酵液、43份黑海甲烷袋状菌(Methanoculleusmarisnigri)发酵液、45份马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)发酵液及20份的甘油组成；以上四种菌的发酵液中的有效活菌数均为10⁹个/mL以上。本实施方式的制备方法与具体实施方式四相同。

Claims

1.一种用于以牛粪为主要原料进行沼气发酵的复合菌剂，其特征在于：该复合菌剂按重量份数比由8～15份溶纤维素拟杆菌(Bacteroidescellulosolvens)保藏号DSM No.2933发酵液、12～20份巴氏芽孢梭菌(Clostridium pasteurianum)保藏号ATCC No.6013发酵液、30～45份黑海甲烷袋状菌(Methanoculleus marisnigri)保藏号ATCC No.35101发酵液及20～50份马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)保藏号ATCC No.43340发酵液组成；以上四种菌的发酵液中的有效活菌数均为10⁹个/mL以上。

2.根据权利要求1所述的一种用于以牛粪为主要原料进行沼气发酵的复合菌剂，其特征在于：该复合菌剂按重量份数比由9～14份溶纤维素拟杆菌(Bacteroides cellulosolvens)发酵液、13～19份巴氏芽孢梭菌(Clostridiumpasteurianum)发酵液、32～43份黑海甲烷袋状菌(Methanoculleus marisnigri)发酵液及25～45份马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)发酵液组成；以上四种菌的发酵液中的有效活菌数均为10⁹个/mL以上。

3.一种用于以牛粪为主要原料进行沼气发酵的复合菌剂，其特征在于：该复合菌剂按重量份数比由8～15份溶纤维素拟杆菌(Bacteroidescellulosolvens)保藏号DSM No.2933发酵液、12～20份巴氏芽孢梭菌(Clostridium pasteurianum)保藏号ATCC No.6013发酵液、30～45份黑海甲烷袋状菌(Methanoculleus marisnigri)保藏号ATCC No.35101发酵液、20～50份马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)保藏号ATCC No.43340发酵液及15～20份的甘油组成；以上四种菌的发酵液中的有效活菌数均为10⁹个/mL以上。

4.根据权利要求3所述的一种用于以牛粪为主要原料进行沼气发酵的复合菌剂，其特征在于：该复合菌剂按重量份数比由9～14份溶纤维素拟杆菌(Bacteroides cellulosolvens)发酵液、13～19份巴氏芽孢梭菌(Clostridiumpasteurianum)发酵液、32～43份黑海甲烷袋状菌(Methanoculleus marisnigri)发酵液、25～45份马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)发酵液及15～20份的甘油组成；以上四种菌的发酵液中的有效活菌数均为10⁹个/mL以上。