CN104862259A - 高有机负荷中温沼气发酵复合菌剂、其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高有机负荷中温沼气发酵复合菌剂，属于生物发酵技术领域。该复合菌剂含有中温互营丙酸氧化菌和中温互营丁酸/戊酸氧化菌，所述中温互营丙酸氧化菌与中温互营丁酸/戊酸氧化菌的细胞数量比为6～9∶4～1，细胞总浓度≥1×109个/mL。本发明还提供了一种上述高有机负荷中温沼气发酵复合菌剂的制备方法。在高有机负荷沼气发酵系统中添加本发明复合菌剂，可避免挥发性脂肪酸抑制，提高沼气发酵系统在高有机负荷条件下运行的稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及一种高有机负荷中温沼气发酵复合菌剂及其制备方法和用途，属于生物发酵技术领域。
背景技术
沼气发酵已被广泛用于处理各种有机废弃物，包括农作物秸秆、畜禽养殖废弃物、轻工业废水废渣、生活有机垃圾、污水污泥等，获得较为清洁的沼气能源以及沼渣、沼液等有机肥。据相关部门统计，我国累计建成户用沼气池4500万个、大中型沼气工程2.26万处、养殖小区和联户沼气工程1.99万处、秸秆沼气示范工程50处。其中，大部分沼气工程至今无法盈利运行。
德国沼气工程的容积有机负荷较高，一般在2.5-5.0kgVS/(m3.d)，对应的池容产气率为1.3-2.5m3/(m3.d)；而我国沼气工程的容积有机负荷相对较低，一般在1.2-1.5kgVS/(m3.d)，对应的池容产气率仅为0.5-0.6m3/(m3.d)。当日处理原料量相同时，我国的沼气工程规模是德国沼气工程规模的2～3倍；当沼气工程规模相同时，我国沼气工程的日产气量仅为德国沼气工程日产气量的1/4～1/2。
现有沼气工程一般在低有机负荷条件下运行，虽然能够保证沼气发酵系统的稳定，但无法兼顾效率，造成反应器体积资源的浪费，使得工程整体经济性较差。而高有机负荷厌氧发酵系统容易超过系统微生物的最大承受能力，导致大量的微生物停止生长或死亡，从而使系统崩溃、酸化，造成沼气发酵失败，尤其对于果蔬垃圾、农产品加工废弃物、餐厨垃圾等易腐原料的发酵系统。
发明人以餐厨垃圾为原料考察不同有机负荷条件下对沼气发酵池容产气率和稳定性的影响，结果表明，有机负荷升高到5.588kgVS/(m3.d)时，池容产气率最高可达4.41m3/(m3.d)，然而，当有机负荷继续升高时(6.0～8.4kgVS/(m3.d))，沼气发酵系统产生大量挥发性有机脂肪酸，包括乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸，由于遭受严重的挥发性有机酸抑制，尤其是丙酸抑制，池容产气率逐渐显著下降。其中挥发性脂肪酸和丙酸浓度分别最高达到8738mg/L和2864mg/L(Dong Li,Yongming Sun,Yanfeng Guo,Zhenhong Yuan,Yao Wang,Feng Zhen.Continuousanaerobic digestion of food waste and design of digester with lipid removal,Environmental Technology,2013,34:13-14,2135-2143)。在众多挥发性脂肪酸中，乙酸是产甲烷的直接底物，丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸、2-甲基丁酸需要先氧化为乙酸+CO2+H2，才能够被氢营养型产甲烷菌(利用CO2+H2产甲烷)和乙酸营养型产甲烷菌(利用乙酸产甲烷)产生甲烷。因此，丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸、2-甲基丁酸等的氧化降解往往成为高有机负荷沼气发酵过程的限速步骤。因此，提供一种可氧化降解挥发性脂肪酸的菌剂，从而提高中温沼气发酵系统在高有机负荷条件下运行的稳定性是当前研究的热点。
发明内容
本发明的主要目的在于克服现有技术中大量挥发性有机脂肪酸难于被降解，从而影响中温沼气发酵系统在高有机负荷条件下运行的稳定性的问题，提供了一种高有机负荷中温沼气发酵复合菌剂，该复合菌剂主要用于强化中温沼气发酵系统中的挥发性脂肪酸(丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸、2-甲基丁酸等)氧化降解为乙酸+CO2+H2，避免挥发性脂肪酸抑制，提高中温沼气发酵系统在高有机负荷条件下运行的稳定性。
为了解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案实现。
高有机负荷中温沼气发酵复合菌剂，该复合菌剂含有中温互营丙酸氧化菌和中温互营丁酸/戊酸氧化菌；所述中温互营丙酸氧化菌是一类能够在中温条件下，与氢或甲酸营养型产甲烷菌互营共生降解丙酸的细菌，它能够将丙酸氧化降解为乙酸+CO2+H2，其中，CO2+H2能够被氢营养型产甲烷菌直接利用产甲烷，乙酸能够被乙酸营养型产甲烷菌直接利用产甲烷，所述中温互营丙酸氧化菌包括Pelotomaculumpropionicicum、Pelotomaculum schinkii、互营杆菌(Syntrophobacter sulfatireducens)、互营杆菌(Syntrophobacter fumaroxidans)、互营杆菌(Syntrophobacter pfennigii)、沃氏互营杆菌(Syntrophobacter wolinii)的一种或多种任意组合，六种菌的基本特征如表1所示；所述中温互营丁酸/戊酸氧化菌是一类能够在中温条件下，与氢或甲酸营养型产甲烷菌互营共生降解正丁酸、异丁酸、正戊酸、2-甲基丁酸的细菌，它能够将正丁酸、异丁酸氧化降解为乙酸、将正戊酸、2-甲基丁酸氧化降解为丙酸和乙酸，其中，丙酸又能够被所述的互营丙酸氧化菌氧化降解为乙酸+CO2+H2，所述中温互营丁酸/戊酸氧化菌包括沃氏互营单胞菌(Syntrophomonas wolfei subsp.Wolfei)、互营单胞菌(Syntrophomonas curvata)、互营单胞菌(Syntrophomonas bryantii)、互营单胞菌(Syntrophomonas erecta subsp.Erecta)、互营单胞菌(Syntrophomonas palmitatica)、嗜酸互营菌(Syntrophus aciditrophicus)的一种或多种任意组合，六种菌的基本特征如表2所示；所述中温互营丙酸氧化菌与中温互营丁酸/戊酸氧化菌的细胞数量比为6～9∶4～1，且所述中温互营丙酸氧化菌和中温互营丁酸/戊酸氧化菌的细胞总浓度≥1×109个/mL。
本发明还提供了一种上述高有机负荷中温沼气发酵复合菌剂的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)分别将中温互营丙酸氧化菌和中温互营丁酸/戊酸氧化菌培养成菌液，在厌氧条件下混合得到复合菌液；
(2)对步骤(1)得到的复合菌液进行细胞计数，并依据计数结果对其浓缩至细胞总浓度≥1×109个/mL，其中中温互营丙酸氧化菌与中温互营丁酸/戊酸氧化菌的细胞数量比为6～9∶4～1；
(3)封装，2～8℃保存，得到复合菌剂。
所述中温互营丙酸氧化菌菌液的制备方法是，采用保藏在德国菌种保藏中心编号为DSM No.15578的Pelotomaculum propionicicum、编号为DSM No.15200的Pelotomaculum schinkii、编号为DSM No.16706的Syntrophobacter sulfatireducens、编号为DSM No.10017的Syntrophobacter fumaroxidans、编号为DSM No.10092的Syntrophobacter pfennigii、编号为DSM No.2805的Syntrophobacter wolinii作为接种中温互营丙酸氧化菌，分别单独在厌氧条件下接种于中温互营丙酸氧化菌培养基中，然后分别单独在厌氧条件下逐级扩大培养得到中温互营丙酸氧化菌单一菌液，每一种中温互营丙酸氧化菌单一菌液均可直接作为中温互营丙酸氧化菌菌液，也可将六种中温互营丙酸氧化菌单一菌液的两种或多种在厌氧条件下任意比例混合成中温互营丙酸氧化菌菌液。
所述中温互营丙酸氧化菌菌液的制备方法中，Pelotomaculum propionicicum的优选培养基为德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.960的培养基配方，每一级的优选培养温度为37℃，培养时间为14～20天；Pelotomaculum schinkii的优选培养基为德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.960的培养基配方，每一级的优选培养温度为37℃，培养时间为14～20天；Syntrophobacter sulfatireducens的优选培养为德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.212的培养基配方，每一级的优选培养温度为37℃，培养时间为14～20天；Syntrophobacter fumaroxidans的优选培养基为德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.684的培养基配方，每一级的优选培养温度为37℃，培养时间为14～20天；Syntrophobacter pfennigii的优选培养基为德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.706的培养基配方，每一级的优选培养温度为37℃，培养时间为14～20天；Syntrophobacter wolinii的优选培养基为德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.212的培养基配方，每一级的优选培养温度为35℃，培养时间为14～20天。
所述中温互营丁酸/戊酸氧化菌菌液的制备方法是，采用保藏在德国菌种保藏中心编号为DSM No.2245B的Syntrophomonas wolfei subsp.Wolfei、编号为DSM No.15682的Syntrophomonas curvata、保藏在德国菌种保藏中心编号为DSM No.3014B的Syntrophomonas bryantii、保藏在德国菌种保藏中心编号为DSM No.16215的Syntrophomonas erecta subsp.Erecta、编号为DSM No.18709的Syntrophomonaspalmitatica、保藏在德国菌种保藏中心编号为DSM No.26646的Syntrophusaciditrophicus作为接种中温互营丁酸/戊酸氧化菌，分别单独在厌氧条件下接种于中温互营丁酸/戊酸氧化菌培养基中，然后分别单独在厌氧条件下逐级扩大培养得到中温互营丁酸/戊酸氧化菌单一菌液，每一种中温互营丁酸/戊酸氧化菌单一菌液均可直接作为中温互营丁酸/戊酸氧化菌菌液，也可将六种中温互营丁酸/戊酸氧化菌单一菌液的两种或多种在厌氧条件下任意比例混合成中温互营丁酸/戊酸氧化菌菌液。
所述中温互营丁酸/戊酸氧化菌菌液的制备方法中，Syntrophomonas wolfei subsp.Wolfei的优选培养基为德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.213的培养基配方，每一级的优选培养温度为35℃，培养时间为3～7天；Syntrophomonas curvata的优选培养基为德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.213的培养基配方，每一级的优选培养温度为35℃，培养时间为3～7天；Syntrophomonas bryantii的优选培养基为德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.325的培养基配方，每一级的优选培养温度为30℃，培养时间为3～7天；Syntrophomonas erecta subsp.Erecta的优选培养基为德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.213的培养基配方，每一级的优选培养温度为37℃，培养时间为3～7天；Syntrophomonas palmitatica的优选培养基为德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.960的培养基配方，每一级的优选培养温度为37℃，培养时间为3～7天；Syntrophus aciditrophicus的优选培养基为德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.960的培养基配方，每一级的优选培养温度为35℃，培养时间为3～7天。
本发明还提供了一种上述复合菌剂在高有机负荷中温沼气发酵系统中的应用。
上述用途中，所述的高有机负荷≥4.0kgVS/(m3.d)。
本发明所述的中温指25～45℃。
本发明的设计和作用原理为：根据沼气发酵系统的生物学原理，针对高有机负荷沼气发酵过程的限速步骤，即丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸、2-甲基丁酸等氧化降解为乙酸+CO2+H2，向高有机负荷沼气发酵系统中添加互营丙酸氧化菌和互营丁酸/戊酸氧化菌，强化丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸、2-甲基丁酸等氧化降解为乙酸+CO2+H2的过程，避免挥发性脂肪酸抑制，提高沼气发酵系统在高有机负荷条件下运行的稳定性。
本发明中所有已经由他人保藏于各保藏中心的菌种或培养基，均可分别在对应的保藏中心购买获得。
本发明的优点在于：
(1)在高有机负荷沼气发酵系统中添加本发明复合菌剂，可强化丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸、2-甲基丁酸等挥发性脂肪酸氧化降解为乙酸+CO2+H2的过程。一方面，为产甲烷菌提供更多的直接底物，从而提高池容产气率；另一方面，将抑制性较强的丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸、2-甲基丁酸强化降解掉，避免挥发性脂肪酸抑制，提高沼气发酵系统在高有机负荷条件下运行的稳定性，从而同时保证沼气发酵系统的效率与稳定。
(2)在工程应用上，处理一定量的原料时，可以缩小反应器体积，减少工程投资，而且可以降低单位沼气的运行成本，总体提高经济效益30％以上。
表1 中温互营丙酸氧化菌
备注：DSM为德国微生物菌种保藏中心
表2 中温互营丁酸/戊酸氧化菌
备注：DSM为德国微生物菌种保藏中心
具体实施方式
本发明涉及Pelotomaculum propionicicum、Pelotomaculum schinkii、Syntrophobacter sulfatireducens、Syntrophobacter fumaroxidans、Syntrophobacterpfennigii、Syntrophobacter wolinii、Syntrophomonas wolfei subsp.Wolfei、Syntrophomonascurvata、Syntrophomonas bryantii、Syntrophomonas erecta subsp.Erecta、Syntrophomonas palmitatica、Syntrophus aciditrophicus 12株菌。12株菌均可从德国微生物菌种保藏中心(DSM)获得，具体信息参见表1和表2。
按照代谢功能的不同，将上述12株菌分为两类：
中温互营丙酸氧化菌：Pelotomaculum propionicicum、Pelotomaculum schinkii、Syntrophobacter sulfatireducens、Syntrophobacter fumaroxidans、Syntrophobacterpfennigii、Syntrophobacter wolinii；
中温互营丁酸/戊酸氧化菌：Syntrophomonas wolfei subsp.Wolfei、Syntrophomonascurvata、Syntrophomonas bryantii、Syntrophomonas erecta subsp.Erecta、Syntrophomonas palmitatica、Syntrophus aciditrophicus。
实施例1 中温互营丙酸氧化菌菌液的制备
(1)Pelotomaculum propionicicum单一菌液制备
按照德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.960的培养基配方在体积百分含量为80％N2+20％CO2的无氧气氛条件下配制Pelotomaculum propionicicum的液体培养基，调节pH值为6.5～7.2，在上述无氧气氛条件下分装于25mL厌氧管、500mL厌氧瓶和20L的厌氧罐中，装填量以不超过厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐总体积的20％为宜，盖上密封盖并于121℃灭菌20分钟，灭菌冷却后向厌氧管、厌氧瓶、厌氧罐中充入体积百分含量为80％N2+20％CO2的气体，充气至厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐内气体压力为100kPa。取DSM No.15578的Pelotomaculum propionicicum活菌培养物在上述无氧气氛条件下接种到装有培养基的厌氧管中，随后在37℃条件下培养14天，该厌氧管的培养为1级培养；将1级培养后的厌氧管中的菌液在上述无氧气氛条件下全部接入到厌氧瓶中，随后在37℃条件下培养17天，该厌氧瓶的培养为2级培养；将2级培养后的厌氧瓶中的菌液在上述无氧气氛条件下全部接入到厌氧罐中，随后在37℃条件下培养20天，该厌氧罐的培养为3级培养，至此获得Pelotomaculumpropionicicum的单一菌液。
(2)Pelotomaculum schinkii单一菌液制备
按照德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.960的培养基配方在体积百分含量为80％N2+20％CO2的无氧气氛条件下配制Pelotomaculum schinkii的液体培养基，调节pH值为7.0～7.2，在上述无氧气氛条件下分装于25mL厌氧管、500mL厌氧瓶和20L的厌氧罐中，装填量以不超过厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐总体积的20％为宜，盖上密封盖并于121℃灭菌20分钟，灭菌冷却后向厌氧管、厌氧瓶、厌氧罐中充入体积百分含量为80％N2+20％CO2的气体，充气至厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐内气体压力为100kPa。取DSM No.15200的Pelotomaculum schinkii活菌培养物在上述无氧气氛条件下接种到装有培养基的厌氧管中，随后在37℃条件下培养20天，该厌氧管的培养为1级培养；将1级培养后的厌氧管中的菌液在上述无氧气氛条件下全部接入到厌氧瓶中，随后在37℃条件下培养17天，该厌氧瓶的培养为2级培养；将2级培养后的厌氧瓶中的菌液在上述无氧气氛条件下全部接入到厌氧罐中，随后在37℃条件下培养14天，该厌氧罐的培养为3级培养，至此获得Pelotomaculum schinkii的单一菌液。
(3)Syntrophobacter sulfatireducens单一菌液制备
按照德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.212的培养基配方在体积百分含量为80％N2+20％CO2的无氧气氛条件下配制Syntrophobacter sulfatireducens的液体培养基，调节pH值为7.0～7.6，在上述无氧气氛条件下分装于25mL厌氧管、500mL厌氧瓶和20L的厌氧罐中，装填量以不超过厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐总体积的20％为宜，盖上密封盖并于121℃灭菌20分钟，灭菌冷却后向厌氧管、厌氧瓶、厌氧罐中充入体积百分含量为80％N2+20％CO2的气体，充气至厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐内气体压力为100kPa。取DSM No.16706的Syntrophobacter sulfatireducens活菌培养物在上述无氧气氛条件下接种到装有培养基的厌氧管中，随后在37℃条件下培养17天，该厌氧管的培养为1级培养；将1级培养后的厌氧管中的菌液在上述无氧气氛条件下全部接入到厌氧瓶中，随后在37℃条件下培养20天，该厌氧瓶的培养为2级培养；将2级培养后的厌氧瓶中的菌液在上述无氧气氛条件下全部接入到厌氧罐中，随后在37℃条件下培养14天，该厌氧罐的培养为3级培养，至此获得Syntrophobactersulfatireducens的单一菌液。
(4)Syntrophobacter fumaroxidans单一菌液制备
按照德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.684的培养基配方在体积百分含量为80％N2+20％CO2的无氧气氛条件下配制Syntrophobacter fumaroxidans的液体培养基，调节pH值为7.0～7.6，在上述无氧气氛条件下分装于25mL厌氧管、500mL厌氧瓶和20L的厌氧罐中，装填量以不超过厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐总体积的20％为宜，盖上密封盖并于121℃灭菌20分钟，灭菌冷却后向厌氧管、厌氧瓶、厌氧罐中充入体积百分含量为80％N2+20％CO2的气体，充气至厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐内气体压力为100kPa。取DSM No.10017的Syntrophobacter fumaroxidans活菌培养物在上述无氧气氛条件下接种到装有培养基的厌氧管中，随后在37℃条件下培养14天，该厌氧管的培养为1级培养；将1级培养后的厌氧管中的菌液在上述无氧气氛条件下全部接入到厌氧瓶中，随后在37℃条件下培养17天，该厌氧瓶的培养为2级培养；将2级培养后的厌氧瓶中的菌液在上述无氧气氛条件下全部接入到厌氧罐中，随后在30℃条件下培养20天，该厌氧罐的培养为3级培养，至此获得Syntrophobacterfumaroxidans的单一菌液。
(5)Syntrophobacter pfennigii单一菌液制备
按照德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.706的培养基配方在体积百分含量为80％N2+20％CO2的无氧气氛条件下配制Syntrophobacter pfennigii的液体培养基，调节pH值为7.0～7.3，在上述无氧气氛条件下分装于25mL厌氧管、500mL厌氧瓶和20L的厌氧罐中，装填量以不超过厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐总体积的20％为宜，盖上密封盖并于121℃灭菌20分钟，灭菌冷却后向厌氧管、厌氧瓶、厌氧罐中充入体积百分含量为80％N2+20％CO2的气体，充气至厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐内气体压力为100kPa。取DSM No.10092的Syntrophobacter pfennigii活菌培养物在上述无氧气氛条件下接种到装有培养基的厌氧管中，随后在37℃条件下培养17天，该厌氧管的培养为1级培养；将1级培养后的厌氧管中的菌液在上述无氧气氛条件下全部接入到厌氧瓶中，随后在37℃条件下培养20天，该厌氧瓶的培养为2级培养；将2级培养后的厌氧瓶中的菌液在上述无氧气氛条件下全部接入到厌氧罐中，随后在37℃条件下培养14天，该厌氧罐的培养为3级培养，至此获得Syntrophobacterpfennigii的单一菌液。
(6)Syntrophobacter wolinii单一菌液制备
按照德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.212的培养基配方在体积百分含量为80％N2+20％CO2的无氧气氛条件下配制Syntrophobacter wolinii的液体培养基，调节pH值为6.9～7.3，在上述无氧气氛条件下分装于25mL厌氧管、500mL厌氧瓶和20L的厌氧罐中，装填量以不超过厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐总体积的20％为宜，盖上密封盖并于121℃灭菌20分钟，灭菌冷却后向厌氧管、厌氧瓶、厌氧罐中充入体积百分含量为80％N2+20％CO2的气体，充气至厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐内气体压力为100kPa。取DSM No.2805的Syntrophobacter wolinii活菌培养物在上述无氧气氛条件下接种到装有培养基的厌氧管中，随后在35℃条件下培养14天，该厌氧管的培养为1级培养；将1级培养后的厌氧管中的菌液在上述无氧气氛条件下全部接入到厌氧瓶中，随后在35℃条件下培养17天，该厌氧瓶的培养为2级培养；将2级培养后的厌氧瓶中的菌液在上述无氧气氛条件下全部接入到厌氧罐中，随后在35℃条件下培养20天，该厌氧罐的培养为3级培养，至此获得Syntrophobacter wolinii的单一菌液。
(7)中温互营丙酸氧化菌菌液制备
制备方法一：将上述分别制得的Pelotomaculum propionicicum单一菌液、Pelotomaculum schinkii单一菌液、Syntrophobacter sulfatireducens单一菌液、Syntrophobacter fumaroxidans单一菌液、Syntrophobacter pfennigii单一菌液、Syntrophobacter wolinii单一菌液分别直接作为中温互营丙酸氧化菌菌液，密封低温(2～8℃)保存备用。
制备方法二：将制得的Pelotomaculum propionicicum单一菌液、Pelotomaculumschinkii单一菌液、Syntrophobacter sulfatireducens单一菌液、Syntrophobacterfumaroxidans单一菌液、Syntrophobacter pfennigii单一菌液、Syntrophobacter wolinii单一菌液中任意两种菌液在80％N2+20％CO2的无氧气氛条件下任意比例进行混配，装入预先灭菌的无氧容器中，密封低温(2～8℃)保存备用。
制备方法三：将制得的Pelotomaculum propionicicum单一菌液、Pelotomaculumschinkii单一菌液、Syntrophobacter sulfatireducens单一菌液、Syntrophobacterfumaroxidans单一菌液、Syntrophobacter pfennigii单一菌液、Syntrophobacter wolinii单一菌液中任意三种菌液在80％N2+20％CO2的无氧气氛条件下任意比例进行混配，装入预先灭菌的无氧容器中，密封低温(2～8℃)保存备用。
制备方法四：将制得的Pelotomaculum propionicicum单一菌液、Pelotomaculumschinkii单一菌液、Syntrophobacter sulfatireducens单一菌液、Syntrophobacterfumaroxidans单一菌液、Syntrophobacter pfennigii单一菌液、Syntrophobacter wolinii单一菌液中任意四种菌液在80％N2+20％CO2的无氧气氛条件下任意比例进行混配，装入预先灭菌的无氧容器中，密封低温(2～8℃)保存备用。
制备方法五：将制得的Pelotomaculum propionicicum单一菌液、Pelotomaculumschinkii单一菌液、Syntrophobacter sulfatireducens单一菌液、Syntrophobacterfumaroxidans单一菌液、Syntrophobacter pfennigii单一菌液、Syntrophobacter wolinii单一菌液中任意五种菌液在80％N2+20％CO2的无氧气氛条件下任意比例进行混配，装入预先灭菌的无氧容器中，密封低温(2～8℃)保存备用。
制备方法六：将分别制得的Pelotomaculum propionicicum单一菌液、Pelotomaculum schinkii单一菌液、Syntrophobacter sulfatireducens单一菌液、Syntrophobacter fumaroxidans单一菌液、Syntrophobacter pfennigii单一菌液和Syntrophobacter wolinii单一菌液在80％N2+20％CO2的无氧气氛条件下任意比例进行混配，装入预先灭菌的无氧容器中，密封低温(2～8℃)保存备用。
实施例2 中温互营丙酸氧化菌菌液的制备
根据生产的需要，可以扩大培养规模，进行四级培养。设置1m3的厌氧罐作为四级培养，相应菌种的培养基配方、接种方法、培养条件、混合菌液的混配体积比例与实施例1相同。
实施例3 中温互营丁酸/戊酸氧化菌菌液的制备
(1)Syntrophomonas wolfei subsp.Wolfei单一菌液制备
按照德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.213的培养基配方在体积百分含量为80％N2+20％CO2的无氧气氛条件下配制Syntrophomonas wolfei subsp.Wolfei的液体培养基，调节pH值为7.2，在上述无氧气氛条件下分装于25mL厌氧管、500mL厌氧瓶和20L的厌氧罐中，装填量以不超过厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐总体积的20％为宜，盖上密封盖并于121℃灭菌20分钟，灭菌冷却后向厌氧管、厌氧瓶、厌氧罐中充入体积百分含量为80％N2+20％CO2的气体，充气至厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐内气体压力为100kPa。取DSM No.2245B的Syntrophomonas wolfei subsp.Wolfei活菌培养物在上述无氧气氛条件下接种到装有培养基的厌氧管中，随后在35℃条件下培养3天，该厌氧管的培养为1级培养；将1级培养后的厌氧管中的菌液在上述无氧气氛条件下全部接入到厌氧瓶中，随后在35℃条件下培养5天，该厌氧瓶的培养为2级培养；将2级培养后的厌氧瓶中的菌液在上述无氧气氛条件下全部接入到厌氧罐中，随后在35℃条件下培养7天，该厌氧罐的培养为3级培养，至此获得Syntrophomonas wolfei subsp.Wolfei的单一菌液。
(2)Syntrophomonas curvata单一菌液制备
按照德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.213的培养基配方在体积百分含量为80％N2+20％CO2的无氧气氛条件下配制Syntrophomonas curvata的液体培养基，调节pH值为7.5，在上述无氧气氛条件下分装于25mL厌氧管、500mL厌氧瓶和20L的厌氧罐中，装填量以不超过厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐总体积的20％为宜，盖上密封盖并于121℃灭菌20分钟，灭菌冷却后向厌氧管、厌氧瓶、厌氧罐中充入体积百分含量为80％N2+20％CO2的气体，充气至厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐内气体压力为100kPa。取DSM No.15682的Syntrophomonas curvata活菌培养物在上述无氧气氛条件下接种到装有培养基的厌氧管中，随后在35℃条件下培养7天，该厌氧管的培养为1级培养；将1级培养后的厌氧管中的菌液在上述无氧气氛条件下全部接入到厌氧瓶中，随后在35℃条件下培养5天，该厌氧瓶的培养为2级培养；将2级培养后的厌氧瓶中的菌液在上述无氧气氛条件下全部接入到厌氧罐中，随后在35℃条件下培养3天，该厌氧罐的培养为3级培养，至此获得Syntrophomonas curvata的单一菌液。
(3)Syntrophomonas bryantii单一菌液制备
按照德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.325的培养基配方在体积百分含量为80％N2+20％CO2的无氧气氛条件下配制Syntrophomonas bryantii的液体培养基，调节pH值为7.2～7.4，在上述无氧气氛条件下分装于25mL厌氧管、500mL厌氧瓶和20L的厌氧罐中，装填量以不超过厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐总体积的20％为宜，盖上密封盖并于121℃灭菌20分钟，灭菌冷却后向厌氧管、厌氧瓶、厌氧罐中充入体积百分含量为80％N2+20％CO2的气体，充气至厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐内气体压力为100kPa。取DSM No.3014B的Syntrophomonas bryantii在上述无氧气氛条件下接种到装有培养基的厌氧管中，随后在30℃条件下培养5天，该厌氧管的培养为1级培养；将1级培养后的厌氧管中的菌液在上述无氧气氛条件下全部接入到厌氧瓶中，随后在30℃条件下培养3天，该厌氧瓶的培养为2级培养；将2级培养后的厌氧瓶中的菌液在上述无氧气氛条件下全部接入到厌氧罐中，随后在30℃条件下培养7天，该厌氧罐的培养为3级培养，至此获得Syntrophomonas bryantii的单一菌液。
(4)Syntrophomonas erecta subsp.Erecta单一菌液制备
按照德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.213的培养基配方在体积百分含量为80％N2+20％CO2的无氧气氛条件下配制Syntrophomonas erecta subsp.Erecta的液体培养基，调节pH值为7.8，在上述无氧气氛条件下分装于25mL厌氧管、500mL厌氧瓶和20L的厌氧罐中，装填量以不超过厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐总体积的20％为宜，盖上密封盖并于121℃灭菌20分钟，灭菌冷却后向厌氧管、厌氧瓶、厌氧罐中充入体积百分含量为80％N2+20％CO2的气体，充气至厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐内气体压力为100kPa。取DSM No.16215的Syntrophomonas erecta subsp.Erecta活菌培养物在上述无氧气氛条件下接种到装有培养基的厌氧管中，随后在37℃条件下培养7天，该厌氧管的培养为1级培养；将1级培养后的厌氧管中的菌液在上述无氧气氛条件下全部接入到厌氧瓶中，随后在37℃条件下培养5天，该厌氧瓶的培养为2级培养；将2级培养后的厌氧瓶中的菌液在上述无氧气氛条件下全部接入到厌氧罐中，随后在37℃条件下培养7天，该厌氧罐的培养为3级培养，至此获得Syntrophomonas erecta subsp.Erecta的单一菌液。
(5)Syntrophomonas palmitatica单一菌液制备
按照德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.960的培养基配方在体积百分含量为80％N2+20％CO2的无氧气氛条件下配制Syntrophomonas palmitatica的液体培养基，调节pH值为7.0，在上述无氧气氛条件下分装于25mL厌氧管、500mL厌氧瓶和20L的厌氧罐中，装填量以不超过厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐总体积的20％为宜，盖上密封盖并于121℃灭菌20分钟，灭菌冷却后向厌氧管、厌氧瓶、厌氧罐中充入体积百分含量为80％N2+20％CO2的气体，充气至厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐内气体压力为100kPa。取DSM No.18709的Syntrophomonas palmitatica活菌培养物在上述无氧气氛条件下接种到装有培养基的厌氧管中，随后在37℃条件下培养3天，该厌氧管的培养为1级培养；将1级培养后的厌氧管中的菌液在上述无氧气氛条件下全部接入到厌氧瓶中，随后在37℃条件下培养5天，该厌氧瓶的培养为2级培养；将2级培养后的厌氧瓶中的菌液在上述无氧气氛条件下全部接入到厌氧罐中，随后在37℃条件下培养7天，该厌氧罐的培养为3级培养，至此获得Syntrophomonaspalmitatica的单一菌液。
(6)Syntrophus aciditrophicus单一菌液制备
按照德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.960的培养基配方在体积百分含量为80％N2+20％CO2的无氧气氛条件下配制Syntrophus aciditrophicus的液体培养基，调节pH值为7.0，在上述无氧气氛条件下分装于25mL厌氧管、500mL厌氧瓶和20L的厌氧罐中，装填量以不超过厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐总体积的20％为宜，盖上密封盖并于121℃灭菌20分钟，灭菌冷却后向厌氧管、厌氧瓶、厌氧罐中充入体积百分含量为80％N2+20％CO2的气体，充气至厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐内气体压力为100kPa。取DSM No.26646的Syntrophus aciditrophicus在上述无氧气氛条件下接种到装有培养基的厌氧管中，随后在35℃条件下培养5天，该厌氧管的培养为1级培养；将1级培养后的厌氧管中的菌液在上述无氧气氛条件下全部接入到厌氧瓶中，随后在35℃条件下培养7天，该厌氧瓶的培养为2级培养；将2级培养后的厌氧瓶中的菌液在上述无氧气氛条件下全部接入到厌氧罐中，随后在35℃条件下培养3天，该厌氧罐的培养为3级培养，至此获得Syntrophus aciditrophicus的单一菌液。
(7)中温互营丁酸/戊酸氧化菌菌液制备
制备方法一：将上述分别制得的Syntrophomonas wolfei subsp.Wolfei单一菌液、Syntrophomonas curvata单一菌液、Syntrophomonas bryantii单一菌液、Syntrophomonaserecta subsp.Erecta单一菌液、Syntrophomonas palmitatica单一菌液、Syntrophusaciditrophicus单一菌液分别直接作为中温互营丁酸/戊酸氧化菌菌液，密封低温(2～8℃)保存备用。
制备方法二：将制得的Syntrophomonas wolfei subsp.Wolfei单一菌液、Syntrophomonas curvata单一菌液、Syntrophomonas bryantii单一菌液、Syntrophomonaserecta subsp.Erecta单一菌液、Syntrophomonas palmitatica单一菌液、Syntrophusaciditrophicus单一菌液中任意两种菌液在80％N2+20％CO2的无氧气氛条件下任意比例进行混配，装入预先灭菌的无氧容器中，密封低温(2～8℃)保存备用。
制备方法三：将制得的Syntrophomonas wolfei subsp.Wolfei单一菌液、Syntrophomonas curvata单一菌液、Syntrophomonas bryantii单一菌液、Syntrophomonaserecta subsp.Erecta单一菌液、Syntrophomonas palmitatica单一菌液、Syntrophusaciditrophicus单一菌液中任意三种菌液在80％N2+20％CO2的无氧气氛条件下任意比例进行混配，装入预先灭菌的无氧容器中，密封低温(2～8℃)保存备用。
制备方法四：将制得的Syntrophomonas wolfei subsp.Wolfei单一菌液、Syntrophomonas curvata单一菌液、Syntrophomonas bryantii单一菌液、Syntrophomonaserecta subsp.Erecta单一菌液、Syntrophomonas palmitatica单一菌液、Syntrophusaciditrophicus单一菌液中任意四种菌液在80％N2+20％CO2的无氧气氛条件下任意比例进行混配，装入预先灭菌的无氧容器中，密封低温(2～8℃)保存备用。
制备方法五：将制得的Syntrophomonas wolfei subsp.Wolfei单一菌液、Syntrophomonas curvata单一菌液、Syntrophomonas bryantii单一菌液、Syntrophomonaserecta subsp.Erecta单一菌液、Syntrophomonas palmitatica单一菌液、Syntrophusaciditrophicus单一菌液中任意五种菌液在80％N2+20％CO2的无氧气氛条件下任意比例进行混配，装入预先灭菌的无氧容器中，密封低温(2～8℃)保存备用。
制备方法六：将分别制得的Syntrophomonas wolfei subsp.Wolfei单一菌液、Syntrophomonas curvata单一菌液、Syntrophomonas bryantii单一菌液、Syntrophomonaserecta subsp.Erecta单一菌液、Syntrophomonas palmitatica单一菌液和Syntrophusaciditrophicus单一菌液在80％N2+20％CO2的无氧气氛条件下任意比例进行混配，装入预先灭菌的无氧容器中，密封低温(2～8℃)保存备用。
实施例4 中温互营丁酸/戊酸氧化菌菌液的制备
根据生产的需要，可以扩大培养规模，进行四级培养。设置1m3的厌氧罐作为四级培养，相应菌种的培养基配方、接种方法、培养条件、混合菌液的混配体积比例与实施例3相同。
实施例5 复合菌剂的制备
制备方法一：将实施例1(7)的制备方法中一中制备的Pelotomaculumpropionicicum中温互营丙酸氧化菌单一菌液和实施例3(7)的制备方法一中制备的Syntrophomonas bryantii中温互营丁酸/戊酸氧化菌单一菌液在体积百分含量为80％N2+20％CO2的无氧气氛条件下按体积比6∶4混合，得到复合菌液，对复合菌液进行细胞计数，并通过离心浓缩至中温互营丙酸氧化菌与中温互营丁酸/戊酸氧化菌的细胞总浓度为1×109个/mL，至此得到高有机负荷中温沼气发酵复合菌剂，封装低温(2～8℃)保存。
制备方法二：将实施例1(7)的制备方法二中制备的Pelotomaculum schinkii、Syntrophobacter sulfatireducens中温互营丙酸氧化菌复合菌液和实施例3(7)的制备方法三中制备的Syntrophomonas bryantii、Syntrophomonas erecta subsp.Erecta、Syntrophomonas palmitatica中温互营丁酸/戊酸氧化菌复合菌液在体积百分含量为80％N2+20％CO2的无氧气氛条件下按体积比7.5∶2.5混合得到复合菌液，对复合菌液进行细胞计数，并通过离心浓缩至中温互营丙酸氧化菌与中温互营丁酸/戊酸氧化菌的细胞总浓度为5×109个/mL，至此得到高有机负荷中温沼气发酵复合菌剂，封装低温(2～8℃)保存。
制备方法三：将实施例2制备的中温互营丙酸氧化菌菌液和实施例4制备的中温互营丁酸/戊酸氧化菌菌液在体积百分含量为80％N2+20％CO2的无氧气氛条件下按体积比9∶1混合得到复合菌液，对复合菌液进行细胞计数，并通过离心浓缩至中温互营丙酸氧化菌与中温互营丁酸/戊酸氧化菌的细胞总浓度为10×109个/mL，至此得到高有机负荷中温沼气发酵的复合菌剂，封装低温(2～8℃)保存。
实施例6 复合菌剂效果试验
以易腐的新鲜果蔬垃圾作为原料进行中温沼气发酵，设置A、B、C、D、E、F、G、H、I、J等10组连续式沼气发酵实验，实验组A、B、C、D、E的每天的进料有机负荷为4.0kgVS/(m3.d)，实验组F、G、H、I、J的每天的进料有机负荷为6.0kgVS/(m3.d)，实验组添加的复合菌剂见表3所示，其中添加量为沼气发酵物料总体积的百分比。
沼气发酵实验运行至第20天，分别监测各组的产气情况和池容产气率以及发酵液的丙酸、正丁酸和正戊酸浓度，实验结果见表3。实验结果说明，对于高有机负荷中温沼气发酵系统，添加本发明的复合菌剂能够有效强化挥发性脂肪酸(丙酸、正丁酸、正戊酸等)氧化降解，提高沼气发酵系统的池容产气率(可达到3.9m3/(m3.d))，同时避免挥发性脂肪酸抑制，提高中温沼气发酵系统在高有机负荷条件下运行的稳定性。
表3 复合菌剂添加情况和实验结果
Claims (4)
1.一种高有机负荷中温沼气发酵复合菌剂，其特征在于，该复合菌剂含有中温互营丙酸氧化菌和中温互营丁酸/戊酸氧化菌，所述中温互营丙酸氧化菌包括Pelotomaculum propionicicum、Pelotomaculum schinkii、Syntrophobactersulfatireducens、Syntrophobacter fumaroxidans、Syntrophobacter pfennigii、Syntrophobacter wolinii的一种或多种任意组合；所述中温互营丁酸/戊酸氧化菌包括Syntrophomonas wolfei subsp.Wolfei、Syntrophomonas curvata、Syntrophomonas bryantii、Syntrophomonas erecta subsp.Erecta、Syntrophomonaspalmitatica、Syntrophus aciditrophicus的一种或多种任意组合；所述中温互营丙酸氧化菌与中温互营丁酸/戊酸氧化菌的细胞数量比为6～9∶4～1，且所述中温互营丙酸氧化菌和中温互营丁酸/戊酸氧化菌的细胞总浓度≥1×109个/mL。
2.一种如权利要求1所述的高有机负荷中温沼气发酵复合菌剂的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)分别将中温互营丙酸氧化菌和中温互营丁酸/戊酸氧化菌培养成菌液，在厌氧条件下混合得到复合菌液；
(2)对步骤(1)得到的复合菌液进行细胞计数，依据计数结果对复合菌液进行浓缩至细胞总浓度≥1×109个/mL，其中中温互营丙酸氧化菌与中温互营丁酸/戊酸氧化菌的细胞数量比为6～9∶4～1；
(3)封装，2～8℃保存，得到复合菌剂。
3.如权利要求1所述的复合菌剂在高有机负荷中温沼气发酵系统中的用途。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述高有机负荷为≥4.0kgVS/(m3.d)。
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