CN104498415B - 富含油脂原料中温沼气发酵系统的复合菌剂及其制备方法和用途 - Google Patents
富含油脂原料中温沼气发酵系统的复合菌剂及其制备方法和用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104498415B CN104498415B CN201510037310.5A CN201510037310A CN104498415B CN 104498415 B CN104498415 B CN 104498415B CN 201510037310 A CN201510037310 A CN 201510037310A CN 104498415 B CN104498415 B CN 104498415B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- medium temperature
- syntrophomonas
- fatty acids
- long chain
- chain fatty
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 258
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 106
- 239000002131 composite material Substances 0.000 title claims abstract description 48
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 title claims abstract description 30
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 26
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 162
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims abstract description 45
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 37
- 150000004668 long chain fatty acids Chemical class 0.000 claims description 59
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 51
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 51
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 46
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 39
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 22
- 241000204007 Syntrophomonas bryantii Species 0.000 claims description 19
- 241000081414 Syntrophomonas erecta Species 0.000 claims description 19
- 241000601368 Syntrophomonas palmitatica Species 0.000 claims description 19
- 241000931879 Syntrophomonas sapovorans Species 0.000 claims description 19
- 241000100988 Syntrophomonas wolfei subsp. wolfei Species 0.000 claims description 19
- 241000202970 Methanobacterium formicicum Species 0.000 claims description 18
- 241000205284 Methanosarcina acetivorans Species 0.000 claims description 18
- 241000205275 Methanosarcina barkeri Species 0.000 claims description 18
- 241000205263 Methanospirillum hungatei Species 0.000 claims description 18
- 241000205007 Methanothrix soehngenii Species 0.000 claims description 18
- 241000623985 Syntrophomonas zehnderi Species 0.000 claims description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 16
- 239000003921 oil Substances 0.000 claims description 13
- 239000003925 fat Substances 0.000 claims description 11
- 239000010813 municipal solid waste Substances 0.000 claims description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 abstract description 37
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 abstract description 37
- 239000012530 fluid Substances 0.000 abstract description 19
- 239000004519 grease Substances 0.000 abstract description 15
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 abstract description 8
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 abstract description 5
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 abstract description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 88
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 44
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 30
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 20
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 14
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 14
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 14
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 14
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 12
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 9
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 9
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 7
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 7
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 6
- 238000012549 training Methods 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-N decanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCC(O)=O GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 4
- MNWFXJYAOYHMED-UHFFFAOYSA-N heptanoic acid Chemical compound CCCCCCC(O)=O MNWFXJYAOYHMED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000010815 organic waste Substances 0.000 description 4
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 description 3
- -1 cutting offals Substances 0.000 description 3
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 3
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 3
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 3
- 239000005632 Capric acid (CAS 334-48-5) Substances 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000012499 inoculation medium Substances 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- FBUKVWPVBMHYJY-UHFFFAOYSA-N nonanoic acid Chemical compound CCCCCCCCC(O)=O FBUKVWPVBMHYJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010525 oxidative degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000009790 rate-determining step (RDS) Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 2
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 241000606017 Syntrophomonas Species 0.000 description 1
- VJMAITQRABEEKP-UHFFFAOYSA-N [6-(phenylmethoxymethyl)-1,4-dioxan-2-yl]methyl acetate Chemical compound O1C(COC(=O)C)COCC1COCC1=CC=CC=C1 VJMAITQRABEEKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N alpha-ethylcaproic acid Natural products CCCCC(CC)C(O)=O OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-M dodecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCC([O-])=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 239000010794 food waste Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940070765 laurate Drugs 0.000 description 1
- 235000020997 lean meat Nutrition 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012263 liquid product Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000007102 metabolic function Effects 0.000 description 1
- 230000000696 methanogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002068 microbial inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 239000005416 organic matter Substances 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P39/00—Processes involving microorganisms of different genera in the same process, simultaneously
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
- C12P5/02—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons acyclic
- C12P5/023—Methane
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/30—Fuel from waste, e.g. synthetic alcohol or diesel
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种用于富含油脂原料中温沼气发酵系统的复合菌剂及其制备方法和用途，复合菌剂主要用于强化长链脂肪酸的降解(β‑氧化)及其降解产物(乙酸+CO2+H2)产甲烷，提高富含油脂原料的产气速率，缩短发酵停留时间，同时避免发酵液上层油脂的严重积累。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，涉及一种用于富含油脂原料中温沼气发酵系统的复合菌剂及其制备方法和用途，复合菌剂主要用于强化富含油脂原料的中温沼气发酵系统产气，提高富含油脂原料的产气效率。
背景技术
由于沼气发酵技术不仅能够处理各类有机废弃物，而且还能够获取生物甲烷等清洁可再生能源，因此沼气发酵技术已经被广泛用于处理和利用各种有机废弃物，包括餐厨垃圾、屠宰废弃物、油脂加工废弃物等富含油脂类的有机废弃物。
相比碳水化合物、蛋白质等原料，虽然油脂的甲烷产率较高，但是油脂的厌氧降解产甲烷速率非常缓慢。申请人采用土豆、瘦肉和花生油作为糖水化合物、蛋白质和油脂的模型原料进行沼气发酵实验研究，结果表明，三种成分的甲烷产率分别为：260.1、258.4和757.2mL·gVS-1，但是三种成分的厌氧降解速率常数分别为0.183、0.190和0.020d-1，累积甲烷产量达到最终甲烷产量80％所需的时间分别为7.2、8.1和59.7d[李东等，有机垃圾组分中温厌氧消化产甲烷动力学研究，太阳能学报，2010，31(3)：385-390]。可见，油脂的厌氧降解非常缓慢。
油脂厌氧降解产甲烷过程如下：首先，油脂水解生成甘油和长链脂肪酸(LCFA)，其次，长链脂肪酸β-氧化降解为乙酸，最后，乙酸营养型产甲烷菌和氢营养型产甲烷菌分别利用乙酸和CO2+H2产甲烷。从热动力学角度来看，长链脂肪酸的降解(β-氧化)很难进行，除非氢分压维持在极低水平，见下面式1所示，只有当氢分压低于10-3atm时，吉布斯自由能才为负。然而，这么低的氢分压只有存在氢营养细菌(如氢营养产甲烷菌)时才能获得，此时产生的氢立即被消耗掉以保证较低的氢分压。因此，长链脂肪酸的降解(β-氧化)是富含油脂原料整个沼气发酵过程的限速步骤。
n-LCFA→(n-2)-LCFA+2Acetate+2H2 ΔG0′＝+48kJ/mol (式1)
长链脂肪酸除了较难降解外，还会抑制沼气发酵。由于LCFAs与厌氧菌的细胞壁很相似，LCFAs通过吸附到细胞壁或细胞膜上，影响细胞膜的传输功能，对厌氧菌形成强烈的抑制，甚至破坏菌体细胞膜的结构直至接杀死厌氧微生物。另外，LCFAs吸附到微生物上形成颗粒污泥薄层并上浮或洗出，使得微生物不能良好地与底物接触，从而影响原料的降解。下表1列出了部分LCFAs对来源于上流式厌氧污泥床(UASB)和膨胀颗粒污泥床(EGSB)厌氧颗粒污泥的最大比产甲烷活性产生50％抑制的浓度(IC50)。从表1可以看出庚酸、癸酸和油酸的IC50值较小，表明三种LCFA的毒性较大。
表1不同LCFAs对UASB和EGSB反应器厌氧颗粒污泥的IC50值
| LCFAs | UASB反应器颗粒污泥 | EGSB反应器颗粒污泥 |
| 庚酸(C7∶0) | 3.9 | 7.1 |
| 壬酸(C9∶0) | 5.8 | 10.5 |
| 辛酸(C8∶0) | 5.6 | 9.3 |
| 癸酸(C10∶0) | 1.9 | 7.2 |
| 月桂酸(C12∶0) | 4.6 | 6.7 |
| 十四烷酸(C14∶0) | 8.8 | 11.8 |
| 油酸(C18∶1) | 3.9 | 6.5 |
由于长链脂肪酸厌氧降解缓慢以及长链脂肪酸抑制的双重影响，申请人通过以餐厨垃圾为原料进行的沼气发酵实验发现，经过长期的沼气发酵运行，反应器内部上层积累了很厚的一层油脂。[Dong Li,Yongming Sun,Yanfeng Guo,Zhenhong Yuan,Yao Wang&Feng Zhen.Continuous anaerobic digestion of food waste and design of digesterwith lipid removal,Environmental Technology,2013,34(13-14)：2135-2143]。
因此，针对长链脂肪酸的降解(β-氧化)是富含油脂原料整个沼气发酵过程的限速步骤这一不可避免事实，有必要开发一种用于富含油脂原料沼气发酵系统的复合菌剂，强化长链脂肪酸的降解(β-氧化)，提高富含油脂原料的产气速率，缩短发酵停留时间，同时避免长链脂肪酸抑制。
发明内容
本发明的主要目的在于克服现有技术中的不足，本发明首先提供一种用于富含油脂原料中温沼气发酵系统的复合菌剂及其用途，复合菌剂主要用于强化长链脂肪酸的降解(β-氧化)及其降解产物(乙酸+CO2+H2)产甲烷，提高富含油脂原料的产气速率，缩短发酵停留时间，同时避免发酵液上层油脂的严重积累。
另外，本发明还提供一种用于富含油脂原料中温沼气发酵系统的复合菌剂的制备方法，依据本发明方法制作得到的复合菌剂主要用于强化长链脂肪酸的降解(β-氧化)及其降解产物(乙酸+CO2+H2)产甲烷，提高富含油脂原料的产气速率，缩短发酵停留时间，同时避免发酵液上层油脂的严重积累。
为了解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案实现。
本发明第一，提供一种富含油脂原料中温沼气发酵系统的复合菌剂，该复合菌剂含有中温互营长链脂肪酸氧化菌和中温氢或乙酸营养型产甲烷菌。
其中，所述的中温互营长链脂肪酸氧化菌为Syntrophomonas wolfeisubsp.wolfei、Syntrophomonas sapovorans、Syntrophomonas bryantii、Syntrophomonaserecta subsp.erecta、Syntrophomonas zehnderi、Syntrophomonas palmitatica，六种菌的细胞数量比为1～5∶1～5∶1～5∶1～5∶1～5∶1～5，优选为1∶1∶1∶1∶1∶1。六种菌的基本特征如表2所示。
所述的中温氢或乙酸营养型产甲烷菌为Methanospirillum hungatei、Methanobacterium formicicum、Methanosarcina barkeri、Methanosarcinaacetivorans、Methanothrix soehngenii，五种菌的细胞数量比为1～6∶1～6∶1～6∶1～6∶1～6，优选为1∶1∶1∶1∶1。五种菌的基本特征如表3所示。
优选地，所述复合菌剂中，所述中温互营长链脂肪酸氧化菌和中温氢或乙酸营养型产甲烷菌的细胞总浓度至少为1×109个/mL，且中温互营长链脂肪酸氧化菌与中温氢或乙酸营养型产甲烷菌的细胞数量比为(1～9)∶(9～1)。
本发明第二，提供一种上述富含油脂原料中温沼气发酵系统的复合菌剂的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)将中温互营长链脂肪酸氧化菌菌液和中温氢或乙酸营养型产甲烷菌菌液在厌氧条件下按体积比(1～9)∶(9～1)混合得到复合菌液；
(2)对步骤(1)得到的复合菌液进行细胞计数，并浓缩至中温互营长链脂肪酸氧化菌和中温氢或乙酸营养型产甲烷菌的细胞总浓度至少为1×109个/mL；
(3)封装并在2～8℃下保存，得到所述的中温沼气发酵系统的复合菌剂。
上述方法中，所述的中温互营长链脂肪酸氧化菌为Syntrophomonas wolfeisubsp.wolfei、Syntrophomonas sapovorans、Syntrophomonas bryantii、Syntrophomonaserecta subsp.erecta、Syntrophomonas zehnderi、Syntrophomonas palmitatica；
所述的中温氢或乙酸营养型产甲烷菌为Methanospirillum hungatei、Methanobacterium formicicum、Methanosarcina barkeri、Methanosarcinaacetivorans、Methanothrix soehngenii。
步骤(1)中，所述的中温互营长链脂肪酸氧化菌菌液的制备方法是，采用保藏在德国菌种保藏中心编号为DSM No.2245B的Syntrophomonas wolfei subsp.wolfei、编号为DSM No.3441的Syntrophomonas sapovorans、保藏在德国菌种保藏中心编号为DSMNo.3014B的Syntrophomonas bryantii、保藏在德国菌种保藏中心编号为DSM No.16215的Syntrophomonas erecta subsp.erecta、编号为DSM No.17840的Syntrophomonaszehnderi、保藏在德国菌种保藏中心编号为DSM No.18709的Syntrophomonas palmitatica作为接种中温互营长链脂肪酸氧化菌，分别单独在厌氧条件下接种于中温互营长链脂肪酸氧化菌培养基配方中，然后分别单独在厌氧条件下逐级扩大培养得到中温互营长链脂肪酸氧化菌单一菌液，将六种单一菌液在厌氧条件下按体积比1～5∶1～5∶1～5∶1～5∶1～5∶1～5(优选按体积比1∶1∶1∶1∶1∶1)混合得到中温互营长链脂肪酸氧化菌菌液。
上述中温互营长链脂肪酸氧化菌菌液的制备方法中，Syntrophomonas wolfeisubsp.wolfei的优选培养基配方为德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.213的培养基配方，每一级的优选培养温度为35℃，培养时间为8～14天；Syntrophomonas sapovorans的优选培养基配方为德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.347的培养基配方，每一级的优选培养温度为37℃，培养时间为8～14天；Syntrophomonas bryantii的优选培养基配方为德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.325的培养基配方，每一级的优选培养温度为30℃，培养时间为8～14天；Syntrophomonas erecta subsp.erecta的优选培养基配方为德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.213的培养基配方，每一级的优选培养温度为37℃，培养时间为8～14天；Syntrophomonas zehnderi的优选培养基配方为德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.347a的培养基配方，每一级的优选培养温度为37℃，培养时间为8～14天；Syntrophomonas palmitatica的优选培养基配方为德国菌种保藏中心提供的编号为DSMNo.960的培养基配方，每一级的优选培养温度为37℃，培养时间为8～14天。
所述的中温氢或乙酸营养型产甲烷菌菌液的制备方法是，采用保藏在德国菌种保藏中心编号为DSM No.864的Methanospirillum hungatei、编号为DSM No.1535的Methanobacterium formicicum、保藏在德国菌种保藏中心编号为DSM No.800的Methanosarcina barkeri、保藏在德国菌种保藏中心编号为DSM No.2834的Methanosarcina acetivorans、编号为DSM No.2139的Methanothrix soehngenii作为接种中温氢或乙酸营养型产甲烷菌，分别单独在厌氧条件下接种于中温氢或乙酸营养型产甲烷菌培养基中，然后分别单独在厌氧条件下逐级扩大培养得到中温氢或乙酸营养型产甲烷菌单一菌液，将五种菌的单一菌液在厌氧条件下按体积比1～6∶1～6∶1～6∶1～6∶1～6(优选按体积比1∶1∶1∶1∶1)混合得到中温氢或乙酸营养型产甲烷菌菌液。
上述中温氢或乙酸营养型产甲烷菌菌液的制备方法中，Methanospirillumhungatei的优选培养基配方为德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.119的培养基配方，每一级的优选培养温度为35℃，培养时间为8～14天；Methanobacterium formicicum的优选培养基配方为德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.119的培养基配方，每一级的优选培养温度为37℃，培养时间为8～14天；Methanosarcina barkeri的优选培养基配方为德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.120a的培养基配方，每一级的优选培养温度为35℃，培养时间为8～14天；Methanosarcina acetivorans的优选培养基配方为德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.141c的培养基配方，每一级的优选培养温度为40℃，培养时间为8～14天；Methanothrix soehngenii的优选培养基配方为德国菌种保藏中心提供的编号为DSMNo.334的培养基配方，每一级的优选培养温度为37℃，培养时间为8～14天。
本发明第三，提供一种上述复合菌剂在用于富含油脂原料中温沼气发酵系统中的用途。
上述用途中，所述富含油脂原料包括但不局限于餐厨垃圾、屠宰废弃物、油脂加工废弃物。
所述的中温指25～45℃。
本发明中所述的互营长链脂肪酸氧化菌是一类能够与氢营养型产甲烷菌互营共生降解C4～C18长链脂肪酸的细菌，它能够将长链脂肪酸氧化降解为乙酸+CO2+H2，其中，CO2+H2能够被氢营养型产甲烷菌直接利用产甲烷，乙酸能够被乙酸营养型产甲烷菌直接利用产甲烷。
本发明中所述的氢或乙酸营养型产甲烷菌是一类能够利用CO2+H2或/和乙酸产甲烷的古细菌。
本发明的设计和作用原理为：
本发明根据沼气发酵系统的生物学原理，针对油脂原料沼气发酵过程的限速步骤，即长链脂肪酸降解(β-氧化)为乙酸+CO2+H2，首先通过向富含油脂原料中温沼气发酵系统中添加中温互营长链脂肪酸氧化菌，强化长链脂肪酸的降解(β-氧化)，并通过中温氢或乙酸营养型产甲烷菌消耗利用长链脂肪酸的降解产物(乙酸+CO2+H2)产甲烷，一方面消耗长链脂肪酸的降解产物(CO2+H2)，降低氢分压，利于长链脂肪酸的降解，避免长链脂肪酸抑制，避免发酵液上层油脂的严重积累；另一方面，强化长链脂肪酸的降解产物(乙酸+CO2+H2)产甲烷，提高富含油脂原料的产气效率。
本发明中所述的所有已经由他人保藏于各保藏中心的菌种或培养基，均可分别在对应的保藏中心购买获得。
本发明的优点在于：
本发明包含优化配比的中温互营长链脂肪酸氧化菌和中温氢或乙酸营养型产甲烷菌，通过将以上物质添加到富含油脂原料的中温沼气发酵系统中，可强化长链脂肪酸的降解(β-氧化)及其降解产物(乙酸+CO2+H2)产甲烷，提高富含油脂原料的产气效率，同时避免发酵液上层油脂的严重积累。
具体实施方式
以下结合实施例详细地说明本发明。实施方案为便于更好的理解本发明，但并非对本发明的限制。
本发明方法涉及Syntrophomonas wolfei subsp.wolfei、Syntrophomonassapovorans、Syntrophomonas bryantii、Syntrophomonas erecta subsp.erecta、Syntrophomonas zehnderi、Syntrophomonas palmitatica、Methanospirillum hungatei、Methanobacterium formicicum、Methanosarcina barkeri、Methanosarcina acetivorans和Methanothrix soehngenii 11株菌。11株菌可从德国微生物菌种保藏中心(DSM)获得，具体信息参见发明内容部分的表2和表3。
按照代谢功能的不同，将上述11种菌分为两类：
中温互营长链脂肪酸氧化菌：Syntrophomonas wolfei subsp.wolfei、Syntrophomonas sapovorans、Syntrophomonas bryantii、Syntrophomonas erectasubsp.erecta、Syntrophomonas zehnderi、Syntrophomonas palmitatica
中温氢或乙酸营养型产甲烷菌：Methanospirillum hungatei、Methanobacteriumformicicum、Methanosarcina barkeri、Methanosarcina acetivorans、Methanothrixsoehngenii
实施例1中温互营长链脂肪酸氧化菌菌液的制备
(1)Syntrophomonas wolfei subsp.wolfei单一菌液制备
按照德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.213的培养基配方在体积百分含量为80％N2+20％CO2的厌氧条件下配制Syntrophomonas wolfei subsp.wolfei的液体培养基，调节pH值为7.2，在上述厌氧条件下分装于25mL厌氧管、500mL厌氧瓶和20L的厌氧罐中，装填量以不超过厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐总体积的20％为宜，盖上密封盖并于121℃灭菌20分钟，灭菌冷却后向厌氧管、厌氧瓶、厌氧罐中充入体积百分含量为80％N2+20％CO2的气体，充气至厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐内气体压力为100kPa。取经德国菌种保藏中心(DSMZ)保藏的编号为DSM No.2245B的Syntrophomonas wolfei subsp.wolfei活菌培养物在上述厌氧条件下接种到装有培养基的厌氧管中，随后在35℃条件下培养8天，该厌氧管的培养为1级培养；将1级培养后的厌氧管中的菌液在上述厌氧条件下全部接入到厌氧瓶中，随后在35℃条件下培养11天，该厌氧瓶的培养为2级培养；将2级培养后的厌氧瓶中的菌液在上述厌氧条件下全部接入到厌氧罐中,随后在35℃条件下培养14天，该厌氧罐的培养为3级培养，至此获得Syntrophomonas wolfei subsp.wolfei的单一菌液。
(2)Syntrophomonas sapovorans单一菌液制备
按照德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.347的培养基配方在体积百分含量为80％N2+20％CO2的厌氧条件下配制Syntrophomonas sapovorans的液体培养基，调节pH值为7.3，在上述厌氧条件下分装于25mL厌氧管、500mL厌氧瓶和20L的厌氧罐中，装填量以不超过厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐总体积的20％为宜，盖上密封盖并于121℃灭菌20分钟，灭菌冷却后向厌氧管、厌氧瓶、厌氧罐中充入体积百分含量为80％N2+20％CO2的气体，充气至厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐内气体压力为100kPa。取经德国菌种保藏中心(DSMZ)保藏的编号为DSM No.3441的Syntrophomonas sapovorans活菌培养物在上述厌氧条件下接种到装有培养基的厌氧管中，随后在37℃条件下培养14天，该厌氧管的培养为1级培养；将1级培养后的厌氧管中的菌液在上述厌氧条件下全部接入到厌氧瓶中，随后在37℃条件下培养11天，该厌氧瓶的培养为2级培养；将2级培养后的厌氧瓶中的菌液在上述厌氧条件下全部接入到厌氧罐中，随后在37℃条件下培养8天，该厌氧罐的培养为3级培养，至此获得Syntrophomonassapovorans的单一菌液。
(3)Syntrophomonas bryantii单一菌液制备
按照德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.325的培养基配方在体积百分含量为80％N2+20％CO2的厌氧条件下配制Syntrophomonas bryantii的液体培养基，调节pH值为7.2～7.4，在上述厌氧条件下分装于25mL厌氧管、500mL厌氧瓶和20L的厌氧罐中，装填量以不超过厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐总体积的20％为宜，盖上密封盖并于121℃灭菌20分钟，灭菌冷却后向厌氧管、厌氧瓶、厌氧罐中充入体积百分含量为80％N2+20％CO2的气体，充气至厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐内气体压力为100kPa。取经德国菌种保藏中心(DSMZ)保藏的编号为DSM No.3014B的Syntrophomonas bryantii活菌培养物在上述厌氧条件下接种到装有培养基的厌氧管中，随后在30℃条件下培养11天，该厌氧管的培养为1级培养；将1级培养后的厌氧管中的菌液在上述厌氧条件下全部接入到厌氧瓶中，随后在30℃条件下培养8天，该厌氧瓶的培养为2级培养；将2级培养后的厌氧瓶中的菌液在上述厌氧条件下全部接入到厌氧罐中，随后在30℃条件下培养14天，该厌氧罐的培养为3级培养，至此获得Syntrophomonasbryantii的单一菌液。
(4)Syntrophomonas erecta subsp.erecta单一菌液制备
按照德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.213的培养基配方在体积百分含量为80％N2+20％CO2的厌氧条件下配制Syntrophomonas erecta subsp.erecta的液体培养基，调节pH值为7.8，在上述厌氧条件下分装于25mL厌氧管、500mL厌氧瓶和20L的厌氧罐中，装填量以不超过厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐总体积的20％为宜，盖上密封盖并于121℃灭菌20分钟，灭菌冷却后向厌氧管、厌氧瓶、厌氧罐中充入体积百分含量为80％N2+20％CO2的气体，充气至厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐内气体压力为100kPa。取经德国菌种保藏中心(DSMZ)保藏的编号为DSM No.16215的Syntrophomonas erecta subsp.erecta活菌培养物在上述厌氧条件下接种到装有培养基的厌氧管中，随后在37℃条件下培养8天，该厌氧管的培养为1级培养；将1级培养后的厌氧管中的菌液在上述厌氧条件下全部接入到厌氧瓶中，随后在37℃条件下培养11天，该厌氧瓶的培养为2级培养；将2级培养后的厌氧瓶中的菌液在上述厌氧条件下全部接入到厌氧罐中，随后在37℃条件下培养14天，该厌氧罐的培养为3级培养，至此获得Syntrophomonas erecta subsp.erecta的单一菌液。
(5)Syntrophomonas zehnderi单一菌液制备
按照德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.347a的培养基配方在体积百分含量为80％N2+20％CO2的厌氧条件下配制Syntrophomonas zehnderi的液体培养基，调节pH值为7.0，在上述厌氧条件下分装于25mL厌氧管、500mL厌氧瓶和20L的厌氧罐中，装填量以不超过厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐总体积的20％为宜，盖上密封盖并于121℃灭菌20分钟，灭菌冷却后向厌氧管、厌氧瓶、厌氧罐中充入体积百分含量为80％N2+20％CO2的气体，充气至厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐内气体压力为100kPa。取经德国菌种保藏中心(DSMZ)保藏的编号为DSM No.17840的Syntrophomonas zehnderi活菌培养物在上述厌氧条件下接种到装有培养基的厌氧管中，随后在37℃条件下培养11天，该厌氧管的培养为1级培养；将1级培养后的厌氧管中的菌液在上述厌氧条件下全部接入到厌氧瓶中，随后在37℃条件下培养14天，该厌氧瓶的培养为2级培养；将2级培养后的厌氧瓶中的菌液在上述厌氧条件下全部接入到厌氧罐中，随后在37℃条件下培养8天，该厌氧罐的培养为3级培养，至此获得Syntrophomonaszehnderi的单一菌液。
(6)Syntrophomonas palmitatica单一菌液制备
按照德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.960的培养基配方在体积百分含量为80％N2+20％CO2的厌氧条件下配制Syntrophomonas palmitatica的液体培养基，调节pH值为7.0，在上述厌氧条件下分装于25mL厌氧管、500mL厌氧瓶和20L的厌氧罐中，装填量以不超过厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐总体积的20％为宜，盖上密封盖并于121℃灭菌20分钟，灭菌冷却后向厌氧管、厌氧瓶、厌氧罐中充入体积百分含量为80％N2+20％CO2的气体，充气至厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐内气体压力为100kPa。取经德国菌种保藏中心(DSMZ)保藏的编号为DSM No.18709的Syntrophomonas palmitatica活菌培养物在上述厌氧条件下接种到装有培养基的厌氧管中，随后在37℃条件下培养14天，该厌氧管的培养为1级培养；将1级培养后的厌氧管中的菌液在上述厌氧条件下全部接入到厌氧瓶中，随后在37℃条件下培养11天，该厌氧瓶的培养为2级培养；将2级培养后的厌氧瓶中的菌液在上述厌氧条件下全部接入到厌氧罐中，随后在37℃条件下培养8天，该厌氧罐的培养为3级培养，至此获得Syntrophomonas palmitatica的单一菌液。
(7)中温互营长链脂肪酸氧化菌菌液制备
方法一：将上述分别制得的Syntrophomonas wolfei subsp.wolfei单一菌液、Syntrophomonas sapovorans单一菌液、Syntrophomonas bryantii单一菌液、Syntrophomonas erecta subsp.erecta单一菌液、Syntrophomonas zehnderi单一菌液和Syntrophomonas palmitatica单一菌液在80％N2+20％CO2的厌氧条件下按照体积比为1∶1∶1∶1∶1∶1的比例进行混配，装入预先灭菌的无氧容器中，密封低温(2～8℃)保存备用。
方法二：将上述分别制得的Syntrophomonas wolfei subsp.wolfei单一菌液、Syntrophomonas sapovorans单一菌液、Syntrophomonas bryantii单一菌液、Syntrophomonas erecta subsp.erecta单一菌液、Syntrophomonas zehnderi单一菌液和Syntrophomonas palmitatica单一菌液在80％N2+20％CO2的厌氧条件下按照体积比为1∶1∶1∶1∶1∶5的比例进行混配，装入预先灭菌的无氧容器中，密封低温(2～8℃)保存备用。
方法三：将上述分别制得的Syntrophomonas wolfei subsp.wolfei单一菌液、Syntrophomonas sapovorans单一菌液、Syntrophomonas bryantii单一菌液、Syntrophomonas erecta subsp.erecta单一菌液、Syntrophomonaszehnderi单一菌液和Syntrophomonas palmitatica单一菌液在80％N2+20％CO2的厌氧条件下按照体积比为1∶1∶1∶1∶5∶1的比例进行混配，装入预先灭菌的无氧容器中，密封低温(2～8℃)保存备用。
方法四：将上述分别制得的Syntrophomonas wolfei subsp.wolfei单一菌液、Syntrophomonas sapovorans单一菌液、Syntrophomonas bryantii单一菌液、Syntrophomonas erecta subsp.erecta单一菌液、Syntrophomonas zehnderi单一菌液和Syntrophomonas palmitatica单一菌液在80％N2+20％CO2的厌氧条件下按照体积比为1∶1∶1∶5∶1∶1的比例进行混配，装入预先灭菌的无氧容器中，密封低温(2～8℃)保存备用。
方法五：将上述分别制得的Syntrophomonas wolfei subsp.wolfei单一菌液、Syntrophomonas sapovorans单一菌液、Syntrophomonas bryantii单一菌液、Syntrophomonas erecta subsp.erecta单一菌液、Syntrophomonas zehnderi单一菌液和Syntrophomonas palmitatica单一菌液在80％N2+20％CO2的厌氧条件下按照体积比为1∶1∶5∶1∶1∶1的比例进行混配，装入预先灭菌的无氧容器中，密封低温(2～8℃)保存备用。
方法六：将上述分别制得的Syntrophomonas wolfei subsp.wolfei单一菌液、Syntrophomonas sapovorans单一菌液、Syntrophomonas bryantii单一菌液、Syntrophomonas erecta subsp.erecta单一菌液、Syntrophomonas zehnderi单一菌液和Syntrophomonas palmitatica单一菌液在80％N2+20％CO2的厌氧条件下按照体积比为1∶5∶1∶1∶1∶1的比例进行混配，装入预先灭菌的无氧容器中，密封低温(2～8℃)保存备用。
方法七：将上述分别制得的Syntrophomonas wolfei subsp.wolfei单一菌液、Syntrophomonas sapovorans单一菌液、Syntrophomonas bryantii单一菌液、Syntrophomonas erecta subsp.erecta单一菌液、Syntrophomonas zehnderi单一菌液和Syntrophomonas palmitatica单一菌液在80％N2+20％CO2的厌氧条件下按照体积比为5∶1∶1∶1∶1∶1的比例进行混配，装入预先灭菌的无氧容器中，密封低温(2～8℃)保存备用。
实施例2中温互营长链脂肪酸氧化菌菌液的制备
根据生产的需要，可以扩大培养规模，进行四级培养。设置1m3的厌氧罐作为四级培养，相应菌种的培养基配方、接种方法、培养条件、混合菌液的混配体积比例与实施例1相同。
实施例3中温氢或乙酸营养型产甲烷菌菌液的制备
(1)Methanospirillum hungatei单一菌液制备
按照德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.119培养基配方在体积百分含量为80％N2+20％CO2的厌氧条件下配制Methanospirillum hungatei的液体培养基，调节pH值为7.2，在上述厌氧条件下分装于25mL厌氧管、500mL厌氧瓶和20L的厌氧罐中，装填量以不超过厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐总体积的20％为宜，盖上密封盖并于121℃灭菌20分钟，灭菌冷却后向厌氧管、厌氧瓶、厌氧罐中充入体积百分含量为80％N2+20％CO2的气体，充气至厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐内气体压力为100kPa。取经德国菌种保藏中心(DSMZ)保藏的编号为DSM No.864的Methanospirillum hungatei活菌培养物在上述厌氧条件下接种到装有培养基的厌氧管中，随后在35℃条件下培养8天，该厌氧管的培养为1级培养；将1级培养后的厌氧管中的菌液在上述厌氧条件下全部接入到厌氧瓶中，随后在35℃条件下培养11天，该厌氧瓶的培养为2级培养；将2级培养后的厌氧瓶中的菌液在上述厌氧条件下全部接入到厌氧罐中,随后在35℃条件下培养14天，该厌氧罐的培养为3级培养，至此获得Methanospirillum hungatei的单一菌液。
(2)Methanobacterium formicicum单一菌液制备
按照德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.119的培养基配方在体积百分含量为80％N2+20％CO2的厌氧条件下配制Methanobacterium formicicum的液体培养基，调节pH值为7.0，在上述厌氧条件下分装于25mL厌氧管、500mL厌氧瓶和20L的厌氧罐中，装填量以不超过厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐总体积的20％为宜，盖上密封盖并于121℃灭菌20分钟，灭菌冷却后向厌氧管、厌氧瓶、厌氧罐中充入体积百分含量为80％N2+20％CO2的气体，充气至厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐内气体压力为100kPa。取经德国菌种保藏中心(DSMZ)保藏的编号为DSM No.1535的Methanobacterium formicicum活菌培养物在上述厌氧条件下接种到装有培养基的厌氧管中，随后在37℃条件下培养14天，该厌氧管的培养为1级培养；将1级培养后的厌氧管中的菌液在上述厌氧条件下全部接入到厌氧瓶中，随后在37℃条件下培养11天，该厌氧瓶的培养为2级培养；将2级培养后的厌氧瓶中的菌液在上述厌氧条件下全部接入到厌氧罐中，随后在37℃条件下培养8天，该厌氧罐的培养为3级培养，至此获得Methanobacterium formicicum的单一菌液。
(3)Methanosarcina barkeri单一菌液制备
按照德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.120a的培养基配方在体积百分含量为80％N2+20％CO2的厌氧条件下配制Methanosarcina barkeri的液体培养基，调节pH值为7.0，在上述厌氧条件下分装于25mL厌氧管、500mL厌氧瓶和20L的厌氧罐中，装填量以不超过厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐总体积的20％为宜，盖上密封盖并于121℃灭菌20分钟，灭菌冷却后向厌氧管、厌氧瓶、厌氧罐中充入体积百分含量为80％N2+20％CO2的气体，充气至厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐内气体压力为100kPa。取经德国菌种保藏中心(DSMZ)保藏的编号为DSM No.800的Methanosarcina barkeri活菌培养物在上述厌氧条件下接种到装有培养基的厌氧管中，随后在35℃条件下培养11天，该厌氧管的培养为1级培养；将1级培养后的厌氧管中的菌液在上述厌氧条件下全部接入到厌氧瓶中，随后在35℃条件下培养8天，该厌氧瓶的培养为2级培养；将2级培养后的厌氧瓶中的菌液在上述厌氧条件下全部接入到厌氧罐中，随后在35℃条件下培养14天，该厌氧罐的培养为3级培养，至此获得Methanosarcinabarkeri的单一菌液。
(4)Methanosarcina acetivorans单一菌液制备
按照德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.141c的培养基配方在体积百分含量为80％N2+20％CO2的厌氧条件下配制Methanosarcina acetivorans的液体培养基，调节pH值为6.5，在上述厌氧条件下分装于25mL厌氧管、500mL厌氧瓶和20L的厌氧罐中，装填量以不超过厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐总体积的20％为宜，盖上密封盖并于121℃灭菌20分钟，灭菌冷却后向厌氧管、厌氧瓶、厌氧罐中充入体积百分含量为80％N2+20％CO2的气体，充气至厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐内气体压力为100kPa。取经德国菌种保藏中心(DSMZ)保藏的编号为DSM No.2834的Methanosarcina acetivorans活菌培养物在上述厌氧条件下接种到装有培养基的厌氧管中，随后在40℃条件下培养8天，该厌氧管的培养为1级培养；将1级培养后的厌氧管中的菌液在上述厌氧条件下全部接入到厌氧瓶中，随后在40℃条件下培养11天，该厌氧瓶的培养为2级培养；将2级培养后的厌氧瓶中的菌液在上述厌氧条件下全部接入到厌氧罐中，随后在40℃条件下培养14天，该厌氧罐的培养为3级培养，至此获得Methanosarcina acetivorans的单一菌液。
(5)Methanothrix soehngenii单一菌液制备
按照德国菌种保藏中心提供的编号为DSM No.334的培养基配方在体积百分含量为80％N2+20％CO2的厌氧条件下配制Methanothrix soehngenii的液体培养基，调节pH值为7.5，在上述厌氧条件下分装于25mL厌氧管、500mL厌氧瓶和20L的厌氧罐中，装填量以不超过厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐总体积的20％为宜，盖上密封盖并于121℃灭菌20分钟，灭菌冷却后向厌氧管、厌氧瓶、厌氧罐中充入体积百分含量为80％N2+20％CO2的气体，充气至厌氧管或厌氧瓶或厌氧罐内气体压力为100kPa。取经德国菌种保藏中心(DSMZ)保藏的编号为DSM No.2139的Methanothrix soehngenii活菌培养物在上述厌氧条件下接种到装有培养基的厌氧管中，随后在37℃条件下培养11天，该厌氧管的培养为1级培养；将1级培养后的厌氧管中的菌液在上述厌氧条件下全部接入到厌氧瓶中，随后在37℃条件下培养14天，该厌氧瓶的培养为2级培养；将2级培养后的厌氧瓶中的菌液在上述厌氧条件下全部接入到厌氧罐中，随后在37℃条件下培养8天，该厌氧罐的培养为3级培养，至此获得Methanothrixsoehngenii的单一菌液。
(6)中温氢或乙酸营养型产甲烷菌菌液制备
方法一：将上述分别制得的Methanospirillum hungatei单一菌液、Methanobacterium formicicum单一菌液、Methanosarcina barkeri单一菌液、Methanosarcina acetivorans单一菌液和Methanothrix soehngenii单一菌液在80％N2+20％CO2的厌氧条件下按照体积比为1∶1∶1∶1∶1的比例进行混配，装入预先灭菌的无氧容器中，密封低温(2～8℃)保存备用。
方法二：将上述分别制得的Methanospirillum hungatei单一菌液、Methanobacterium formicicum单一菌液、Methanosarcina barkeri单一菌液、Methanosarcina acetivorans单一菌液和Methanothrix soehngenii单一菌液在80％N2+20％CO2的厌氧条件下按照体积比为1∶1∶1∶1∶6的比例进行混配，装入预先灭菌的无氧容器中，密封低温(2～8℃)保存备用。
方法三：将上述分别制得的Methanospirillum hungatei单一菌液、Methanobacterium formicicum单一菌液、Methanosarcina barkeri单一菌液、Methanosarcina acetivorans单一菌液和Methanothrix soehngenii单一菌液在80％N2+20％CO2的厌氧条件下按照体积比为1∶1∶1∶6∶1的比例进行混配，装入预先灭菌的无氧容器中，密封低温(2～8℃)保存备用。
方法四：将上述分别制得的Methanospirillum hungatei单一菌液、Methanobacterium formicicum单一菌液、Methanosarcina barkeri单一菌液、Methanosarcina acetivorans单一菌液和Methanothrix soehngenii单一菌液在80％N2+20％CO2的厌氧条件下按照体积比为1∶1∶6∶1∶1的比例进行混配，装入预先灭菌的无氧容器中，密封低温(2～8℃)保存备用。
方法五：将上述分别制得的Methanospirillum hungatei单一菌液、Methanobacterium formicicum单一菌液、Methanosarcina barkeri单一菌液、Methanosarcina acetivorans单一菌液和Methanothrix soehngenii单一菌液在80％N2+20％CO2的厌氧条件下按照体积比为1∶6∶1∶1∶1的比例进行混配，装入预先灭菌的无氧容器中，密封低温(2～8℃)保存备用。
方法六：将上述分别制得的Methanospirillum hungatei单一菌液、Methanobacterium formicicum单一菌液、Methanosarcina barkeri单一菌液、Methanosarcina acetivorans单一菌液和Methanothrix soehngenii单一菌液在80％N2+20％CO2的厌氧条件下按照体积比为6∶1∶1∶1∶1的比例进行混配，装入预先灭菌的无氧容器中，密封低温(2～8℃)保存备用。
实施例4中温氢或乙酸营养型产甲烷菌菌液的制备
根据生产的需要，可以扩大培养规模，进行四级培养。设置1m3的厌氧罐作为四级培养，相应菌种的培养基配方、接种方法、培养条件、混合菌液的混配体积比例与实施例3相同。
实施例5复合菌剂的制备
制备方法一：
分别将实施例1制备的中温互营长链脂肪酸氧化菌菌液和实施例3制备的中温氢或乙酸营养型产甲烷菌菌液在体积百分含量为80％N2+20％CO2的厌氧条件下按体积比1∶9混合得到复合菌液，对复合菌液进行细胞计数，并通过离心浓缩至中温互营长链脂肪酸氧化菌与中温氢或乙酸营养型产甲烷菌的细胞总浓度为1×109个/mL，至此得到用于富含油脂原料中温沼气发酵系统的复合菌剂，封装低温(2～8℃)保存。制备方法二：
分别将实施例1制备的中温互营长链脂肪酸氧化菌菌液和实施例3制备的中温氢或乙酸营养型产甲烷菌菌液在体积百分含量为80％N2+20％CO2的厌氧条件下按体积比5∶5混合得到复合菌液，对复合菌液进行细胞计数，并通过离心浓缩至中温互营长链脂肪酸氧化菌与中温氢或乙酸营养型产甲烷菌的细胞总浓度为5×109个/mL，至此得到用于富含油脂原料中温沼气发酵系统的复合菌剂，封装低温(2～8℃)保存。制备方法三：
分别将实施例2制备的中温互营长链脂肪酸氧化菌菌液和实施例4制备的中温氢或乙酸营养型产甲烷菌菌液在体积百分含量为80％N2+20％CO2的厌氧条件下按体积比9∶1混合得到复合菌液，对复合菌液进行细胞计数，并通过离心浓缩至中温互营长链脂肪酸氧化菌与中温氢或乙酸营养型产甲烷菌的细胞总浓度为10×109个/mL，至此得到用于富含油脂原料中温沼气发酵系统的复合菌剂，封装低温(2～8℃)保存。
实施例6：复合菌剂效果试验
以富含油脂的餐厨垃圾作为原料进行中温沼气发酵，设置A、B、C、D四组批式沼气发酵实验，初始进料浓度为50gVS/L。其中实验组A，在沼气发酵启动时未添加本发明的复合菌剂；实验组B，在沼气发酵启动时添加实施例5制备方法一(其中的中温互营长链脂肪酸氧化菌菌液为按照实施例1(7)方法一制备得到，中温氢或乙酸营养型产甲烷菌菌液为按照实施例3(6)方法一制备得到)获得的复合菌剂，添加量为沼气发酵物料总体积的1％；实验组C，在沼气发酵启动时添加实施例5制备方法二(其中的中温互营长链脂肪酸氧化菌菌液为按照实施例1(7)方法一制备得到，中温氢或乙酸营养型产甲烷菌菌液为按照实施例3(6)方法一制备得到)获得的复合菌剂，添加量为沼气发酵物料总体积的1％；实验组D，在沼气发酵启动时添加实施例5制备方法三(其中的中温互营长链脂肪酸氧化菌菌液为按照实施例2的方法根据生产的需要，可以扩大培养规模，进行四级培养得到，且选择混合菌液的混配体积比例与实施例1(7)方法一相同；其中的中温氢或乙酸营养型产甲烷菌菌液为按照实施例4的方法根据生产的需要，可以扩大培养规模，进行四级培养得到，且选择混合菌液的混配体积比例与实施例3(6)方法一相同)获得的复合菌剂3，添加量为沼气发酵物料总体积的1％。整个发酵实验直至停止产气为止，即有机质降解完为止。实验结果如下：
实验组A，原料产气率为781L/kgVS，整个发酵过程持续69天，累积甲烷产量达到最终甲烷产量80％所需的时间为58d。
实验组B，原料产气率为790L/kgVS，整个发酵过程持续51天，累积甲烷产量达到最终甲烷产量80％所需的时间为39d。
实验组C，原料产气率为772L/kgVS，整个发酵过程持续49天，累积甲烷产量达到最终甲烷产量80％所需的时间为38d。
实验组D，原料产气率为795L/kgVS，整个发酵过程持续48天，累积甲烷产量达到最终甲烷产量80％所需的时间为36d。
以上实验结果说明，对于富含油脂原料的中温批式沼气发酵系统，添加本发明的复合菌剂能够强化挥发性脂肪酸氧化降解，提高富含油脂原料的产气速率，缩短发酵停留时间。
实施例7：复合菌剂效果试验
以富含油脂的餐厨垃圾作为原料进行中温沼气发酵，设置A、B、C、D四组连续式沼气发酵实验，每天的进料有机负荷为3.0kgVS/(m3.d)。其中实验组A，在沼气发酵启动时未添加本发明的复合菌剂；实验组B，在沼气发酵启动时添加实施例5制备方法一(其中的中温互营长链脂肪酸氧化菌菌液为按照实施例1(7)方法一制备得到，中温氢或乙酸营养型产甲烷菌菌液为按照实施例3(6)方法一制备得到)获得的复合菌剂，添加量为沼气发酵物料总体积的2％；实验组C，在沼气发酵启动时添加实施例5制备方法二(其中的中温互营长链脂肪酸氧化菌菌液为按照实施例1(7)方法一制备得到，中温氢或乙酸营养型产甲烷菌菌液为按照实施例3(6)方法一制备得到)获得的复合菌剂，添加量为沼气发酵物料总体积的2％；实验组D，在沼气发酵启动时添加实施例5制备方法三(其中的中温互营长链脂肪酸氧化菌菌液为按照实施例2的方法根据生产的需要，可以扩大培养规模，进行四级培养得到，且选择混合菌液的混配体积比例与实施例1(7)方法一相同；其中的中温氢或乙酸营养型产甲烷菌菌液为按照实施例4的方法根据生产的需要，可以扩大培养规模，进行四级培养得到，且选择混合菌液的混配体积比例与实施例3(6)方法一相同)获得的复合菌剂，添加量为沼气发酵物料总体积的2％。沼气发酵实验运行至第60天，分别监测各组的池容产气率以及发酵液上层油脂层厚度。
实验组A，池容产气率为2.5m3/(m3.d)，发酵液上层油脂层厚度为1.1cm。
实验组B，池容产气率为3.4m3/(m3.d)，发酵液上层油脂层厚度为0.3cm。
实验组C，池容产气率为3.5m3/(m3.d)，发酵液上层油脂层厚度为0.3cm。
实验组D，池容产气率为3.6m3/(m3.d)，发酵液上层油脂层厚度为0.2cm。
以上实验结果说明，对于富含油脂原料的中温连续式沼气发酵系统，添加本发明的复合菌剂能够强化挥发性脂肪酸氧化降解，提高富含油脂原料的池容产气率，池容产气率能提高约40％，同时避免发酵液上层油脂的严重积累。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种富含油脂原料中温沼气发酵系统的复合菌剂，其特征在于，该复合菌剂由中温互营长链脂肪酸氧化菌和中温氢和乙酸营养型产甲烷菌组成；
其中，所述的中温互营长链脂肪酸氧化菌为Syntrophomonas wolfei subsp.wolfei、Syntrophomonas sapovorans、Syntrophomonas bryantii、Syntrophomonas erectasubsp.erecta、Syntrophomonas zehnderi和Syntrophomonas palmitatica；
所述的中温氢或乙酸营养型产甲烷菌为Methanospirillum hungatei、Methanobacterium formicicum、Methanosarcina barkeri、Methanosarcina acetivorans和Methanothrix soehngenii；
六种中温互营长链脂肪酸氧化菌的细胞数量比为1∶1∶1∶1∶1∶1；
五种中温氢或乙酸营养型产甲烷菌的细胞数量比为1∶1∶1∶1∶1；
所述复合菌剂中，所述中温互营长链脂肪酸氧化菌和中温氢或乙酸营养型产甲烷菌的细胞总浓度至少为1×109个/mL，且中温互营长链脂肪酸氧化菌与中温氢或乙酸营养型产甲烷菌的细胞数量比为9∶1。
2.一种如权利要求1所述的富含油脂原料中温沼气发酵系统的复合菌剂的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)将中温互营长链脂肪酸氧化菌菌液和中温氢或乙酸营养型产甲烷菌菌液在厌氧条件下按体积比9∶1混合得到复合菌液；
(2)对步骤(1)得到的复合菌液进行细胞计数，并浓缩至中温互营长链脂肪酸氧化菌和中温氢或乙酸营养型产甲烷菌的细胞总浓度至少为1×109个/mL；
(3)封装并在2～8℃下保存，得到所述的中温沼气发酵系统的复合菌剂；
其中，所述的中温互营长链脂肪酸氧化菌为Syntrophomonas wolfei subsp.wolfei、Syntrophomonas sapovorans、Syntrophomonas bryantii、Syntrophomonas erectasubsp.erecta、Syntrophomonas zehnderi和Syntrophomonas palmitatica；
所述的中温氢或乙酸营养型产甲烷菌为Methanospirillum hungatei、Methanobacterium formicicum、Methanosarcina barkeri、Methanosarcina acetivorans和Methanothrix soehngenii。
3.根据权利要求1所述的复合菌剂在用于富含油脂原料中温沼气发酵系统中的用途，所述的中温指25～45℃。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，其中所述富含油脂原料为餐厨垃圾、屠宰废弃物或油脂加工废弃物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510037310.5A CN104498415B (zh) | 2015-01-26 | 2015-01-26 | 富含油脂原料中温沼气发酵系统的复合菌剂及其制备方法和用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510037310.5A CN104498415B (zh) | 2015-01-26 | 2015-01-26 | 富含油脂原料中温沼气发酵系统的复合菌剂及其制备方法和用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104498415A CN104498415A (zh) | 2015-04-08 |
| CN104498415B true CN104498415B (zh) | 2018-02-27 |
Family
ID=52939869
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510037310.5A Active CN104498415B (zh) | 2015-01-26 | 2015-01-26 | 富含油脂原料中温沼气发酵系统的复合菌剂及其制备方法和用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104498415B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104862259B (zh) * | 2015-06-11 | 2018-12-28 | 中国科学院成都生物研究所 | 高有机负荷中温沼气发酵复合菌剂、其制备方法和用途 |
| CN104974970B (zh) * | 2015-08-06 | 2018-01-26 | 农业部沼气科学研究所 | 高效厌氧降解油脂产甲烷的复合菌剂及制备方法和应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102533609A (zh) * | 2012-01-31 | 2012-07-04 | 农业部沼气科学研究所 | 沼气干发酵复合菌 |
| CN102559499A (zh) * | 2012-01-31 | 2012-07-11 | 农业部沼气科学研究所 | 一种沼气干发酵复合菌剂的制备方法 |
-
2015
- 2015-01-26 CN CN201510037310.5A patent/CN104498415B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102533609A (zh) * | 2012-01-31 | 2012-07-04 | 农业部沼气科学研究所 | 沼气干发酵复合菌 |
| CN102559499A (zh) * | 2012-01-31 | 2012-07-11 | 农业部沼气科学研究所 | 一种沼气干发酵复合菌剂的制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 沼气发酵复合菌系及其在牛粪厌氧发酵中的应用;戚桂娜;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20100915;全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104498415A (zh) | 2015-04-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Nagarajan et al. | Integration of anaerobic digestion and microalgal cultivation for digestate bioremediation and biogas upgrading | |
| Ahmad et al. | Renewable and sustainable bioenergy production from microalgal co-cultivation with palm oil mill effluent (POME): A review | |
| Kasmi | Biological processes as promoting way for both treatment and valorization of dairy industry effluents | |
| Lin et al. | Fermentative hydrogen production from wastewaters: a review and prognosis | |
| Zhu et al. | Evaluation of alternative methods of preparing hydrogen producing seeds from digested wastewater sludge | |
| Yu et al. | Hydrogen production from rice winery wastewater in an upflow anaerobic reactor by using mixed anaerobic cultures | |
| Shin et al. | Hydrogen production from food waste in anaerobic mesophilic and thermophilic acidogenesis | |
| Demirel et al. | Production of methane and hydrogen from biomass through conventional and high-rate anaerobic digestion processes | |
| Satyawali et al. | Wastewater treatment in molasses-based alcohol distilleries for COD and color removal: a review | |
| Fernandes et al. | Potential to produce biohydrogen from various wastewaters | |
| Kargi et al. | Hydrogen gas production from cheese whey powder (CWP) solution by thermophilic dark fermentation | |
| Namsree et al. | Anaerobic digestion of pineapple pulp and peel in a plug-flow reactor | |
| Pu et al. | Hydrogen production from acidogenic food waste fermentation using untreated inoculum: Effect of substrate concentrations | |
| CN104862259B (zh) | 高有机负荷中温沼气发酵复合菌剂、其制备方法和用途 | |
| Lu et al. | Pretreatment of brewery effluent to cultivate Spirulina sp. for nutrients removal and biomass production | |
| WO2006130557A2 (en) | Dual hydrogen production apparatus | |
| Rosa et al. | Review of continuous fermentative hydrogen-producing bioreactors from complex wastewater | |
| Wendt et al. | Evaluation of a high-moisture stabilization strategy for harvested microalgae blended with herbaceous biomass: Part I—Storage performance | |
| Vijayaraghavan et al. | Bio-hydrogen generation from mixed fruit peel waste using anaerobic contact filter | |
| CN103667101B (zh) | 酸化沼气发酵系统恢复产气的复合生物制剂及其制备方法 | |
| Li et al. | Advances in bioenergy | |
| CN104498415B (zh) | 富含油脂原料中温沼气发酵系统的复合菌剂及其制备方法和用途 | |
| WO2006130678A2 (en) | Dual method of hydrogen production | |
| WO2018088884A1 (es) | Método para obtener un consorcio microbiano para producir hidrógeno e hidrolizados a partir de sustratos complejos | |
| Wanqin et al. | Effects of Fe2+ on the anaerobic digestion of chicken manure: a batch study |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |