CN112795519A - 一种暹罗芽孢杆菌及其在富含乙偶姻食醋中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种暹罗芽孢杆菌及其在富含乙偶姻食醋中的应用，暹罗芽孢杆菌QH‑20009能够在酸性条件下生长代谢同时产淀粉酶、颗粒淀粉酶、普鲁兰酶和蛋白酶，应用于食品领域，可显著提高食醋酿造原料的淀粉利用率和不挥发酸含量，能够解决食醋酿造中存在的原料利用率不高的问题，保证了粮食的充分利用，提升食醋中氨基酸含量，并还可代谢糖类物质高产乙偶姻，可增加酿造食醋中乙偶姻含量，改善酿造食醋风味，提高食醋产品品质。

Description

一种暹罗芽孢杆菌及其在富含乙偶姻食醋中的应用

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种暹罗芽孢杆菌及其在富含乙偶姻食醋中的应用。

背景技术

醋是一种使用含淀粉、糖的原料经微生物发酵而成的酸性调味品，其中包含多种有机酸、氨基酸、肽、多酚、和黄酮类物质，赋予了食醋促消化、降血压、降血脂、软化血管、减肥、抗氧化等功能。

根据酿造原料不同，酿造食醋可分为谷物醋、果醋等。我国传统酿造食醋大多为谷物醋，使用大米、糯米、高粱、小麦等淀粉质原料，同时以谷壳为辅料，加入酒药、块曲、麸曲、酒母等发酵剂进行发酵生产。在目前酿造过程中，所用麸皮、谷壳等都未经蒸煮糊化而直接用生料进行发酵，其中含有大量淀粉不能被充分利用，导致发酵效率降低，不仅造成原料浪费，还增加环境负担。目前的工业生产中大多采用粉碎原料、添加复合酶制剂、高温浇淋醋醅、外加蔗糖、乳酸等方式来提高食醋酿造中原料利用率及改善并增强风味口感等，虽然有一定的改善效果，但提高了生产成本，也与人们日益追求的概念相悖，不利于高品质食醋的生产应用。

乙偶姻，即3-羟基-2-丁酮，是一种具有特殊奶油香味的化合物，也有类似蜂蜜的甜香，是食醋中一种重要的风味物质，同时也是川穹嗪(2，3，5，6-四甲基吡嗪)及其他吡嗪类物质的一种重要的前体物质，吡嗪类物质可以赋予食醋一种坚果香，烘烤香味。

芽孢杆菌是一类耐受性较强的细菌，部分对乙酸、高温具有耐受性，同时也被认为是一种食品级的安全菌株，具有丰富的酶系，能参与多种催化反应，具有较高的商业价值。但将其应用于食醋酿造，以提升其淀粉利用率及增强食醋口感风味的研究却鲜有报道。

发明内容

为了解决以上问题，本发明提供一种暹罗芽孢杆菌及其在富含乙偶姻食醋中的应用，能够在酸性条件下生长代谢并产酶，具有产生高活性耐酸性颗粒淀粉酶、普鲁兰酶、蛋白酶的能力，可显著提高食醋酿造原料的淀粉利用率和不挥发酸含量，能够解决食醋酿造中存在的原料利用率不高的问题，保证了粮食的充分利用，提升食醋中氨基酸含量，并还可代谢糖类物质高产乙偶姻，可增加酿造食醋中乙偶姻含量，改善酿造食醋风味，提高食醋产品品质。

本发明通过下述技术方案实现：

一种暹罗芽孢杆菌，所述暹罗芽孢杆菌为QH-20009，其保藏编号为：CGMCC No：21614，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2021年1月13日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

一种暹罗芽孢杆菌QH-20009的选育方法，包括如下步骤：1)从自然发酵状态的醋醅发酵池中，分别选取发酵第2、4、6、8、10、12、14、6、18、20、22、24天的醋醅，并将不同发酵周期醋醅样品均匀混合得到菌株筛选样本；2)取步骤1)样本置于生理盐水中，摇晃后静置，取上清液至富集培养基中，培养，然后取一定量富集液加入新鲜富集培养基中，如此重复3次后进行分离纯化；3)将富集完成的菌液进行梯度稀释后，涂布于固体筛选培养基平板上，35℃培养48h后，挑选具有明显水解透明圈生成的菌落；4)将具有明显透明水解圈的单菌落点种到颗粒淀粉复筛培养基或者普鲁兰糖复筛培养基上，35℃培养48h后，选取水解透明圈直径与单菌落直径比较大的菌落，进一步分离纯化，即得暹罗芽孢杆菌QH-20009菌株。

步骤3)中固体筛选培养基成分为：可溶性淀粉20g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，Na₂HPO₄ 0.5g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，琼脂20g/L，溶剂为蒸馏水。

暹罗芽孢杆菌QH-20009在富含乙偶姻食醋中的应用。

所述食醋为窖醋、麸醋、香醋或米醋。

暹罗芽孢杆菌QH-20009在富含乙偶姻食醋中的应用，将暹罗芽孢杆菌QH-20009经发酵培养获得的发酵液按2～10％的接种量加入醋醅中进行发酵。

发酵液的制备如下：1)斜面培养：将暹罗芽孢杆菌QH-20009接种至斜面培养基，在35℃培养24h，培养获得斜面菌体；2)一级种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至一级种子培养基，在35℃培养24h，获得一级种子液；3)二级种子培养：将一级种子液以体积浓度1～10％的接种量接种至二级种子培养基中，在35℃培养24-48h，获得二级种子液；4)发酵培养：选用液态发酵罐，加水搅拌，同时加入米粉和高温α-淀粉酶，搅拌加热到90-95℃，匀速搅拌约30min左右得到醪液，将醪液降温至45-55℃，缓慢搅拌条件下加入糖化酶并保温约20min左右，灭菌后，加入蛋白胨5-15g/L和酵母粉2-10g/L，灭菌后冷却至33-37℃，按照2～10％的接种量接入步骤3)的二级种子液，通气搅拌，33～40℃保压发酵20-48h，即得发酵液。

斜面培养基终浓度为：葡萄糖10-25g/L，蛋白胨3-15g/L，酵母粉2-10g/L，Na₂HPO₄0.2-2.0g/L，K₂HPO₄ 0.2-1.8g/L，MgSO₄ 0.03-0.15g/L，琼脂为20.0g/L，溶剂为去离子水，pH值为5.0-6.5；一级种子培养基终浓度组成为：葡萄糖10-25g/L，蛋白胨3-15g/L，酵母粉2-10g/L，Na₂HPO₄ 0.2-2.0g/L，K₂HPO₄ 0.2-1.8g/L，MgSO₄ 0.03-0.15g/L，琼脂为20.0g/L，溶剂为去离子水，pH值为5.0-6.5；二级种子培养基终浓度组成为：生玉米淀粉10-25g/L，蛋白胨3-15g/L，酵母粉2-10g/L，Na₂HPO₄ 0.2-2.0g/L，K₂HPO₄ 0.2-1.8g/L，MgSO₄ 0.03-0.15g/L，琼脂为20.0g/L，溶剂为去离子水，pH值为5.0-6.5。

步骤4)中高温α-淀粉酶用量为米粉质量的0.01-0.2％；糖化酶用量为米粉质量的0.02-0.4％。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

1、本发明一种暹罗芽孢杆菌QH-20009，能够在酸性条件下生长代谢同时产淀粉酶、颗粒淀粉酶、普鲁兰酶和蛋白酶，应用于食品领域，可提高原料的淀粉利用率和蛋白利用率；

2、本发明一种暹罗芽孢杆菌QH-20009，可在酸性条件下生长代谢并高产乙偶姻，运用到食醋酿造中可显著提高食醋中的乙偶姻含量；

3、本发明一种暹罗芽孢杆菌在富含乙偶姻食醋中的应用，利用暹罗芽孢杆菌QH-20009经发酵培养获得的发酵液作为生物酶催化剂催化水解食醋酿造中淀粉和蛋白质水解为还原糖和氨基酸，大大的提高了淀粉酶利用率、不挥发酸含量、食醋产品中的乙偶姻含量以及总氨基酸含量；

4、本发明一种暹罗芽孢杆菌在富含乙偶姻食醋中的应用，制备的食醋具有色泽黑亮、体态澄清等优点，同时具有良好的香味、滋味及风味。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为本发明菌株QH-20009的菌落形态；

图2为本发明菌株QH-20009的选育流程图；

图3为不同pH对本发明菌株QH-20009所产耐酸性颗粒淀粉酶酶活的影响；

图4为不同pH对本发明菌株QH-20009所产耐酸性普鲁兰酶酶活的影响。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1

暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)QH-20009的选育，如图2所示。

1、初筛

本发明从自然发酵状态的醋醅发酵池中，分别选取发酵第2、4、6、8、10、12、14、6、18、20、22、24天的醋醅，取样方式为发酵池四周从醋醅表面到底部垂直取样，然后将不同发酵周期醋醅样品均匀混合得到菌株筛选样本；筛选的具体方法：称取100g菌株筛选样本置于1000mL 0.85％的生理盐水中，摇晃后静置，取上清液至富集培养基中，于30℃，150r/min振荡培养2-3天；然后取10mL富集液加入100mL新鲜富集培养基中，如此重复3次后进行分离纯化；最后选用筛选培养基对菌株进行初筛，将富集完成的菌液进行梯度稀释后，涂布于固体筛选培养基平板上，35℃培养48h后，挑选具有明显水解透明圈生成的菌落进行进一步的复筛。

所用筛选培养基为：可溶性淀粉20g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，Na₂HPO₄ 0.5g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，琼脂20g/L，溶剂为蒸馏水。

2、复筛

复筛可以采用颗粒淀粉酶产生菌复筛或者普鲁兰酶产生菌复筛。

采用颗粒淀粉酶产生菌复筛的具体方法：挑取初筛时候具有明显透明水解圈的单菌落点种到颗粒淀粉复筛培养基上，35℃培养48h后，观察单菌落周围水解透明圈生成情况，选取水解透明圈直径与单菌落直径比较大的菌落，进一步在颗粒淀粉复筛培养基上进行分离纯化，得到纯种颗粒淀粉酶产生菌单菌落，即得暹罗芽孢杆菌QH-20009。

颗粒淀粉复筛培养基为：生玉米淀粉20g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，Na₂HPO₄0.5g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，琼脂20g/L，溶剂为蒸馏水，其中生玉米淀粉单独称取到称量瓶中，107℃烘箱干热灭菌2h后，在使用前加入到灭菌后的培养基中，混匀后倾倒平板。

采用普鲁兰酶产生菌复筛的具体方法：挑取初筛时具有明显水解透明圈的单菌落点种到普鲁兰糖复筛培养基上，35℃培养48h后，加入5mL无水乙醇于培养基表面，于4℃冰箱放置2h，取出观察菌落周围透明圈生成情况，挑选透明圈直径与单菌落直径比较大的菌落，进一步进行分离纯化，得到纯种普鲁兰酶产生菌，即得暹罗芽孢杆菌QH-20009。

3、菌株产酶活性测定

1)将筛选出的暹罗芽孢杆菌QH-20009菌株接种到斜面培养基，30℃培养48h后，于4℃冰箱保存。斜面培养基为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，Na₂HPO₄ 0.5g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄ 0.1g/L，琼脂为20.0g/L，溶剂为去离子水，pH值为6.0

2)将保存于斜面上的菌株接种至种子培养基中，在30℃培养24h；

3)将种子液以体积浓度1％的接种量接种至发酵培养基中，30℃，150rpm振荡培养60h，在12000g下离心5min，分离发酵液与湿菌体，取发酵液作为酶液进行相应酶活的测定，测试结果如表1所示。

表1暹罗芽孢杆菌QH-20009酶活力测定

从上表结果可以看出，本发明的暹罗芽孢杆菌QH-20009具有高产淀粉酶、颗粒淀粉酶、普鲁兰酶和蛋白酶的能力。

实施例2

菌株QH-20009鉴定

1、形态学鉴定：

将实施例1筛选得到的菌株QH-20009接种在固体培养基上，如图1所示，37℃培养24小时后形成不规则形状，质地软，中间凸起，内含黏液，边缘不整齐，有光泽的乳白色菌落，直径1-3mm。革兰氏染色观察：粉红色短杆状，无芽孢。

固体培养基组成：氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，琼脂20g/L，溶剂为去离子水。

2、分子生物学鉴定：

以菌株QH-20009的总DNA为模板，利用引物P1:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和P2:5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA -3'扩增菌株的16S rDNA基因，对该菌16S rDNA扩增及测序，得到该菌株的16S rDNA序列后，在NCBI网站上用BLAST检索GenBank中相关菌株的16SrDNA基因序列，并进行同源性比对。菌株QH-20009与Bacillus siamensis菌株同源性最高(homology，99％，based on 16S ribosomal RNA gene)，根据微生物遗传学鉴定原则，基于16S rDNA同源性高于95％，鉴定菌基本属于对照菌。因此，菌株QH-20009为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)，拟命名为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)QH-20009，保藏于中国微生物菌株管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No：21614，保藏日期2020年1月15日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

实施例3

发酵液的制备

1、斜面培养：

将暹罗芽孢杆菌QH-20009接种至斜面培养基，在35℃培养48h，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，Na₂HPO₄ 0.5g/L，K₂HPO₄0.5g/L，MgSO₄ 0.1g/L，琼脂为20.0g/L，溶剂为去离子水，pH值为6.0。

2、种子培养

一级种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，在35℃培养24h，获得一级种子液；所述一级种子培养基终浓度组成为：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，Na₂HPO₄ 0.5g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄ 0.1g/L，琼脂为20.0g/L，溶剂为去离子水，pH值为6.0。

二级种子培养：将一级种子液以体积浓度1～10％的接种量接种至二级种子培养基中，在35℃培养24-48h，获得二级种子液，优选接种量为5％；所述二级种子培养基终浓度组成为：优选二级种子培养基终浓度为：生玉米淀粉20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，Na₂HPO₄ 0.5g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄ 0.1g/L，琼脂为20.0g/L，溶剂为去离子水，pH值为6.0。

3、发酵培养

选用液态发酵罐，加水搅拌，同时加入米粉和高温α-淀粉酶，高温α-淀粉酶用量为米粉质量的0.05％，并搅拌加热到90-95℃，匀速搅拌约30min左右得到醪液，将醪液降温至45-55℃，缓慢搅拌条件下加入糖化酶并保温约20min左右，糖化酶用量为米粉质量的0.1％，加入蛋白胨1g/L和酵母粉0.5g/L，灭菌后冷却至33-37℃，按照5％的接种量接入上述二级种子液，通气搅拌，33～40℃保压发酵20-52h。发酵完成后，即得发酵液。

实施例4

不同pH对暹罗芽孢杆菌QH-20009生长的影响

配制LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)，用乳酸调节不同pH，于35℃，200rpm培养一定时间，培养基变浑浊，则表明菌株能在此pH条件下生长。结果如表2所示。

表2产酶菌株在不同pH条件下的生长情况

其中，pH 5.5和pH 4.8条件下，菌株接种后约8-12h长出，在pH 4.4和pH 4.0条件下，菌株16-24h长出，在pH 3.8条件下，菌株24h长出，在pH 3.5条件下，菌株在24-30h长出，这说明本发明的暹罗芽孢杆菌QH-20009能够在酸性环境下生长代谢。

实施例5

不同pH对暹罗芽孢杆菌QH-20009产酶活性的影响

配制磷酸缓冲液NaH₂PO₄-Na₂HPO₄(50mM，pH 5.8-8.0)、醋酸-醋酸钠(50mM，pH3.5-5.8)，以不同pH的缓冲液配制底物溶液，底物为生玉米淀粉，配制底物浓度为30g/L，以实施例3中发酵培养所得上清液做为酶液，于40℃反应条件下测定不同pH反应体系中的颗粒淀粉酶酶活，所得结果如图3所示。

配制磷酸缓冲液NaH₂PO₄-Na₂HPO₄(50mM，pH 5.8-7.2)、醋酸-醋酸钠(50mM，pH3.5-5.8)，以不同pH的缓冲液配制底物溶液，底物为普鲁兰多糖，配制底物浓度为30g/L，以实施例3中发酵培养所得上清液做为酶液，于40℃反应条件下测定不同pH反应体系中的普鲁兰酶酶活，所得结果如图4所示。

从图中可以看出，通过测定不同pH条件下，酶活的变化情况可知，菌株所产淀粉酶、颗粒淀粉酶、普鲁兰酶均能耐受较低pH环境，在pH 5.0-6.5条件下酶活变化不明显，且随着pH降低到3.8，可溶性淀粉酶、颗粒淀粉酶、普鲁兰酶等均能保持50％以上的活性(图3和图4)，这说明本发明暹罗芽孢杆菌QH-20009所产酶对低pH环境的耐受性，同时可在酸性条件下生长代谢并高产淀粉酶、普鲁兰酶、蛋白酶，证实了将其应用于食醋酿造的可行性。

实施例6

暹罗芽孢杆菌QH-20009产乙偶姻功能验证

斜面培养如实施例3所示，得到斜面种子。挑取斜面菌落接种到发酵培养基，37℃培养36h。所述发酵培养基组成为：葡萄糖10.0g/L，蛋白胨5.0g/L，KH₂PO₄ 5.0g/L，溶剂为去离子水，pH为7.0，121℃灭菌20min。

取发酵所得菌液，混和均匀，取1mL至1.5mL EP管中，8000r/min离心10min，取0.7mL上清液，加入0.1mL显色剂，震荡1～2min混匀，于37℃下反应60min，观察颜色变化，变红则为阳性。将反应之后的混合液在520nm处测定吸光度，以接菌但未加显色剂组做空白。所述显色剂组成为：0.3g肌酸，0.5g蛋白胨，再加入5％α-萘酚(正丙醇溶剂配制)，40％NaOH定容到100mL。

乙偶姻标准曲线制备：精确配制乙偶姻浓度梯度溶液，浓度梯度为：10-100mg/L，测定吸光度，以吸光度值为纵坐标，乙偶姻浓度值为横坐标，绘制标准曲线为：y＝0.0092x-0.0303，(R²＝0.9991)。

此暹罗芽孢杆菌QH-20009在发酵培养基中培养36h后，可以测得发酵液中乙偶姻含量为660.02mg/L，说明本发明暹罗芽孢杆菌QH-20009具有高产乙偶姻的能力。

实施例7

暹罗芽孢杆菌QH-20009在窖醋酿造中的应用

1、醋窖泥制备

将现有窖泥池底部及侧面窖泥取出，取窖泥位置应遍布整个窖泥池，共取出约100kg左右，加入二醋10kg，窖泥池发酵的鲜醋醅20kg，麸皮浸出液25kg，混合均匀后，接入20kg暹罗芽孢杆菌QH-20009发酵液，于30-35℃堆积培养5d，获得醋窖泥。成熟醋窖泥平铺涂敷在醋窖泥池的底部及侧面，涂敷厚度为10cm。对照组1中使用醋窖泥为窖泥池本身存在的醋窖泥。

2、酒醪液制备

称取大米250kg，高粱50kg，磨浆制粉，边搅拌边加水900kg，加入α-淀粉酶1kg，加热到90-95℃，匀速搅拌约30min左右得到醪液，将醪液降温至45-55℃，缓慢搅拌条件下加乳酸调醪液pH 4.7后加入2kg糖化酶并保温约20min左右，冷却至33-37℃，接入活性干酵母5kg，静置常温培养12-16h，即得酵母活化醪液。

3、菌株扩大培养

按实施例3中发酵液制备方式制得发酵液。

4、醋醅接种发酵

实验组1：发酵池内部从下而上铺谷壳540kg，加入麸皮4600kg，大曲200kg，麸曲250kg，将实施例3中制备的发酵液接入步骤1中制备的酒醪液中，混合均匀，成为含芽孢杆菌的酒醪液，将含芽孢杆菌的糖醪液接入发酵池(其中混合酒醪液温度约为33℃)，接种量为醪液总量的5％。待酒醪液浸入新醅后，在新醅表面接种100kg发酵至第9-11天的鲜醋醅，均匀铺散于新醅表面，进行人工翻醅。发酵周期前3天每天翻醅，之后隔天翻醅。翻醅完成后进行自然发酵。发酵过程取醋醅及卤汁测定相关理化指标。

对照组1：发酵池内部从下而上铺谷壳540kg，加入麸皮4600kg，大曲200kg，麸曲250kg，接入步骤1中制备的酒醪液8300kg(其中酒醪液温度约为33℃)，同时接入不含芽孢杆菌的对照糖醪液，用量为醪液总量的5％，待酒醪液浸入新醅后，在新醅表面接种100kg发酵至第9-11天的鲜醋醅，均匀铺散于新醅表面，进行人工翻醅。发酵周期前3天每天翻醅，之后隔天翻醅。翻醅完成后进行自然发酵。发酵过程取醋醅及卤汁测定相关理化指标。

5、醋窖泥池二次发酵

步骤4所得发酵醋醅转入醋窖泥池，压实，进一步用成熟醋窖泥密封，继续保持密封发酵25天，获得成熟窖醋醋醅。其中，实验组1醋醅转入新制备含枯草芽孢杆菌亚种的窖泥池，用相应制备的醋窖泥密封，而对照组1醋醅转入原本窖泥池，并使用原本醋窖泥密封。

6、淋醋

淋醋采用套淋方式得醋。将发酵池醋醅及卤汁全部铲入淋醋池，用上一轮的一醋进行浇淋，浸泡2h后取醋，所得为头醋，放入存储罐。再用上一轮二醋进行浇淋，浸泡2h后得一醋，放入中转罐，用于下一轮浇淋头醋。接着用自来水浸泡醋醅2h，所得为二醋，放入中转罐，用于下一轮浇淋一醋。

7、沉降灭菌灌装

所得头醋经管道的高温瞬时灭菌后，于储存罐进行沉降，沉降后抽取上层醋液经板框压滤后进入精制灌装流程，最终得到成品醋。

8、总酸含量监测

从发酵第一天开始至发酵结束，隔天取醋醅及池底卤汁进行检测。总酸以乙酸计，采用酸碱滴定法测定。发酵结束后，对照组1的总醅酸含量为5.26g/100g(湿醅)，实验组1的总醅酸含量为5.83g/100g(湿醅)。对照组1的窖泥池底滤出液总酸含量为6.95g/100mL，实验组1的窖泥池底滤出液总酸含量为7.78g/100mL.

9、不挥发酸含量检测

采用蒸馏方式除去挥发酸后，用酸碱滴定方式测定不挥发酸含量。窖泥池发酵结束后，对照组1的窖泥池底滤出液不挥发酸含量为3.68g/100mL，实验组1的窖泥池底滤出液不挥发酸含量为4.93g/100mL，不挥发酸占比分别为52.95％，63.36％，相对于对照组1，实验组1的不挥发酸占比提高了19.66％。

10、淀粉含量检测

醋醅淀粉含量按照GB 5009.9-2016中，采用酶解法测定。发酵结束当天对照组1和实验组1醋醅的淀粉含量分别为4.82g/100g和3.79g/100g。初始淀粉含量均为11.6g/100g，淀粉利用率分别为58.44％和67.32％，淀粉利用率提高了15.19％。

12、沉淀含量检测

采用离心法测定成品醋中沉淀含量，对照组1和实验组1的沉淀含量分别为303mg/100mL和242mg/100mL，实验组1相对于对照组1，沉淀含量减少了20.13％。

13、氨基酸含量检测

氨基酸含量测定按照《GB 5009.124-2016食品中氨基酸的测定》中的方法来测定。结果如表3所示，实验组1总氨基酸含量为1902mg/100mL，将暹罗芽孢杆菌QH-20009应用到窖醋发酵可使提升窖醋产品整体氨基酸含量，实验组1比对照组1的氨基酸含量增加了13.96％。

表3窖醋成品中氨基酸含量分析

14、风味物质含量检测

采用GC-MS方法测定风味物质乙偶姻及吡嗪类的含量，所述GC-MS方法为：美国安捷伦气质连用色谱仪，采用DB-Wax毛细管色谱柱，柱长30m，内径0.32mm；将预处理的样品加入2.0g氯化钠和转子,5ul浓度为250mg/L的2-辛醇，盖上样品盖,样品瓶顶空部分插入SPME萃取头,吸附时间40min,以500r/min的转速搅拌，后将萃取头插入GC-MS进样口,解析温度250℃,时间5min；载气：He；流速：1.0ml/min，分流比为2：1；柱温：进样口温度保持在250℃，起始气相色谱柱温维持在40℃3min，以5℃/min升温至60℃，再以10℃/min升温至230℃，保持5min。质谱条件：离子源温度230℃；接口温度280℃；电离方式：EI⁺；电子能量：70ev；扫描质量范围：33～450amu。

乙偶姻相关风味物质分析结果如表4所示。添加暹罗芽孢杆菌QH-20009可以显著增加窖醋中乙偶姻的含量，乙偶姻作为吡嗪类物质去前体物质，可进一步促进窖醋中吡嗪类物质的生成，得到富含乙偶姻及川穹嗪的窖醋，因川穹嗪及其它以乙偶姻为前体产生的吡嗪类物质具有降压、活血化瘀及改善冠心病及溶栓抑栓的功能，所以将暹罗芽孢杆菌QH-20009应用到窖醋酿造中，在赋予其更丰富的风味物质的同时，也在一定程度上强化了窖醋的健康保健的功能性。

表4窖醋成品中相关风味物质含量分析

15、成品醋感官指标分析

实验组1的成品醋色泽更黑亮，体态更澄清，酸味更柔和饱满醇厚，回味更悠长，说明在窖醋的醋酸发酵阶段与窖醋发酵阶段添加暹罗芽孢杆菌可以显著提高产品品质。

实施例8

暹罗芽孢杆菌QH-20009在麸醋酿造中的应用

1、酒醪液制备

与实施例7中酒醪液制备相同。

2、菌株扩大培养

按实施例3中发酵液制备方式制得发酵液。

3、醋醅接种发酵

对照组2、实验组2与实施例7中对照组1、实验组1中醋醅接种发酵的操作步骤相同。

发酵过程取醋醅及卤汁测定相关理化指标。

4、盐封

发酵周期第24天时，在醋醅表面均匀铺洒NaCl，进行翻醅，翻醅完成后，于醋醅表面铺洒NaCl。总NaCl用量为发酵池料水总量的1％。盐封3天后，进行淋醋。

5、淋醋

淋醋步骤与实施例7中相同。

6、沉降灭菌灌装

所得头醋经管道的高温瞬时灭菌后，于储存罐进行沉降，沉降后抽取上层醋液经板框压滤后进入精制灌装流程，最终得到成品醋。

7、总酸含量监测

从发酵第一天开始至发酵结束，隔天取醋醅及池底卤汁进行检测。总酸以乙酸计，采用酸碱滴定法测定。发酵结束后，对照组2的总醅酸含量为5.06g/100g(湿醅)，实验组2的总醅酸含量为5.58g/100g(湿醅)，对照组2的卤汁总酸含量为6.43g/100mL，实验组2的卤汁总酸含量为7.41g/100mL。

9、不挥发酸含量检测

采用蒸馏方式除去挥发酸后，用酸碱滴定方式测定不挥发酸含量。发酵结束后，对照组2的卤汁不挥发酸含量为3.39g/100mL，实验组2的卤汁不挥发酸含量为4.38g/100mL，不挥发酸占比分别为52.72％，59.11％，相对于对照组2，实验组2的不挥发酸占比提高了12.12％。

10、淀粉含量检测

醋醅淀粉含量按照GB 5009.9-2016中，采用酶解法测定。发酵结束当天对照组2和实验组2醋醅的淀粉含量分别为5.07g/100g和3.43g/100g。初始淀粉含量均为11.6g/100g，淀粉利用率分别为56.29％和70.43％，淀粉利用率提高了25.12％。

12、沉淀含量检测

采用离心法测定成品醋中沉淀含量，对照组2和实验组2的沉淀含量分别为375mg/100mL和293mg/100mL，实验组2相对于对照组2，沉淀含量减少了21.86％。

13、氨基酸分析

采用HPLC对样品中氨基酸含量进行分析。氨基酸含量如表5所示，发酵结束时，实验组2中氨基酸含量达到1756.82mg/100mL，对照组2卤汁中氨基酸含量1664.79mg/mL，添加暹罗芽孢杆菌组氨基酸含量提高了5.53％。

表5麸醋成品中氨基酸含量分析

14、风味物质分析

乙偶姻相关风味物质分析结果如表6所示。添加暹罗芽孢杆菌QH-20009可以显著增加麸醋中乙偶姻的含量，乙偶姻作为吡嗪类物质去前体物质，可进一步促进麸醋中吡嗪类物质的生成，得到富含乙偶姻及川穹嗪的麸醋，所以将暹罗芽孢杆菌QH-20009应用到麸醋酿造中，在赋予其更丰富的风味物质的同时，也在一定程度上强化了麸醋的健康保健的功能性。

表6麸醋成品中相关风味物质含量分析

15、成品醋感官指标分析

实验组2的成品醋色泽更黑亮，体态更澄清，酸味更柔和丰满，说明在发酵阶段添加暹罗芽孢杆菌可以显著提高产品品质。

实施例9

暹罗芽孢杆菌QH-20009在香醋酿造中的应用

1、酒醪液制备

称取糯米935kg，加水浸泡1h后，磨浆，边搅拌边加水至3272.5kg，加入α-淀粉酶1kg，加热到90-95℃，匀速搅拌约30min左右得到醪液，将醪液降温至45-55℃，缓慢搅拌条件下加乳酸调醪液pH 4.7后加入2kg糖化酶并保温约30min左右，补水至醪液总质量为4800kg，冷却至33-37℃，接入活性干酵母1kg，硫酸铵2kg，酸性蛋白酶0.3kg，静置培养发酵3-4天，即得酒醪液。

2、菌株扩大培养

按实施例3中发酵液制备方式制得发酵液。

3、醋醅接种发酵

实验组3：发酵池内部底层铺谷壳96kg，加入麸皮1600kg，接入步骤1中所制备的酒醪液4800kg，同时接入实施例3中制备的发酵液，接入量为料液总量的5％，待酒醪液浸入新醅后，翻拌均匀，在表面接种100kg发酵至第9-11天的鲜醋醅，均匀铺散于新醅表面，在新醅表面均匀铺盖72kg谷壳。

对照组3：发酵池内部底层铺谷壳96kg，加入麸皮1600kg，接入步骤1中所制备的酒醪液4800kg，同时接入与实验组3对照的不含芽孢杆菌的糖醪液，接入量为料液总量的5％，待酒醪液浸入新醅后，翻拌均匀，在表面接种100kg发酵至第9-11天的鲜醋醅，均匀铺散于新醅表面，在新醅表面均匀铺盖72kg谷壳。

按照分层扩种的方式，在每天都进行翻醅的情况下，于前7天每天接入72kg谷壳，之后进行每天定时翻醅的固态发酵直至发酵结束。

4、封醅

将发酵结束的醋醅压实，盖上塑料薄膜，在四周用100kg NaCl封实，封醅3天左右。

5、倒醅淋醋

揭开塑料薄膜，混入NaCl，翻拌均匀后，取入淋醋池进行淋醋。淋醋用一醋浸泡，并加入原料重量4％的炒米色。浸泡结束后取醋得头醋。一醋、二醋的套淋与实施例4中淋醋方式相同。

6、煎醋灌装

生醋进行高温瞬时灭菌沉降后，取出上层醋液，加入2％白砂糖，100℃进行煎煮，维持30min左右，煎煮结束后，即使趁热灌装。

7、总酸含量检测

从发酵第一天开始至发酵结束，隔天取醋醅及池底卤汁进行检测。总酸以乙酸计，采用酸碱滴定法测定。发酵结束后，对照组3的总醅酸含量为5.24g/100g(湿醅)，实验组3的总醅酸含量为5.82g/100g(湿醅)，对照组3的卤汁总酸含量为7.36g/100mL，实验组3的卤汁总酸含量为7.97g/100mL。

9、不挥发酸含量检测

采用蒸馏方式除去挥发酸后，用酸碱滴定方式测定不挥发酸含量。发酵结束后，对照组3的卤汁不挥发酸含量为1.54g/100mL，实验组3的卤汁不挥发酸含量为1.97g/100mL，不挥发酸占比分别为20.92％，24.71％，相对于对照组3，实验组3的不挥发酸提高了27.92％，不挥发酸占比提高了18.11％。

10、淀粉含量检测

醋醅淀粉含量按照GB 5009.9-2016中，采用酶解法测定。发酵结束当天对照组3和实验组3醋醅的淀粉含量分别为6.54g/100g和5.43g/100g。初始原料淀粉含量均为14.01g/100g，淀粉利用率分别为53.31％和61.24％，淀粉利用率提高了14.88％。

12、沉淀含量检测

采用离心法测定成品醋中沉淀含量，对照组3和实验组3的沉淀含量分别为483mg/100mL和318mg/100mL，实验组3相对于对照组3，沉淀含量减少了34.16％。

13、氨基酸含量分析

采用HPLC对样品中氨基酸含量进行分析。氨基酸含量如表7所示，发酵结束时，实验组3卤汁中氨基酸含量达到1239.33mg/100mL，对照组3卤汁中氨基酸含量1157.13mg/mL，添加暹罗芽孢杆菌组氨基酸含量提高了7.10％。

表7香醋成品中氨基酸含量分析

13、风味物质分析

乙偶姻相关风味物质分析结果如表8所示。添加暹罗芽孢杆菌QH-20009可以显著增加香醋中乙偶姻的含量，乙偶姻作为吡嗪类物质的前体物质，可进一步促进香醋中吡嗪类物质的生成，得到富含乙偶姻及川穹嗪的香醋，所以将暹罗芽孢杆菌QH-20009应用到香醋酿造中，在赋予其更丰富的风味物质的同时，也在一定程度上强化了香醋的健康保健的功能性。

表8相关风味物质组成分析

14、成品醋感官指标分析

实验组3的成品醋色泽更红亮，体态更澄清，酸味更柔和，说明在发酵阶段添加暹罗芽孢杆菌可以显著提高产品品质。

实施例10

暹罗芽孢杆菌QH-20009在米醋酿造中的应用

1、菌株扩大培养

按实施例3中发酵液制备方式制得发酵液。

2、酒醪液制备

称取糯米935kg，加水浸泡1h后，磨浆，边搅拌边加水至3272.5kg，加入α-淀粉酶1kg，加热到90-95℃，匀速搅拌约30min左右得到醪液，将醪液降温至45-55℃，缓慢搅拌条件下加乳酸调醪液pH 4.7后加入2kg糖化酶并保温约30min左右，补水至醪液总质量为4800kg，冷却至33-37℃，接入活性干酵母1kg，硫酸铵2kg，酸性蛋白酶0.3kg，按5％接种量接入步骤1中制备的发酵液，第一天通气搅拌培养(200rpm)，后三天静置培养，制得实验组4酒醪液。对照组4不接种发酵液，只接种活性干酵母。

3、醋酸发酵

在所得酒醪液中接种活化醋酸菌CGMCC 1.508接种量为5％，30℃，通气搅拌培养，200rpm，通气量0.34vvm，进行醋酸发酵。待发酵醪酒精度低于3vol％，实验组4中按5％接种量在中接入步骤1中制备的发酵液，对照组4中不接种发酵液，继续醋酸发酵。

4、总酸测定

采用酸碱滴定法测定总酸含量。发酵结束后，实验组4醪液中总酸含量为11.3g/100mL，对照组4中总酸含量为10.86g/100mL。

5、氨基酸测定

采用HPLC对样品中氨基酸含量进行分析。氨基酸含量如表9所示，发酵结束时，实验组4卤汁中氨基酸含量达到744.54mg/100mL，对照组4卤汁中氨基酸含量663.58mg/mL，添加暹罗芽孢杆菌组氨基酸含量提高了12.2％。

表9米醋成品中氨基酸含量分析

6、感官评价

实验组4与对照组4分别进行感官评定，发现实验组4的酸味较对照组4柔和，且有较突出的香甜的味道。经过GC-MS分析两者风味物质组成，发现实验组4中含有144.6mg/L的乙偶姻，，而对照组4中未检出。说明在酒精发酵和醋酸发酵阶段同时添加暹罗芽孢杆菌可以显著提高产品品质。

综上，本发明提供的暹罗芽孢杆菌QH-20009作为微生物发酵菌，能够应用于食醋酿造领域，并具有如下优点：1)淀粉酶利用率相比对照均有提高，在窖醋酿造中，添加暹罗芽孢杆菌组相比对照组淀粉利用率提高了15.19％，在麸醋酿造中，添加暹罗芽孢杆菌组相比对照组淀粉利用率提高了25.12％，在镇江香醋酿造中，添加暹罗芽孢杆菌组相比对照组淀粉利用率提高了14.88％；2)可提高不挥发酸含量，在窖醋酿造中，添加暹罗芽孢杆菌组相比对照组不挥发酸含量提高了19.66％，在麸醋酿造中，添加暹罗芽孢杆菌组相比对照组不挥发酸含量提高了12.12％，在香醋酿造中，添加暹罗芽孢杆菌组相比对照组不挥发酸含量提高了18.11％；3)可提高食醋产品中的乙偶姻含量，在窖醋酿造中，添加暹罗芽孢杆菌组相比对照组乙偶姻含量增加了209.96％，在麸醋酿造中，添加暹罗芽孢杆菌组相比对照组乙偶姻含量增加了206.83％，在香醋酿造中，添加暹罗芽孢杆菌组相比对照组乙偶姻含量增加了188.56％，在米醋酿造中，添加暹罗芽孢杆菌组检测出乙偶姻含量为144.6mg/L，而对照组3中未检出；4)可提升食醋产品的总氨基酸含量，在窖醋酿造中，添加暹罗芽孢杆菌组食醋中总氨基酸含量相比对照组中多出13.96％，在麸醋酿造中，添加暹罗芽孢杆菌组食醋中总氨基酸含量相比对照组中多出5.53％，在香醋酿造中，添加暹罗芽孢杆菌组食醋中总氨基酸含量相比对照组中多出7.10％，在米醋酿造中，添加暹罗芽孢杆菌组食醋中总氨基酸含量相比对照组中多出12.20％。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种暹罗芽孢杆菌，其特征在于，所述暹罗芽孢杆菌为QH-20009，其保藏编号为：CGMCC No：21614，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.一种暹罗芽孢杆菌QH-20009的选育方法，其特征在于，包括如下步骤：1)从自然发酵状态的醋醅发酵池中，分别选取发酵第2、4、6、8、10、12、14、6、18、20、22、24天的醋醅，并将不同发酵周期醋醅样品均匀混合得到菌株筛选样本；2)取步骤1)样本置于生理盐水中，摇晃后静置，取上清液至富集培养基中，培养，然后取一定量富集液加入新鲜富集培养基中，如此重复3次后进行分离纯化；3)将富集完成的菌液进行梯度稀释后，涂布于固体筛选培养基平板上，35℃培养48h后，挑选具有明显水解透明圈生成的菌落；4)将具有明显透明水解圈的单菌落点种到颗粒淀粉复筛培养基或者普鲁兰糖复筛培养基上，35℃培养48h后，选取水解透明圈直径与单菌落直径比较大的菌落，进一步分离纯化，即得暹罗芽孢杆菌QH-20009菌株。

3.根据权利要求2所述暹罗芽孢杆菌QH-20009的选育方法，其特征在于，步骤3)中固体筛选培养基成分为：可溶性淀粉20g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，Na₂HPO₄ 0.5g/L，K₂HPO₄0.5g/L，琼脂20g/L，溶剂为蒸馏水。

4.暹罗芽孢杆菌QH-20009在富含乙偶姻食醋中的应用。

5.根据权利要求4所述暹罗芽孢杆菌QH-20009在富含乙偶姻食醋中的应用，其特征在于，所述食醋为窖醋、麸醋、香醋或米醋。

6.根据权利要求4所述暹罗芽孢杆菌QH-20009在富含乙偶姻食醋中的应用，其特征在于，将权利要求1所述暹罗芽孢杆菌QH-20009经发酵培养获得的发酵液按2～10％的接种量加入醋醅中进行发酵。

7.根据权利要求6所述暹罗芽孢杆菌QH-20009在富含乙偶姻食醋中的应用，其特征在于，发酵液的制备如下：1)斜面培养：将暹罗芽孢杆菌QH-20009接种至斜面培养基，在35℃培养24h，培养获得斜面菌体；2)一级种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至一级种子培养基，在35℃培养24h，获得一级种子液；3)二级种子培养：将一级种子液以体积浓度1～10％的接种量接种至二级种子培养基中，在35℃培养24-48h，获得二级种子液；4)发酵培养：选用液态发酵罐，加水搅拌，同时加入米粉和高温α-淀粉酶，搅拌加热到90-95℃，匀速搅拌约30min左右得到醪液，将醪液降温至45-55℃，缓慢搅拌条件下加入糖化酶并保温约20min左右，灭菌后，加入蛋白胨5-15g/L和酵母粉2-10g/L，灭菌后冷却至33-37℃，按照2～10％的接种量接入步骤3)的二级种子液，通气搅拌，33～40℃保压发酵20-48h，即得发酵液。

8.根据权利要求7所述暹罗芽孢杆菌QH-20009在富含乙偶姻食醋中的应用，其特征在于，斜面培养基终浓度为：葡萄糖10-25g/L，蛋白胨3-15g/L，酵母粉2-10g/L，Na₂HPO₄0.2-2.0g/L，K₂HPO₄ 0.2-1.8g/L，MgSO₄ 0.03-0.15g/L，琼脂为20.0g/L，溶剂为去离子水，pH值为5.0-6.5；一级种子培养基终浓度组成为：葡萄糖10-25g/L，蛋白胨3-15g/L，酵母粉2-10g/L，Na₂HPO₄ 0.2-2.0g/L，K₂HPO₄ 0.2-1.8g/L，MgSO₄ 0.03-0.15g/L，琼脂为20.0g/L，溶剂为去离子水，pH值为5.0-6.5；二级种子培养基终浓度组成为：生玉米淀粉10-25g/L，蛋白胨3-15g/L，酵母粉2-10g/L，Na₂HPO₄ 0.2-2.0g/L，K₂HPO₄ 0.2-1.8g/L，MgSO₄ 0.03-0.15g/L，琼脂为20.0g/L，溶剂为去离子水，pH值为5.0-6.5。

9.根据权利要求7所述暹罗芽孢杆菌QH-20009在富含乙偶姻食醋中的应用，其特征在于，步骤4)中高温α-淀粉酶用量为米粉质量的0.01-0.2％；糖化酶用量为米粉质量的0.02-0.4％。

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