CN113430147A - 具有低pH耐受性的中村芽孢杆菌QH-20011及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有低pH耐受性的中村芽孢杆菌QH‑20011及其应用，所述中村芽孢杆菌QH‑20011保藏于中国微生物菌株管理委员会普通微生物中心，保藏名称为：QH‑20011，其保藏编号为：CGMCC No：22253。本发明所述中村芽孢杆菌QH‑20011能在酸性(pH 3.0)条件下生长代谢并产酶，具有产高活性蛋白酶及颗粒淀粉酶的的能力，将其运用于食醋酿造中，可显著提高食醋酿造原料的蛋白质利用率和淀粉利用率，提升食醋中游离氨基酸含量，特别是甜味氨基酸甘氨酸和苏氨酸的含量以及酸味氨基酸半胱氨酸的含量，并且可增加酿造食醋中乙偶姻及四甲基吡嗪的含量，提升酿造食醋风味与营养价值，提高食醋产品的品质。

Description

具有低pH耐受性的中村芽孢杆菌QH-20011及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及具有低pH耐受性的中村芽孢杆菌QH-20011及其应用。

背景技术

醋是一种使用含淀粉、糖的原料经微生物发酵而成的酸性调味品，其中包含多种有机酸、氨基酸、肽、多酚、和黄酮类物质，赋予了食醋促消化、降血压、降血脂、软化血管、减肥、抗氧化等功能。在目前固态酿造过程中，所用麸皮、谷壳等都未经蒸煮糊化而直接用生料进行发酵，其中含有大量淀粉与蛋白质不能被充分利用，导致发酵效率降低，不仅造成原料浪费，还增加环境负担。

食醋中的氨基酸能使食醋鲜味柔和，并增进色泽、调和香气。高品质食醋的氨基酸含量占总酸的4％以上，是调和食醋鲜香和绵酸风味的主要成分之一。同时，氨基酸在灭菌和陈酿阶段还能与醋醅和食醋中的还原糖发生美拉德反应，构成食醋的色泽和风味物质，提升食醋品质。随着人们生活水平的提高，人们对调味食品的需求逐渐向多样化、天然化、品质高档化的方向发展。如何通过酿造的方式提升食醋的氨基酸态氮含量，满足绿色、健康、营养的新时代属性，是现代食醋发酵生产的巨大使命。

芽孢杆菌是一类耐受性较强的细菌，部分对乙酸、高温具有耐受性，同时也被认为是一种食品级的安全菌株，具有丰富的酶系，能参与多种催化反应，具有较高的商业价值。但将其应用于食醋酿造，以提升其游离氨基酸含量以增强食醋口感风味与营养价值的研究却鲜有报道。

现有用于食醋酿造的芽孢杆菌虽然能够同时产蛋白酶与颗粒淀粉酶，在食醋中能增加原料利用率，但是低pH耐受性较差，在低pH环境(pH值小于5.0的环境)下，芽孢杆菌已不能生长对窖醋、麸醋的淀粉利用率的提升效果不明显，仅为10％左右，且对对窖醋及麸醋氨基酸含量的提升效果也不明显。

因此，选育具有更低pH耐受性的芽孢杆菌应用于食醋发酵，适应于食醋发酵过程低pH环境，用以提升食醋酿造中原料的淀粉利用率及蛋白利用率，具有重要的科学价值与工业化应用意义。

发明内容

本发明的目的在于提供具有低pH耐受性的中村芽孢杆菌QH-20011，该中村芽孢杆菌QH-20011不仅能够同时产蛋白酶与颗粒淀粉酶，且能耐受较较强的酸性环境，在pH 3.0条件下均能保持较高的酶活，同时该中村芽孢杆菌QH-20011在酸性条件下具有代谢高产乙偶姻的功能。

将该中村芽孢杆菌QH-20011用于食醋酿造，不仅能够显著提高淀粉及蛋白的利用率，提高食醋中游离氨基酸的含量，且可显著提高食醋中的乙偶姻的含量，提供食醋丰富的奶油香。

本发明通过下述技术方案实现：

具有低pH耐受性的中村芽孢杆菌QH-20011，所述中村芽孢杆菌QH-20011保藏于中国微生物菌株管理委员会普通微生物中心，保藏名称为：QH-20011，其保藏编号为：CGMCCNo：22253。

本申请的创造出发点在于：

第一，选育获取一株同时产蛋白酶与颗粒淀粉酶，且能耐受较强的酸性环境(pH3.0)的菌株。第二，将所选育的菌株应用于食醋酿造，获取具有丰富游离氨基酸含量的食醋，特别是丰富甜味氨基酸与酸味氨基酸含量，使食醋口感酸甜柔和。为食醋酿造行业提供新的有益微生物发酵菌株，为食醋行业整体所面临的解决原料利用率不高的问题提供了一个新的改善思路，促进行业的整体进步，保证粮食资源的充分利用，避免不必要的浪费。

本发明所述中村芽孢杆菌QH-20011的保藏日期2021年4月27日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为：Bacillusnakamurai。

本发明所述中村芽孢杆菌QH-20011是申请人从醋醅中分离获得，经检测具有高产颗粒淀粉酶、蛋白酶的能力，能在较低pH环境下生长代谢并产酶。

具有低pH耐受性的中村芽孢杆菌QH-20011在食品领域的应用。

进一步地，将中村芽孢杆菌QH-20011应用低pH环境，所述低pH环境的pH值为3.0-5.0。

具有低pH耐受性的中村芽孢杆菌QH-20011在食醋酿造中的应用。

进一步地，以中村芽孢杆菌QH-20011经发酵培养获得的发酵液为酶液，加入醋醅，催化醋醅中谷物原料中的淀粉和蛋白质水解产生能够发酵的糖和氨基酸，提供酵母菌、醋酸菌和乳酸菌生长代谢所需的碳、氮源及前体物质，促进乙醇和醋酸的生成。

进一步地，以中村芽孢杆菌QH-20011经发酵培养获得的发酵液为种子液，接入醋醅后，中村芽孢杆菌QH-20011在醋醅环境中继续生长繁殖代谢，进一步产生淀粉酶、蛋白酶，分泌到细胞外的醋醅环境中，促进谷物原料中淀粉和蛋白质水解生成能够发酵的糖和氨基酸，供微生物生长代谢所需。

进一步地，发酵液按如下方法制备：

S1、斜面培养：将中村芽孢杆菌QH-20011接种至斜面培养基，在35℃、200rpm条件下培养48h，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度为：蛋白胨3-15g/L，酵母粉2-10g/L，NaCl 5-12g/L，琼脂为20.0g/L，溶剂为去离子水，pH值为3.0-4.5(用乳酸调节)

S2、种子培养：分为一级种子培养和二级种子培养：

一级种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，在35℃培养24h，获得一级种子液；所述种子培养基终浓度组成为：蛋白胨3-15g/L，酵母粉2-10g/L，NaCl 5-12g/L，溶剂为去离子水，pH值为3.0-4.5(用乳酸调节)；

二级种子培养：将一级种子液以体积浓度1～10％的接种量接种至二级种子培养基中，在35℃培养24-48h，获得二级种子液；所述二级种子培养基终浓度组成为：脱脂奶粉8-12g/L，蛋白胨3-15g/L，酵母粉2-10g/L，NaCl 3-15g/L，溶剂为去离子水，pH值为3.0-4.5

S3、发酵培养：选用液态发酵罐，加水搅拌，同时加入米粉和麸皮粉末，并加入高温α-淀粉酶，高温α-淀粉酶用量为米粉与麸皮总质量的0.01-0.05％，并搅拌加热到90-95℃，匀速搅拌约30min左右得到醪液，将醪液降温至45-55℃，缓慢搅拌条件下加入糖化酶并保温约20min左右，糖化酶用量为米粉与麸皮总质量的0.02-0.4％，冷却至33-37℃，按照2～10％的接种量接入上述二级种子液，通气搅拌，33～40℃保压发酵20-48h。

进一步地，所述食醋为窖醋或麸醋。

进一步地，在制备窖醋时，发酵液按2～10％的接种量接种制备醋窖泥，同时在发酵初期同时按照2-10％的接种量接入醋醅中，通过翻醅工艺完成醋酸发酵，进一步移入醋窖泥池完成窖醋发酵，制得富含甜味氨基酸与酸味氨基酸的窖醋。

进一步地，在制备麸醋时，发酵液按2～10％的接种量接入醋醅中，通过翻醅混合均匀后，按照麸醋工艺进行发酵生产，制得富含甜味氨基酸与酸味氨基酸的麸醋。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

1、本发明提供了一株能够同时产蛋白酶和颗粒淀粉酶的菌株--中村芽孢杆菌QH-20011，该菌株可在酸性条件下(pH 3.0)生长代谢并高产蛋白酶与颗粒淀粉酶，应用于食品领域，可提高原料的蛋白利用率和淀粉利用率。

2、本发明提供的中村芽孢杆菌QH-20011，可在酸性条件下生长代谢并高产乙偶姻，运用到食醋酿造中可显著提高食醋中的乙偶姻含量，提供食醋丰富的奶油香，同时，也促进了四甲基吡嗪及4-乙基愈创木酚的含量相应增加，赋予食醋更多的健康功能。

3、本发明提供的中村芽孢杆菌QH-20011经发酵培养获得的发酵液可作为生物酶催化剂催化水解食醋酿造中淀粉和蛋白质，或中村芽孢杆菌QH-20011作为微生物发酵菌，应用于食醋酿造领域，可提高食醋中游离氨基酸的含量，特别是甜味氨基酸与酸味氨基酸的含量，在窖醋酿造中，添加中村芽孢杆菌QH-20011组相比对照组(未添加组)游离氨基酸含量提高了71.52％，在麸醋酿造中，添加中村芽孢杆菌组QH-20011相比对照组游离氨基酸含量提高了37.33％。游离氨基酸特别是甜味氨基酸与酸味氨基酸含量的增加，使食醋口感更加柔和绵长，酸甜绵柔，同时赋予食醋更多的营养的功能。

4、本发明所述中村芽孢杆菌QH-20011及其发酵液应用于食醋酿造可提高原料淀粉利用率，淀粉利用率相比对照均有提高，在窖醋酿造中，添加中村芽孢杆菌组相比对照组淀粉利用率提高了19.56％，在麸醋酿造中，添加中村芽孢杆菌组相比对照组淀粉利用率提高了20.67％。

5、本发明所述中村芽孢杆菌QH-20011及其发酵液应用于食醋酿造中可提高不挥发酸含量，在窖醋酿造中，添加中村芽孢杆菌组相比对照组不挥发酸含量提高了23.56％，在麸醋酿造中，添加中村芽孢杆菌组相比对照组不挥发酸含量提高了32.45％。

6、本发明所述中村芽孢杆菌QH-20011及及发酵液应用于食醋酿造中，可提高食醋产品中的乙偶姻含量，在窖醋酿造中，添加中村芽孢杆菌组相比对照组乙偶姻含量增加了229.82％，在麸醋酿造中，添加中村芽孢杆菌组相比对照组乙偶姻含量增加了221.86％。

7、本发明所述中村芽孢杆菌QH-20011应用于食醋酿造中，使淋出醋色泽黑亮、体态澄清，香味及滋味均优于对照组。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为本发明菌株QH-20011的菌落形态；

图2为本发明菌株QH-20011的选育流程图；

图3为QH-20011基于16S rDNA的进化树分析；

图4为不同pH对本发明菌株QH-20011所产耐酸性颗粒淀粉酶酶活的影响。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1：

中村芽孢杆菌(Bacillus nakamurai)QH-20011的选育，如图2所示，包括以下步骤：

1、蛋白酶产生菌初筛

本发明从申请人自身的自然发酵状态的醋醅发酵池中，分别选取发酵第2、4、6、8、10、12、14、6、18、20、22、24天的醋醅，取样方式为发酵池四周从醋醅表面到底部垂直取样，然后将不同发酵周期醋醅样品均匀混合得到菌株筛选样本。筛选的具体方法：称取100g醋醅样品置于1000mL 0.85％的生理盐水中，摇晃后静置，取上清液至富集培养基中，于30℃，150r/min振荡培养2-3天。取10mL富集液加入100mL新鲜富集培养基中，如此重复3次后进行分离纯化，所述富集培养基为：纯牛奶20g/L，葡萄糖10g/L，Na₂HPO₄ 0.5g/L，K₂HPO₄0.5g/L，溶剂为蒸馏水。

选用筛选培养基对菌株进行初筛，将富集完成的菌液进行梯度稀释后，涂布于固体筛选培养基平板上，35℃培养48h后，挑选具有明显水解透明圈生成的菌落进行进一步的复筛。所用筛选培养基为：纯牛奶20g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，Na₂HPO₄ 0.5g/L，K₂HPO₄0.5g/L，琼脂20g/L，溶剂为蒸馏水。

2、酸性蛋白酶产生菌复筛

挑取初筛时候具有明显透明水解圈的单菌落点种到酸性牛奶复筛培养基上，35℃培养48h后，观察单菌落周围水解透明圈生成情况，选取水解透明圈直径与单菌落直径比较大的菌落，进一步在酸性牛奶复筛培养基上进行分离纯化，得到纯种酸性蛋白酶产生菌单菌落。酸性蛋白酶复筛培养基为：纯牛奶20g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，乳酸钠5g/L，用乳酸调节pH至3.0，琼脂20g/L，溶剂为蒸馏水，其中琼脂与培养基溶液分别灭菌，在倾倒平板之前再混合到一起。

3、颗粒淀粉酶产生菌复筛

由步骤2得到的产酸性蛋白酶菌株点种到颗粒淀粉酶培养基平板上，35℃培养48h后，观察单菌落周围水解透明圈生成情况，选取水解透明圈直径与单菌落直径比较大的菌落，进一步在颗粒淀粉酶培养基平板上进行分离纯化，最终得到同时产蛋白酶、酸性蛋白酶及酸性颗粒淀粉酶的菌株。所述颗粒淀粉酶培养基为：生玉米淀粉20g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，溶剂为蒸馏水，其中生玉米淀粉单独称取到称量瓶中，107℃烘箱干热灭菌2h后，在使用前加入到灭菌后的培养基中，混匀后到平板。

4、菌株产酶活性测定

将步骤3筛选出的菌株接种到斜面培养基，30℃培养48h后，于4℃冰箱保存。所述斜面培养基为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，琼脂为20.0g/L，溶剂为去离子水，pH值为3.0。将保存于斜面上的菌株接种至种子培养基中，在30℃培养24h。将种子液以体积浓度1％的接种量接种至发酵培养基中，30℃，150rpm振荡培养60h，在12000g下离心5min，分离发酵液与湿菌体，取发酵液作为酶液进行相应酶活的测定，测定所得酶活较高的菌株进行进一步的研究。

蛋白酶酶活测定：以酪蛋白为底物(20g/L)，以NaH₂PO₄-Na₂HPO₄(50mM，pH 7.2)为缓冲液的条件下测定中性蛋白酶酶活，乳酸-乳酸钠(50mM，pH 3.8)缓冲液条件下测定酸性蛋白酶酶活。2mL酶液在40℃条件下预热5min，加入2mL底物溶液，保温反应10min，加入4mL三氯乙酸(0.4M)溶液，继续保温20min后，得反应液。对照反应为酶液预热后，4mL三氯乙酸(0.4M)溶液保温10min后，再加2mL底物溶液，继续保温20min后得对照反应液。用福林-酚法测定并计算酶活。

所述中性蛋白酶酶活定义为：在40℃条件下，以酪蛋白为底物，NaH₂PO₄-Na₂HPO₄(50mM，pH 7.2)缓冲液体系中，每1min释放1μg酪氨酸所需酶量为一个酶活力单位，及为1U。

所述酸性蛋白酶酶活定义为：在40℃条件下，以酪蛋白为底物，乳酸-乳酸钠(50mM，pH 3.0)缓冲液体系中，每1min释放1μg酪氨酸所需酶量为一个酶活力单位，及为1U。

颗粒淀粉酶酶活的测定：以生玉米淀粉作为底物，醋酸-醋酸钠缓冲液(50mM，pH5.8)作为溶剂溶解底物，配制30g/L的底物溶液。取5mL底物溶液与试管内，在40℃下保温5min，加入同样于此温度下保温5min的酶液30μL，200rpm反应30min，用200μL 200mMNaOH终止反应，再200rpm反应5min，得反应液。对照反应为：底物溶液于在40℃下保温5min，200rpm反应30min，用200μL 200mMNaOH终止反应，加入同样于40℃下保温5min的酶液30μL，再200rpm反应5min。用DNS法测定反应液与对照反应液中的葡萄糖生成量，计算颗粒淀粉酶酶活。

所述DNS法为：利用不同浓度梯度的葡萄糖标准溶液与DNS试剂进行反应，反应为2mL DNS试剂加2mL酶促反应液，沸水浴5min后，加入蒸馏水定容到25mL，混匀后，以对照组DNS反应作为空白，酶促反应DNS反应液在λ＝520nm下测定吸光度，根据吸光度计算酶活。

所述颗粒淀粉酶酶活定义为：在40℃条件下，以玉米生淀粉为底物，以醋酸-醋酸钠(50mM，pH 5.8)为缓冲液，每1min释放1μg还原糖(葡萄糖计)所需酶量为一个酶活力单位，记为1U。

pH对酶活的影响测定方法为：使相同浓度底物溶液溶解于不同pH的缓冲溶液中(50mM)，测定并计算酶活。所述底物为可溶性淀粉(2％)、玉米生淀粉(2％)。所述缓冲液为不同pH条件下的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄(50mM)缓冲液或醋酸-醋酸钠(50mM)缓冲液。

表1中村芽孢杆菌(Bacillus nakamurai)QH-20011酶活力测定

实施例2：

菌株QH-20011鉴定

1、形态学鉴定：

将实施例1筛选得到的菌株QH-20011接种在固体培养基上，37℃培养24小时后形成不规则形状，质地软，中间褶皱微突，内含少量黏液，边缘不整齐的乳白色菌落，直径1-4mm。革兰氏染色观察：粉红色短杆状，如图1所示。

固体培养基组成：氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，琼脂20g/L，溶剂为去离子水。

2、生理生化鉴定：

利用Biolog(GENⅢ)自动微生物鉴定系统对菌株QH-20011进行了94种表型测试，包括71种碳源利用情况检测以及23种化学敏感性检测：将菌株QH-20011接种于BUG平板培养基(BIOLOG UNIVERSAL GROWTH AGAR)，33℃恒温培养2天，用无菌棉签将平板上的菌体洗下，与接种液(IF-A)混合，制成菌悬液，用浊度计调整至91％T/IF-A。用8孔电动加液器将菌悬液分别加在BiologGENⅢ微孔鉴定板的各孔中，每孔100μL。将微孔鉴定板放在33℃培养箱中，分别在培养12h、24h、36h、48h后将其置于Biolog读数仪上读取结果。Biolog系统给出48h鉴定结果如表2和表3所示。

表2.菌株QH-20011对BiologGENⅢ板上71种碳源的利用能力

表3.菌株QH-20011对BiologGENⅢ板上23种化学物质的化学敏感性

3、分子生物学鉴定：

以菌株QH-20011的总DNA为模板，利用引物P1:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和P2:5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'扩增菌株的16S rDNA基因，委托上海生工对该菌16SrDNA扩增及测序，得到该菌株的16S rDNA序列(SEQ ID NO.1所示)后，在NCBI网站上用BLAST检索GenBank中相关菌株的16S rDNA基因序列，并进行同源性比对。菌株QH-20011与Bacillus nakamurai菌株同源性最高(homology，99％，based on 16S ribosomal RNAgene)，根据微生物遗传学鉴定原则，基于16S rDNA同源性高于95％，鉴定菌基本属于对照菌，QH-20011基于16S rDNA的进化树分析如图3所示。因此，菌株QH-20011为中村芽孢杆菌(Bacillus nakamurai)，拟命名为中村芽孢杆菌(Bacillus nakamurai)QH-20011，保藏于中国微生物菌株管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No：22253，保藏日期2021年4月27日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

实施例3：

发酵液及种子液的制备：

1、斜面培养：

将中村芽孢杆菌QH-20011接种至斜面培养基，在35℃培养48h，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，琼脂为20.0g/L，溶剂为去离子水，pH值为3.0(用乳酸调节)，琼脂与培养基分开灭菌，在到平板之前混合使用。

2、种子培养

分为一级种子培养和二级种子培养。

一级种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，在35℃培养24h，获得一级种子液；所述一级种子培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，溶剂为去离子水，pH值为3.0(用乳酸调节)；对照组为相同操作单不接种QH-20011的培养基。

二级种子培养：将一级种子液以体积浓度1～10％的接种量接种至二级种子培养基中，在35℃培养24-48h，获得二级种子液，优选接种量为5％；所述二级种子培养基终浓度组成为：优选二级种子培养基终浓度为：脱脂奶粉10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，溶剂为去离子水，pH值为3.0。对照组为相同组分且为接种QH-20011的培养基。

3、发酵培养

选用液态发酵罐，加水搅拌，同时加入米粉和麸皮粉末，同时加入高温α-淀粉酶，高温α-淀粉酶用量为米粉质量的0.05％，并搅拌加热到90-95℃，匀速搅拌约30min左右得到醪液，将醪液降温至45-55℃，缓慢搅拌条件下加入糖化酶并保温约20min左右，糖化酶用量为米粉及麸皮分总质量的0.1％，冷却至33-37℃，按照5％的接种量接入上述二级种子液，通气搅拌，33～40℃保压发酵20-52h。发酵完成后，所得发酵液即为酶液，所得菌液也作为接入醋醅发酵的种子液。对照组为相同处理但未接种QH-20011的醪液。

实施例4：

不同pH对中村芽孢杆菌QH-20011生长的影响：

配制LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)，用乳酸调节不同pH，于35℃，200rpm培养一定时间，培养基编浑浊，则菌株能在此pH条件下生长。结果如表4所示。其中，pH 5.5和pH 4.8条件下，菌株接种后约8-12h长出，在pH 4.4和pH 4.0条件下，菌株16-24h长出，在pH 3.8条件下，菌株24h长出，在pH 3.5条件下，菌株在24-30h长出，在pH 3.0条件下，菌株在24-48h长出。菌株具有较低的pH耐受性，适宜于醋醅环境生长代谢并产酶。

表4产酶菌株在不同pH条件下的生长情况

实施例5：

不同pH对中村芽孢杆菌QH-20011产酶活性的影响：

配制磷酸缓冲液NaH₂PO₄-Na₂HPO₄(50mM，pH 5.8-8.0)、醋酸-醋酸钠(50mM，pH3.0-5.8)，以不同pH的缓冲液配制底物溶液，底物为生玉米淀粉，配制底物浓度为30g/L，以实施例3中发酵培养所得上清液做为酶液，于40℃反应条件下测定不同pH反应体系中的颗粒淀粉酶酶活。所得结果如图4所示。

通过测定不同pH条件下，酶活的变化情况可知，菌株所产颗粒淀粉酶能耐受较低pH环境，在pH 5.0-6.5条件下酶活变化不明显，且随着pH降低到3.0，颗粒淀粉酶能保持50％以上的活性(如图4所示)，进一步证实了此中村芽孢杆菌所产酶对低pH环境的耐受性，进一步证实将其应用于食醋酿造的可行性。

实施例6：

中村芽孢杆菌QH-20011产乙偶姻功能验证：

斜面培养如实施例3所示，得到斜面种子。挑取斜面菌落接种到发酵培养基，37℃培养36h。所述发酵培养基组成为：葡萄糖10.0g/L，蛋白胨5.0g/L，KH₂PO₄ 5.0g/L，溶剂为去离子水，pH为7.0，121℃灭菌20min。

取发酵所得菌液，混和均匀，取1mL至1.5mL EP管中，8000r/min离心10min，取0.7mL上清液，加入0.1mL显色剂，震荡1～2min混匀，于37℃下反应60min，观察颜色变化，变红则为阳性。将反应之后的混合液在520nm处测定吸光度，以接菌但未加显色剂组做空白。所述显色剂组成为：0.3g肌酸，0.5g蛋白胨，再加入5％α-萘酚(正丙醇溶剂配制)，40％NaOH定容到100mL。

乙偶姻标准曲线制备：精确配制乙偶姻浓度梯度溶液，浓度梯度为：10-100mg/L，测定吸光度，以吸光度值为纵坐标，乙偶姻浓度值为横坐标，绘制标准曲线为：y＝0.0092x-0.0303，(R²＝0.9991)，通过测定此中村芽孢杆菌QH-20011在所述发酵培养基中培养36h后测得发酵液中乙偶姻含量为532.19mg/L。

实施例7：

中村芽孢杆菌QH-20011在窖醋酿造中的应用：

1、醋窖泥制备

现有窖泥池底部及侧面窖泥取出，取窖泥位置应遍布整个窖泥池，共取出约100kg左右，加入二醋10kg，窖泥池发酵的鲜醋醅20kg，麸皮浸出液25kg，混合均匀后，接入20kg中村芽孢杆菌QH-20011发酵液，于30-35℃堆积培养5d，获得醋窖泥。成熟醋窖泥平铺涂敷在醋窖泥池的底部及侧面，涂敷厚度为10cm。对照组1中使用醋窖泥为窖泥池本身存在的醋窖泥。

2、酒醪液制备

称取大米250kg，高粱50kg，磨浆制粉，边搅拌边加水900kg，加入α-淀粉酶1kg，加热到90-95℃，匀速搅拌约30min左右得到醪液，将醪液降温至45-55℃，缓慢搅拌条件下加乳酸调醪液pH 4.7后加入2kg糖化酶并保温约20min左右，冷却至33-37℃，接入活性干酵母5kg，静置常温培养12-16h，即得酵母活化醪液。

3、菌株扩大培养

按实施例3中发酵液及种子液制备方式制得发酵菌液。

4、醋醅接种发酵

对照组1：发酵池内部从下而上铺谷壳540kg，加入麸皮4600kg，大曲200kg，麸曲250kg，接入1中制备的酒醪液8300kg(其中酒醪液温度约为33℃)，同时接入实施例2中制备的对照糖醪液，用量为醪液总量的5％，待酒醪液浸入新醅后，在新醅表面接种100kg发酵至第9-11天的鲜醋醅，均匀铺散于新醅表面，进行人工翻醅。发酵周期前3天每天翻醅，之后隔天翻醅。翻醅完成后进行自然发酵。

实验组1：发酵池内部从下而上铺谷壳540kg，加入麸皮4600kg，大曲200kg，麸曲250kg，将实施例3中制备的发酵液接入1中制备的酒醪液中，混合均匀，成为含芽孢杆菌的酒醪液，将含芽孢杆菌的糖醪液接入发酵池(其中混合酒醪液温度约为33℃)，接种量为醪液总量的5％。待酒醪液浸入新醅后，在新醅表面接种100kg发酵至第9-11天的鲜醋醅，均匀铺散于新醅表面，进行人工翻醅。发酵周期前3天每天翻醅，之后隔天翻醅。翻醅完成后进行自然发酵。发酵过程取醋醅及卤汁测定相关理化指标。

5、醋窖泥池二次发酵

步骤4所得发酵醋醅转入醋窖泥池，压实，进一步用成熟醋窖泥密封，继续保持密封发酵25天，获得成熟窖醋醋醅。其中，实验组1醋醅转入新制备含中村芽孢杆菌的窖泥池，用相应制备的醋窖泥密封，而对照组1醋醅转入原本窖泥池，并使用原本醋窖泥密封。

6、淋醋

淋醋采用套淋方式得醋。将发酵池醋醅及卤汁全部铲入淋醋池，用上一轮的一醋进行浇淋，浸泡2h后取醋，所得为头醋，放入存储罐。再用上一轮二醋进行浇淋，浸泡2h后得一醋，放入中转罐，用于下一轮浇淋头醋。接着用自来水浸泡醋醅2h，所得为二醋，放入中转罐，用于下一轮浇淋一醋。

7、沉降灭菌灌装

所得头醋经管道的高温瞬时灭菌后，于储存罐进行沉降，沉降后抽取上层醋液经板框压滤后进入精制灌装流程，最终得到成品醋。

8、总酸含量监测

从发酵第一天开始至发酵结束，隔天取醋醅及池底卤汁进行检测。总酸以乙酸计，采用酸碱滴定法测定。发酵结束后，对照组1的总醅酸含量为5.14g/100g(湿醅)，实验组1的总醅酸含量为5.78g/100g(湿醅)。对照组1的窖泥池底滤出液总酸含量为6.83g/100mL，实验组1的窖泥池底滤出液总酸含量为7.46g/100mL

9、不挥发酸含量检测

采用蒸馏方式除去挥发酸后，用酸碱滴定方式测定不挥发酸含量。窖泥池发酵结束后，对照组1的窖泥池底滤出液不挥发酸含量为3.72g/100mL，实验组1的窖泥池底滤出液不挥发酸含量为5.02g/100mL，不挥发酸占比分别为54.46％，67.29％，相对于对照组1，实验组1的不挥发酸占比提高了23.56％。

10、淀粉含量检测

醋醅淀粉含量按照GB 5009.9-2016中，采用酶解法测定。发酵结束当天对照组1和实验组1醋醅的淀粉含量分别为4.85g/100g和3.53g/100g。初始淀粉含量均为11.6g/100g，淀粉利用率分别为58.19％和69.57％，淀粉利用率提高了19.56％。

12、沉淀含量检测

采用离心法测定成品醋中沉淀含量，对照组1和实验组1的沉淀含量分别为312mg/100mL和226mg/100mL，实验组1相对于对照组1，沉淀含量减少了27.56％。

13、氨基酸含量检测

氨基酸含量测定按照《GB 5009.124-2016食品中氨基酸的测定》中的方法来测定。结果如表5所示，实验组1总氨基酸含量为22591.08mg/L，将中村芽孢杆菌QH-20011应用到窖醋发酵可使提升窖醋产品整体氨基酸含量，实验组以比对照组一的氨基酸含量增加了71.52％。其中，酸味氨基酸半胱氨酸增加最为明显，甜味氨基酸甘氨酸、苏氨酸等含量也显著增加。这些氨基酸增加可以调和食醋的酸味，使其口感柔和，滋味绵长。

表5窖醋成品中氨基酸含量分析

14、风味物质含量检测

采用GC-MS方法测定风味物质乙偶姻及吡嗪类的含量，所述GC-MS方法为：美国安捷伦气质连用色谱仪，采用DB-Wax毛细管色谱柱，柱长30m，内径0.32mm；将预处理的样品加入2.0g氯化钠和转子,5ul浓度为250mg/L的2-辛醇，盖上样品盖,样品瓶顶空部分插入SPME萃取头,吸附时间40min,以500r/min的转速搅拌，后将萃取头插入GC-MS进样口,解析温度250℃,时间5min；载气：He；流速：1.0ml/min，分流比为2：1；柱温：进样口温度保持在250℃，起始气相色谱柱温维持在40℃3min，以5℃/min升温至60℃，再以10℃/min升温至230℃，保持5min。质谱条件：离子源温度230℃；接口温度280℃；电离方式：EI⁺；电子能量：70ev；扫描质量范围：33～450amu。

乙偶姻相关风味物质分析结果如表6所示。添加中村芽孢杆菌QH-20011可以显著增加窖醋中乙偶姻的含量，乙偶姻作为吡嗪类物质去前体物质，可进一步促进窖醋中吡嗪类物质的生成，得到富含乙偶姻及川穹嗪的窖醋，因川穹嗪及其它以乙偶姻为前体产生的吡嗪类物质具有降压、活血化瘀及改善冠心病及溶栓抑栓的功能，所以将中村芽孢杆菌QH-20011应用到窖醋酿造中，在赋予其更丰富的风味物质的同时，也在一定程度上强化了窖醋的健康保健的功能性。

表6窖醋成品中相关风味物质含量分析

15、成品醋感官指标分析

实验组1的成品醋色泽更黑亮，体态更澄清，酸味更柔和饱满醇厚，回味更悠长，说明在窖醋的醋酸发酵阶段与窖醋发酵阶段添加中村芽孢杆菌可以显著提高产品品质。

实施例8：

中村芽孢杆菌QH-20011在麸醋酿造中的应用

1、酒醪液制备

与实施例7中酒醪液制备相同。

2、菌株扩大培养

按实施例3中发酵液及种子液制备方式制得发酵菌液。

3、醋醅接种发酵

对照组2、实验组2与实施例7中对照组1、实施例1中醋醅接种发酵的操作步骤相同。

发酵过程取醋醅及卤汁测定相关理化指标。

4、盐封

发酵周期第24天时，在醋醅表面均匀铺洒NaCl，进行翻醅，翻醅完成后，于醋醅表面铺洒NaCl。总NaCl用量为发酵池料水总量的1％。盐封3天后，进行淋醋。

5、淋醋

淋醋步骤与实施例7中相同。

6、沉降灭菌灌装

所得头醋经管道的高温瞬时灭菌后，于储存罐进行沉降，沉降后抽取上层醋液经板框压滤后进入精制灌装流程，最终得到成品醋。

7、总酸含量监测

从发酵第一天开始至发酵结束，隔天取醋醅及池底卤汁进行检测。总酸以乙酸计，采用酸碱滴定法测定。发酵结束后，对照组2的总醅酸含量为5.12g/100g(湿醅)，实验组2的总醅酸含量为5.63g/100g(湿醅)，对照组2的卤汁总酸含量为6.56g/100mL，实验组2的卤汁总酸含量为7.46g/100mL。

9、不挥发酸含量检测

采用蒸馏方式除去挥发酸后，用酸碱滴定方式测定不挥发酸含量。发酵结束后，对照组2的卤汁不挥发酸含量为3.42g/100mL，实验组2的卤汁不挥发酸含量为4.53g/100mL，不挥发酸占比分别为52.13％，69.05％，相对于对照组2，实验组2的不挥发酸占比提高了32.45％。

10、淀粉含量检测

醋醅淀粉含量按照GB 5009.9-2016中，采用酶解法测定。发酵结束当天对照组2和实验组2醋醅的淀粉含量分别为5.12g/100g和3.78g/100g。初始淀粉含量均为11.6g/100g，淀粉利用率分别为55.86％和67.41％，淀粉利用率提高了20.67％。

12、沉淀含量检测

采用离心法测定成品醋中沉淀含量，对照组2和实验组2的沉淀含量分别为392mg/100mL和303mg/100mL，实验组2相对于对照组2，沉淀含量减少了22.70％。

13、氨基酸分析

采用HPLC对样品中氨基酸含量进行分析。氨基酸含量如表7所示，发酵结束时，实验组2中氨基酸含量达到18216.36mg/100mL，对照组2卤汁中氨基酸含量13264.59mg/mL，添加中村芽孢杆菌组氨基酸含量提高了37.33％。

表7麸醋成品中氨基酸含量分析

14、风味物质分析

乙偶姻相关风味物质分析结果如表8所示。添加中村芽孢杆菌QH-20011可以显著增加麸醋中乙偶姻的含量，乙偶姻作为吡嗪类物质去前体物质，可进一步促进麸醋中吡嗪类物质的生成，得到富含乙偶姻及川穹嗪的麸醋，所以将中村芽孢杆菌QH-20011应用到麸醋酿造中，在赋予其更丰富的风味物质的同时，也在一定程度上强化了麸醋的健康保健的功能性。

表8麸醋成品中相关风味物质含量分析

15、成品醋感官指标分析

实验组2的成品醋色泽更黑亮，体态更澄清，酸味更柔和丰满，说明在发酵阶段添加中村芽孢杆菌可以显著提高产品品质。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 千禾味业食品股份有限公司

<120> 具有低pH耐受性的中村芽孢杆菌QH-20011及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1408

<212> DNA

<213> 1(人工序列)

<400> 1

tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta 60

acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg 120

atgcttgttt gaaccgcatg gttcaaacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat 180

ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga cgatgcgtag 240

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ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga 1140

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gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg 1320

cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca 1380

cccgaagtcg gtgaggtaac cttttgga 1408

Claims (10)

1.具有低pH耐受性的中村芽孢杆菌QH-20011，其特征在于，所述中村芽孢杆菌QH-20011保藏于中国微生物菌株管理委员会普通微生物中心，保藏名称为：QH-20011，其保藏编号为：CGMCC No：22253。

2.如权利要求1所述的具有低pH耐受性的中村芽孢杆菌QH-20011在食品领域的应用。

3.根据权利要求2所述的具有低pH耐受性的中村芽孢杆菌QH-20011在食品领域的应用，其特征在于，将中村芽孢杆菌QH-20011应用低pH环境，所述低pH环境的pH值为3.0-5.0。

4.如权利要求1所述的具有低pH耐受性的中村芽孢杆菌QH-20011在食醋酿造中的应用。

5.根据权利要求4所述的具有低pH耐受性的中村芽孢杆菌QH-20011在食醋酿造中的应用，其特征在于，以中村芽孢杆菌QH-20011经发酵培养获得的发酵液为酶液，加入醋醅，催化醋醅中谷物原料中的淀粉和蛋白质水解产生能够发酵的糖和氨基酸，提供酵母菌、醋酸菌和乳酸菌生长代谢所需的碳、氮源及前体物质，促进乙醇和醋酸的生成。

6.根据权利要求4所述的具有低pH耐受性的中村芽孢杆菌QH-20011在食醋酿造中的应用，其特征在于，以中村芽孢杆菌QH-20011经发酵培养获得的发酵液为种子液，接入醋醅后，中村芽孢杆菌QH-20011在醋醅环境中继续生长繁殖代谢，进一步产生淀粉酶、蛋白酶，分泌到细胞外的醋醅环境中，促进谷物原料中淀粉和蛋白质水解生成能够发酵的糖和氨基酸，供微生物生长代谢所需。

7.根据权利要求5或6所述的具有低pH耐受性的中村芽孢杆菌QH-20011在食醋酿造中的应用，其特征在于，发酵液按如下方法制备：

S1、斜面培养：将中村芽孢杆菌QH-20011接种至斜面培养基，在35℃、200rpm条件下培养48h，获得斜面菌体；

S2、种子培养：分为一级种子培养和二级种子培养：

一级种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，在35℃培养24h，获得一级种子液；

二级种子培养：将一级种子液以体积浓度1～10％的接种量接种至二级种子培养基中，在35℃培养24-48h，获得二级种子液；

S3、发酵培养：选用液态发酵罐，加水搅拌，同时加入米粉和麸皮粉末，并加入高温α-淀粉酶，高温α-淀粉酶用量为米粉与麸皮总质量的0.01-0.05％，并搅拌加热到90-95℃，匀速搅拌约30min左右得到醪液，将醪液降温至45-55℃，缓慢搅拌条件下加入糖化酶并保温约20min左右，糖化酶用量为米粉与麸皮总质量的0.02-0.4％，冷却至33-37℃，按照2～10％的接种量接入上述二级种子液，通气搅拌，33～40℃保压发酵20-48h。

8.根据权利要求4所述的具有低pH耐受性的中村芽孢杆菌QH-20011在食醋酿造中的应用，其特征在于，所述食醋为窖醋或麸醋。

9.根据权利要求8所述的具有低pH耐受性的中村芽孢杆菌QH-20011在食醋酿造中的应用，其特征在于，在制备窖醋时，发酵液按2～10％的接种量接种制备醋窖泥，同时在发酵初期同时按照2-10％的接种量接入醋醅中，通过翻醅工艺完成醋酸发酵，进一步移入醋窖泥池完成窖醋发酵，制得富含甜味氨基酸与酸味氨基酸的窖醋。

10.根据权利要求8所述的具有低pH耐受性的中村芽孢杆菌QH-20011在食醋酿造中的应用，其特征在于，在制备麸醋时，发酵液按2～10％的接种量接入醋醅中，通过翻醅混合均匀后，按照麸醋工艺进行发酵生产，制得富含甜味氨基酸与酸味氨基酸的麸醋。

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