CN113930368B - 一种死谷芽孢杆菌及其在食醋酿造中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种死谷芽孢杆菌及其在食醋酿造中的应用，菌株的名称为死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)QH‑20001，其保藏编号为：CGMCC No.22251，保藏日期2021年4月27日，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本发明死谷芽孢杆菌应用在窖醋酿造，可在酸性条件下生长代谢并产α‑乙酰乳酸脱羧酶，能够避免α‑乙酰乳酸氧化为双乙酰再还原得到乙偶姻的步骤，迅速将α‑乙酰乳酸转化为乙偶姻，从而提供足够的川穹嗪的前提物质，可明显提高窖醋中的乙偶姻及川穹嗪的含量、平衡双乙酰的生成量。

Description

一种死谷芽孢杆菌及其在食醋酿造中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体而言，涉及一种死谷芽孢杆菌及其在食醋酿造中的应用。

背景技术

醋是一种使用含淀粉、糖的原料经微生物发酵而成的酸性调味品，其中包含多种有机酸、氨基酸、肽、多酚、和黄酮类物质，赋予了食醋促消化、降血压、降血脂、软化血管、减肥、抗氧化等生理功能，赋予食醋保健功能。在目前食醋中，已明确的功能因子有具有抗氧化作用的没食子酸、阿魏酸，具有降血脂、改善冠心病、清除自由基作用的川芎嗪等。川穹嗪也叫四甲基吡嗪，是一种具有烘烤香气和可可香气的风味物质，可以赋予食醋独特的风味与保健功能。

随着人们生活水平的提高，人们对调味食品的需求逐渐向多样化、天然化、品质高档化的方向发展。在保证食醋安全、营养丰富的同时，对其提出了保健的需求，满足绿色、健康、营养的新时代属性，是现代食醋发酵生产的巨大使命。

芽孢杆菌是一类耐受性较强的细菌，部分对乙酸、高温具有耐受性，同时也被认为是一种食品级的安全菌株，具有丰富的酶系，能参与多种催化反应，具有较高的商业价值。但将其应用于食醋酿造，以提升食醋川芎嗪含量以增强食醋口感风味与保健功能的研究却鲜有报道。

有鉴于此，特提出本申请。

发明内容

本发明为了克服现有技术的缺陷，提供了一种新的死谷芽孢杆菌及其在食醋酿造中的应用，为食醋酿造行业提供了新的酶源及有益微生物发酵菌株，能够在酸性条件下生长代谢并产α-乙酰乳酸脱羧酶，可将α-乙酰乳酸不经过氧化再还原的步骤即可迅速转化为乙偶姻，为川穹嗪的提供足够的前提物质。

本发明通过下述技术方案实现：

一种死谷芽孢杆菌，菌株的名称为死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)QH-20001，其保藏编号为：CGMCC No.22251，保藏日期2021年4月27日，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明的死谷芽孢杆菌QH-20001具有产α-乙酰乳酸脱羧酶的能力。

本发明提供一种死谷芽孢杆菌发酵液，将死谷芽孢杆菌QH-20001经发酵培养获得发酵液。

发酵液的制备方法如下：

1)斜面培养：将死谷芽孢杆菌QH-20001接种至斜面培养基，在35℃、200rpm条件下培养48h，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度为：葡萄糖10-25g/L，，酵母粉2-10g/L，Na₂HPO₄ 0.2-2.0g/L，K₂HPO₄ 0.2-1.8g/L，MgSO₄ 0.03-0.15g/L，琼脂为20.0g/L，溶剂为去离子水，pH值为5.0-6.5；优选斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，Na₂HPO₄0.5g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄ 0.1g/L，琼脂为20.0g/L，溶剂为去离子水，pH值为6.0。

2)种子培养：分为一级种子培养和二级种子培养。

一级种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，在35℃培养24h，获得一级种子液；所述一级种子培养基终浓度组成为：葡萄糖10-25g/L，，酵母粉2-10g/L，Na₂HPO₄ 0.2-2.0g/L，琼脂为20.0g/L，溶剂为去离子水，pH值为5.0-6.5；优选一级种子培养基终浓度组成为：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，Na₂HPO₄ 0.5g/L，琼脂为20.0g/L，溶剂为去离子水，pH值为6.0；

二级种子培养：将一级种子液以体积浓度1～10％的接种量接种至二级种子培养基中，在35℃培养24-48h，获得二级种子液，优选接种量为5％；所述二级种子培养基终浓度组成为：生玉米淀粉10-25g/L，酵母粉2-10g/L，Na₂HPO₄ 0.2-2.0g/L，琼脂为20.0g/L，溶剂为去离子水，pH值为5.0-6.5；优选二级种子培养基终浓度为：生玉米淀粉20g/L，酵母粉5g/L，Na₂HPO₄ 0.5g/L，琼脂为20.0g/L，溶剂为去离子水，pH值为6.0。

3)发酵培养：选用液态发酵罐，加水搅拌，同时加入米粉和高温α-淀粉酶，高温α-淀粉酶用量为米粉质量的0.01-0.2％，优选0.05％，并搅拌加热到90-95℃，匀速搅拌约30min左右得到醪液，将醪液降温至45-55℃，缓慢搅拌条件下加入糖化酶并保温约20min左右，糖化酶用量为米粉质量的0.02-0.4％，优选0.1％，加入酵母粉0.2-1g/L，优选酵母粉0.5g/L，灭菌后冷却至33-37℃，按照2～10％的接种量接入上述二级种子液，优选接种量为5％，通气搅拌，33～40℃保压发酵20-52h。

本发明还提供一种死谷芽孢杆菌QH-20003在食醋酿造，尤其是窖醋酿造中的应用，可明显提高窖醋中的乙偶姻及川芎嗪的含量，同时平衡双乙酰的生成量，平衡食醋的风味口感。

本发明死谷芽孢杆菌QH-20003在窖醋酿造中具体的应用方法为，将死谷芽孢杆菌QH-20001经发酵培养获得的发酵液按0.1-2％的接种量加入醋醅中进行发酵，优选的死谷芽孢杆菌QH-20001发酵液接种量为0.5％；发酵结束后，将醋醅移入接种了死谷芽孢杆菌QH-20001发酵液的窖泥池进行二次发酵，窖泥池中死谷芽孢杆菌QH-20001发酵液的接种量为0.5-2％，优选的，窖泥池中死谷芽孢杆菌QH-20001发酵液的接种量为1.5％。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

1、本发明实施例提供的一种死谷芽孢杆菌，可在酸性条件下生长代谢并产α-乙酰乳酸脱羧酶，能够避免α-乙酰乳酸氧化为双乙酰再还原得到乙偶姻的步骤，迅速将α-乙酰乳酸转化为乙偶姻，从而提供足够的川穹嗪的前提物质；

2、本发明实施例提供的一种死谷芽孢杆菌，经发酵培养获得发酵液作为种子液应用到窖醋酿造，可明显提高窖醋中的乙偶姻及川穹嗪的含量、平衡双乙酰的生成量，其中，乙偶姻含量提高了180.81％，双乙酰的含量降低了72.84％，川芎嗪生成量增加了55.48％，提高了食醋的风味口感；

3、本发明实施例提供的一种死谷芽孢杆菌在窖醋酿造中的应用，该菌株及其发酵液应用于窖醋酿造所得食醋，经陶坛陈酿后，香味较有明显提升，且川芎嗪含量提升了183.93％。

附图说明

为了更清楚地说明本发明示例性实施方式的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例提供的菌株QH-20001的菌落形态；

图2为本发明实施例提供的QH-20001基于16S rDNA的进化树分析；

图3为本发明实施例提供的QH-20001在不同pH条件下所测得α-乙酰乳酸脱羧酶酶活。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

在以下描述中，为了提供对本发明的透彻理解阐述了大量特定细节。然而，对于本领域普通技术人员显而易见的是：不必采用这些特定细节来实行本本发明。在其他实施例中，为了避免混淆本本发明，未具体描述公知的结构、电路、材料或方法。

在整个说明书中，对“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”或“示例”的提及意味着：结合该实施例或示例描述的特定特征、结构或特性被包含在本本发明至少一个实施例中。因此，在整个说明书的各个地方出现的短语“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”或“示例”不一定都指同一实施例或示例。此外，可以以任何适当的组合和、或子组合将特定的特征、结构或特性组合在一个或多个实施例或示例中。此外，本领域普通技术人员应当理解，在此提供的示图都是为了说明的目的，并且示图不一定是按比例绘制的。这里使用的术语“和/或”包括一个或多个相关列出的项目的任何和所有组合。

在本发明的描述中，术语“前”、“后”、“左”、“右”、“上”、“下”、“竖直”、“水平”、“高”、“低”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明保护范围的限制。

实施例1

α-乙酰乳酸脱羧酶产生菌的筛选

1、初筛

本发明从千禾味业食品股份有限公司自然发酵状态的醋醅发酵池中，分别选取发酵第2、4、6、8、10、12、14、6、18、20、22、24天的醋醅，取样方式为发酵池四周从醋醅表面到底部垂直取样，然后将不同发酵周期醋醅样品均匀混合得到菌株筛选样本。筛选的具体方法：称取100g醋醅样品置于1000mL 0.85％的生理盐水中，于70℃水浴摇床中国震荡孵育20min，静置放置，分理处上清液。将上清液用0.85％的生理盐水稀释后涂布LB固体培养基平板(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，琼脂为20g/L，溶剂为去离子水)，于35℃培养箱倒置培养24h。

24h培养后，可见固体培养基表面长出大大小小的单菌落，其中有中间凸起、内含黏液的单菌落，将其接种到发酵液体培养基中，于37℃，180rpm进行富集培养24h，得到菌株富集液。所述发酵液体培养基为：葡萄糖10.0g/L，蛋白胨5.0g/L，KH₂PO₄ 5.0g/L，溶剂为去离子水，pH为7.0，121℃灭菌20min。

取1mL菌液，常温12000rpm离心1min之后取0.7mL上清液，加入0.1mL显色剂，震荡1～2min混匀，于37℃下反应60min，观察颜色变化，变红则为阳性。将变红的试样对应的样品中菌株在LB平板上进行划线培养，分离出单菌落即可得到α-乙酰乳酸脱羧酶产生菌。所述显色剂组成为：0.3g肌酸，0.5g蛋白胨，再加入5％α-萘酚(正丙醇溶剂配制)，40％NaOH定容到100mL。

2、复筛

粗酶液制备：将实施例1中划线分离所获取的阳性菌株的单菌落挑取接种到发酵液体培养基中，于37℃，180rpm培养48h得到菌株发酵液。所得发酵液于4℃，12000rpm离心5min之后得到发酵菌体。称取发酵菌体0.1g用2mL 0.85％生理盐水重悬并离心的方式进行清洗，重复清洗三次得到菌体。所得菌体用pH 6.2，200mM的磷酸缓冲液悬浮，要那个超声波破碎仪间断破碎处理30min，4℃，12000rpm离心10min出去细胞碎片，所得上清液即为粗酶液。

酶活力测定：在反应总体积为700μL，α-乙酰乳酸为底物(由pH 6.2，200mM磷酸缓冲液配制)，加入200μL粗酶液，混匀后于30℃反应20min，加入0.1mL显色剂以终止酶促反应，显色剂配制方式与实施例1相同。混匀后于室温放置1h，于522nm处测定吸光度值(OD)，根据OD值计算酶活力。一个酶活力单位(U)定义为：在30℃，pH 6.2的200mM的磷酸缓冲液的条件下，每分钟催化α-乙酰乳酸反应生成1μmol乙偶姻所需的酶量。

表1阳性菌株复筛酶活力测定

表1可知，在初筛10株菌株中，对α-乙酰乳酸脱氢酶活力进行测定发现，10株菌株酶活差异较大，其中A9菌株所测得酶活最高，可作为目标菌株进行进一步研究。

将A9进行培养并用终浓度为15％甘油进行保藏，编号为QH-20001。

实施例2

菌株QH-20001鉴定

1、形态学鉴定：

将实施例1筛选得到的菌株QH-20001接种在固体培养基上，37℃培养24小时后形成不规则形状，中间凸起，内含黏液，边缘锯齿状的乳白色菌落，菌落直径1-4mm。革兰氏染色观察：粉红色短杆状。

固体培养基组成：氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，琼脂20g/L，溶剂为去离子水。

2、生理生化鉴定：

利用Biolog(GENⅢ)自动微生物鉴定系统对菌株QH-20001进行了94种表型测试，包括71种碳源利用情况检测以及23种化学敏感性检测：将菌株QH-20001接种于BUG平板培养基(BIOLOG UNIVERSAL GROWTH AGAR)，33℃恒温培养2天，用无菌棉签将平板上的菌体洗下，与接种液(IF-A)混合，制成菌悬液，用浊度计调整至91％T/IF-A。用8孔电动加液器将菌悬液分别加在BiologGENⅢ微孔鉴定板的各孔中，每孔100μL。将微孔鉴定板放在33℃培养箱中，分别在培养12h、24h、36h、48h后将其置于Biolog读数仪上读取结果。Biolog系统给出48h鉴定结果如表2和表3所示。

表2.菌株QH-20001对BiologGENⅢ板上71种碳源的利用能力

表3.菌株QH-20001对BiologGENⅢ板上23种化学物质的化学敏感性

3、分子生物学鉴定：

以菌株QH-20001的总DNA为模板，利用引物P1:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和P2:5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'扩增菌株的16S rDNA基因，委托上海生工对该菌16SrDNA扩增及测序，得到该菌株的16S rDNA序列后，在NCBI网站上用BLAST检索GenBank中相关菌株的16S rDNA基因序列，并进行同源性比对。菌株QH-20001与Bacillus vallismortis菌株同源性最高(homology，99％，based on 16S ribosomal RNA gene)，根据微生物遗传学鉴定原则，基于16S rDNA同源性高于95％，鉴定菌基本属于对照菌。因此，菌株QH-20001为死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)，拟命名为死谷芽孢杆菌(Bacillusvallismortis)QH-20001，保藏于中国微生物菌株管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No：22251，保藏日期2020年1月15日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

实施例3

不同pH对死谷芽孢杆菌QH-20001生长的影响

配制LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)，用乳酸调节不同pH，于35℃，200rpm培养一定时间，培养基变浑浊，则菌株能在此pH条件下生长。结果如表4所示。其中，pH 5.5和pH 4.8条件下，菌株接种后约8-12h长出，在pH 4.4和pH 4.0条件下，菌株16-24h长出，在pH 3.8条件下，菌株24h长出，在pH 3.5条件下，菌株在24-30h长出，在pH 3.0条件下，菌株在24-48h未长出，但在继续培养至57h时候长出。可见，此死谷芽孢杆菌QH-20001可在较低pH环境中生长代谢，适应于低pH的培养条件，进一步证实其可在醋醅环境中生长代谢。

表4产酶菌株在不同pH条件下的生长情况

实施例4

不同pH对死谷芽孢杆菌QH-20001产酶活性的影响

配制磷酸缓冲液NaH₂PO₄-Na₂HPO₄(50mM，pH 5.8-8.0)、醋酸-醋酸钠(50mM，pH3.5-5.8)，以不同pH的缓冲液配制底物溶液，底物为α-乙酰乳酸，配制底物浓度为10g/L，以实施例3按实施例1描述方式制备QH-20001粗酶液同时测定α-乙酰乳酸脱羧酶酶活，所得结果如图3所示。

通过测定不同pH条件下，酶活的变化情况可知，菌株所产α-乙酰乳酸脱羧酶能耐受较低pH环境，在pH 5.0-6.5条件下酶活变化不明显，且随着pH降低到3.5，α-乙酰乳酸脱羧酶酶活降低，但能保持30％以上的活性(图3)，进一步证实了此死谷芽孢杆菌所产酶对低pH环境的耐受性，进一步证实将其应用于食醋酿造的可行性。

实施例5

发酵液及种子液的制备

1、斜面培养：

将死谷芽孢杆菌QH-20001接种至斜面培养基，在35℃培养48h，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度为：葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，Na₂HPO₄ 0.5g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄0.1g/L，琼脂为20.0g/L，溶剂为去离子水，pH值为6.0。

2、种子培养

分为一级种子培养和二级种子培养。

一级种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，在35℃培养24h，获得一级种子液；所述一级种子培养基终浓度组成为：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，Na₂HPO₄ 0.5g/L，琼脂为20.0g/L，溶剂为去离子水，pH值为6.0；对照组为相同操作单不接种QH-20001的培养基。

二级种子培养：将一级种子液以体积浓度1～10％的接种量接种至二级种子培养基中，在35℃培养24-48h，获得二级种子液，优选接种量为5％；所述二级种子培养基终浓度组成为：优选二级种子培养基终浓度为：生玉米淀粉20g/L，酵母粉5g/L，Na₂HPO₄ 0.5g/L，琼脂为20.0g/L，溶剂为去离子水，pH值为6.0。对照组为相同组分且为接种QH-20001的培养基。

3、发酵培养

选用液态发酵罐，加水搅拌，同时加入米粉和高温α-淀粉酶，高温α-淀粉酶用量为米粉质量的0.05％，并搅拌加热到90-95℃，匀速搅拌约30min左右得到醪液，将醪液降温至45-55℃，缓慢搅拌条件下加入糖化酶并保温约20min左右，糖化酶用量为米粉质量的0.1％，加入酵母粉0.5g/L，灭菌后冷却至33-37℃，按照5％的接种量接入上述二级种子液，通气搅拌，33～40℃保压发酵20-52h。发酵完成后，所得发酵液即为酶液，所得菌液也作为接入醋醅发酵的种子液。对照组为相同处理但未接种QH-20001的糖醪液。

实施例6

死谷芽孢杆菌QH-20001产乙偶姻功能验证

斜面培养如实施例3所示，得到斜面种子。挑取斜面菌落接种到发酵培养基，37℃培养36h。所述发酵培养基组成为：葡萄糖10.0g/L，蛋白胨5.0g/L，KH₂PO₄ 5.0g/L，溶剂为去离子水，pH为7.0，121℃灭菌20min。

取发酵所得菌液，混和均匀，取1mL至1.5mL EP管中，8000r/min离心10min，取0.7mL上清液，加入0.1mL显色剂，所述显色剂与实施例1中显色剂相同，震荡1～2min混匀，于37℃下反应60min，将反应之后的混合液在520nm处测定吸光度，以接菌但未加显色剂组做空白。乙偶姻标准曲线制备：精确配制乙偶姻浓度梯度溶液，浓度梯度为：10-100mg/L，测定吸光度，以吸光度值为纵坐标，乙偶姻浓度值为横坐标，绘制标准曲线为：y＝0.0092x-0.0303，(R²＝0.9991)，通过测定此死谷芽孢杆菌QH-20001在所述发酵培养基中培养36h后测得发酵液中乙偶姻含量为642.58mg/L。

实施例6

死谷芽孢杆菌QH-20001在窖醋酿造中的应用

1、醋窖泥制备

现有窖泥池底部及侧面窖泥取出，取窖泥位置应遍布整个窖泥池，共取出约100kg左右，加入二醋10kg，窖泥池发酵的鲜醋醅20kg，麸皮浸出液25kg，混合均匀后，接入2kg死谷芽孢杆菌QH-20001发酵液，于30-35℃堆积培养5d，获得醋窖泥。成熟醋窖泥平铺涂敷在醋窖泥池的底部及侧面，涂敷厚度为10cm。对照组1中使用醋窖泥为窖泥池本身存在的醋窖泥。

2、酒醪液制备

称取大米250kg，高粱50kg，磨浆制粉，边搅拌边加水900kg，加入α-淀粉酶1kg，加热到90-95℃，匀速搅拌约30min左右得到醪液，将醪液降温至45-55℃，缓慢搅拌条件下加乳酸调醪液pH 4.7后加入2kg糖化酶并保温约20min左右，冷却至33-37℃，接入活性干酵母5kg，静置常温培养12-16h，即得酵母活化醪液。

3、菌株扩大培养

按实施例3中发酵液及种子液制备方式制得发酵菌液。

4、醋醅接种发酵

对照组：发酵池内部从下而上铺谷壳540kg，加入麸皮4600kg，大曲200kg，麸曲250kg，接入1中制备的酒醪液8300kg(其中酒醪液温度约为33℃)，同时接入实施例2中制备的对照糖醪液，用量为醪液总量的5％，待酒醪液浸入新醅后，在新醅表面接种100kg发酵至第9-11天的鲜醋醅，均匀铺散于新醅表面，进行人工翻醅。发酵周期前3天每天翻醅，之后隔天翻醅。翻醅完成后进行自然发酵。

实验组：发酵池内部从下而上铺谷壳540kg，加入麸皮4600kg，大曲200kg，麸曲250kg，将实施例3中制备的发酵液接入1中制备的酒醪液中，混合均匀，成为含芽孢杆菌的酒醪液，将含芽孢杆菌的糖醪液接入发酵池(其中混合酒醪液温度约为33℃)，接种量为醪液总量的5％。待酒醪液浸入新醅后，在新醅表面接种100kg发酵至第9-11天的鲜醋醅，均匀铺散于新醅表面，进行人工翻醅。发酵周期前3天每天翻醅，之后隔天翻醅。翻醅完成后进行自然发酵。发酵过程取醋醅及卤汁测定相关理化指标。

5、醋窖泥池二次发酵

步骤4所得发酵醋醅转入醋窖泥池，压实，进一步用成熟醋窖泥密封，继续保持密封发酵25天，获得成熟窖醋醋醅。其中，实验组1醋醅转入新制备含死谷芽孢杆菌的窖泥池，用相应制备的醋窖泥密封，而对照组1醋醅转入原本窖泥池，并使用原本醋窖泥密封。

6、淋醋

淋醋采用套淋方式得醋。将发酵池醋醅及卤汁全部铲入淋醋池，用上一轮的一醋进行浇淋，浸泡2h后取醋，所得为头醋，放入存储罐。再用上一轮二醋进行浇淋，浸泡2h后得一醋，放入中转罐，用于下一轮浇淋头醋。接着用自来水浸泡醋醅2h，所得为二醋，放入中转罐，用于下一轮浇淋一醋。

7、陶罐储存窖藏

所得头醋经高温瞬时灭菌后，于储存罐进行沉降，沉降后抽取上层醋液进入陶坛陈酿，所述陶罐容量为1KL，底部2/3的高度埋入泥土中，坛口用滤布密封，再进行泥土封坛，并盖上陶盖。

实施例7

本发明发酵所淋得新醋与对照结果比较(折合6.5g/100mL总酸，其中新醋为沉降罐陈酿后所取得的醋，窖醋为在陶罐储存6个月后所取得的醋)：

表5实验组醋与对照组醋在新醋阶段与陈酿后的指标比较

结果可知，本发明将死谷芽孢杆菌QH-20001应用到窖醋发酵，可使淋得新醋中不挥发酸、氨氮、乙偶姻、2，3，5-三甲基吡嗪、川穹嗪等含量均显著提高，双乙酰的生产减少，且具有食醋固有风味品质。在进行进一步的陶坛陈酿6个月后，食醋中的不挥发酸、氨氮、乙偶姻及川穹嗪含量皆进一步提高，远远高于对照水平。可见将死谷芽孢杆菌QH-20001应用到窖醋酿造中，对提升窖醋的口感风味及保健功能等方面菌具有正向指导意义。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种死谷芽孢杆菌，其特征在于，菌株的名称为死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis) QH-20001，其保藏编号为：CGMCC No. 22251，保藏日期2021年 4月 27日，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

2.一种如权利要求1所述死谷芽孢杆菌发酵液，其特征在于，将死谷芽孢杆菌QH-20001经发酵培养获得发酵液。

3.根据权利要求2所述的死谷芽孢杆菌发酵液，其特征在于，发酵液的制备方法如下：1）斜面培养：将死谷芽孢杆菌QH-20001接种至斜面培养基，在35 ℃培养24 h，培养获得斜面菌体；2）一级种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至一级种子培养基，培养，获得一级种子液；3）二级种子培养：将一级种子液以体积浓度1~10%的接种量接种至二级种子培养基中培养，获得二级种子液；4）发酵培养：米粉和高温α-淀粉酶加水搅拌加热得到醪液，然后加入糖化酶、蛋白胨5-15 g/L和酵母粉2-10 g/L，灭菌后冷却后，按照2~10%的接种量接入步骤3）的二级种子液，发酵，即得发酵液。

4.一种如权利要求1所述的死谷芽孢杆菌QH-20001在窖醋酿造中的应用。

5.根据权利要求4所述的死谷芽孢杆菌QH-20001在窖醋酿造中的应用，其特征在于，死谷芽孢杆菌QH-20001经发酵培养获得的发酵液按0.1-2%的接种量加入醋醅中进行发酵。

6.根据权利要求5所述的死谷芽孢杆菌QH-20001在窖醋酿造中的应用，其特征在于，死谷芽孢杆菌QH-20001发酵液接种量为0.5%。

7.根据权利要求5所述的死谷芽孢杆菌QH-20001在窖醋酿造中的应用，其特征在于，发酵结束后，还需将醋醅移入接种了死谷芽孢杆菌 QH-20001发酵液的窖泥池进行二次发酵，窖泥池中死谷芽孢杆菌 QH-20001发酵液的接种量为0.5-2%。

8.根据权利要求7所述的死谷芽孢杆菌QH-20001在窖醋酿造中的应用，其特征在于，窖泥池中死谷芽孢杆菌 QH-20001发酵液的接种量为1.5%。

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