CN102757909A - 一株产芽孢漆酶的死亡谷芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于本发明属于生物技术领域，涉及一种产芽孢漆酶的死亡谷芽孢杆菌（Bacillus vallismortis）菌株fmb-103。产芽孢漆酶的死亡谷芽孢杆菌（Bacillus vallismortis）fmb-103，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年06月08日，保藏号为CGMCC No.6198。所述的保藏号为CGMCC No.6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103能够产芽孢漆酶可在降解三苯甲烷类染料中的应用。

Description

一株产芽孢漆酶的死亡谷芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于本发明属于生物技术领域，涉及一种产芽孢漆酶的死亡谷芽孢杆菌（Bacillusvallismortis）菌株fmb-103。

背景技术

染料工业是国民经济中的重要行业，其生产的染料被广泛应用于纺织、造纸、食品、皮革、化妆品、涂料、油漆、油墨、电子工业等各个领域。染料品种数以万计，在生产和使用过程中大约有10%~20%的染料会直接随废水进入环境中。大多数染料为有毒难降解有机物，化学稳定性强，含有重金属，有刺激性、致敏性、急性毒性，具有致癌、致畸、致突变作用，直接危害人类健康；此外，废水中的染料能吸收光线，降低水体的透明度，对水生生物、微生物的生长不利，并且降低了水体的自净能力，同时导致视觉污染，还会严重破坏水体、土壤及生态环境，影响食品质量与安全，间接危害人体健康。

三苯甲烷类染料是一种多苯环化合物，使用面较广，用量也较大，其产量被列为第三大主要染料。其中某些染料及中间降解产物具有“三致”作用，从生产、运输、使用等环节进入环境，这势必造成污染，为生态环境带来冲击。并且这类染料中的一部分难以降解，常常导致常规的生物处理系统处理效果不够理想，因此，对三苯甲烷类染料生物降解性能进行系统的研究，成为处理这类染料废水重要的一方面。

行之有效的染料废水处理方法和技术是改善生态环境、保证食品安全和维护人类健康的重要保证。目前，常用的染料废水处理方法有物理方法、化学方法和生物方法。物理化学处理法虽然对废水色度去除率较高，但COD去除率较低，且存在处理费用高、可能引起二次污染等问题。生物法即通过筛选或构建具有高效性能的特定微生物菌株用于染料废水的脱色，是一种经济、有效且适于大规模废水处理的技术。

生物方法对染料的脱色主要通过降解和生物吸附两方面发挥作用，降解是由微生物分泌胞外氧化酶-木质素降解酶系统进行脱色，包括漆酶、木素过氧化物酶和锰过氧化物酶等；而吸附主要是通过菌体的自身结构与染料等大分子物质相契合所致。因此，对用于染料的生物脱色方法通常以微生物和酶为载体进行研究。

目前研究发现的染料脱色酶主要有漆酶(Laccase)、木质素过氧化物酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP)，它们对底物的降解具有广谱性，对染料的脱色及降解效果明显，具有很好的应用前景。漆酶是一类含铜的多酚氧化酶，广泛存在于自然界中，主要包括植物漆酶和真菌漆酶，蛋白质数据库和细菌基因组序列分析的结果证明漆酶也广泛存在于细菌中。漆酶作为一种生物制剂，具有高效、专一、作用条件温和等特点，在纸浆生物漂白、染料的脱色及其废水净化、污染物质脱毒与降解等方面有着巨大的应用潜力。而且，在还原介质的存在下，可进一步的扩大漆酶的底物范围。采用漆酶直接对染料进行脱色降解，以及利用漆酶介体系统，漆酶染料中间体和固定化漆酶对染料降解的研究已引起了国内的脱色降解效果。然而，大量关于漆酶的研究工作取材于真菌，分泌漆酶的真菌主要集中于担子菌门(Basidiomycota)、子囊菌门(Ascomycota)及半知菌类(Imperfect fungi)等真菌，其中最主要的是担子菌门中的白腐真菌。但是真菌较细菌生长缓慢、发酵周期长、生长温度和pH范围狭窄等特性，必然导致真菌在产酶数量、酶学性质等多方面体现出劣势。细菌漆酶比真菌漆酶有更多的优点，如存在Cu2+抗性、不需糖基化、热稳定性好及酶活性的最适pH值范围广等。同时，细菌生长的代时短，所需营养成分简单易得，便于大规模培养；大多数细菌生长在碱性环境中，筛选出最适pH在碱性范围内的细菌漆酶，可以直接用于处理工业废水；细菌漆酶对热、卤素和碱的稳定性好，因此，细菌漆酶的研究对漆酶应用的环境条件和领域的扩展具有十分重要的意义。而目前关于细菌漆酶的研究很少，更多具有高效脱色能力细菌漆酶还有待于进一步发掘和研究。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一株产芽孢漆酶的死亡谷芽孢杆菌。

本发明的另一目的是提供该死亡谷芽孢杆菌应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一株产芽孢漆酶的死亡谷芽孢杆菌（Bacillus vallismortis）fmb-103，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年06月08日，保藏号为CGMCCNo.6198。

所述的保藏号为CGMCC No.6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103在降解三苯甲烷类染料中的应用。

优选利用保藏号为CGMCC No.6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103产生的芽孢漆酶在降解三苯甲烷类染料中的应用。

其中，所述的三苯甲烷类染料优选孔雀石绿、亮绿、苯胺蓝中的任意一种或多种。

所述的芽孢漆酶优选主要通过如下步骤制备：

a.将保藏号为CGMCC No.6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103接种于100mL BPY种子液培养基，37℃，180rpm，培养12~16小时得种子液；

b.按3%的接种量将种子液转接到发酵培养基中，37℃，180rpm，发酵48小时，所述的发酵培养基配方为玉米粉4.65g/L，黄豆粉5.88g/L，MgSO₄2.53g/L，MnSO₄0.1g/L，K₂HPO₄0.3g/L，FeSO₄0.5g/L，pH 7.0；

c.取出发酵液，滤纸抽滤，弃去菌体；

d.抽滤液10000~12000rpm离心25~30min，弃去上清，沉淀物用去离子水重悬，10000~12000rpm离心10~15min，重复两次，所得沉淀物即为所述的芽孢漆酶。

一种利用保藏号为CGMCC No.6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103降解三苯甲烷类染料的方法，在0.2mol/LpH6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液中，加入终浓度为0.1mol/L的介体2,2’-连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)、丁香醛或乙酰丁香酮，5.38U/mL fmb-L820和50mg/L的三苯甲烷类染料，于37℃下静置反应48h；其中所述的fmb-L820为保藏号为CGMCC No.6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103产生的芽孢漆酶。

所述的保藏号为CGMCC No.6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103产生的芽孢漆酶主要通过如下步骤制备：

a.将保藏号为CGMCC No.6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103接种于100mL BPY种子液培养基，37℃，180rpm，培养12~16小时得种子液；

b.按3%的接种量将种子液转接到发酵培养基中，37℃，180rpm，发酵48小时，所述的发酵培养基配方为；

c.取出发酵液，滤纸抽滤，弃去菌体；

d.抽滤液10000~12000rpm离心25~30min，弃去上清，沉淀物用去离子水重悬，10000~12000rpm离心10~15min，重复两次，所得沉淀物即为所述的芽孢漆酶。

所述的三苯甲烷类染料优选自孔雀石绿、亮绿、苯胺蓝中的任意一种或多种。

有益效果：

本发明提供了一种产细菌芽孢漆酶的死亡谷芽孢杆菌（Bacillus vallismortis）菌株fmb-103（CGMCC No.6198），此类菌株是首次被发现具有产生芽孢漆酶的能力。利用该菌株产生的芽孢漆酶，在介体的作用下，能够高效的催化三苯甲烷类染料（孔雀石绿、亮绿和苯胺蓝）的降解。利用fmb-103，通过简单的发酵和分离手段获得大量芽孢漆酶，应用于染料降解，对于缓解染料工业带来的环境问题具有重要的现实意义。

附图说明

图1菌株fmb-103的菌落生长形态

图2菌株fmb-103革兰氏染色

图3基于16S rRNA基因序列的fmb-103菌株的系统发育树

图4芽孢漆酶对染料的脱色效应

其中，CK.染料；A.漆酶+染料；B.ABTS+染料；C.丁香醛+染料；D.乙酰丁香酮+染料；E.漆酶+ABTS+染料；F.漆酶+丁香醛+染料；G.漆酶+乙酰丁香酮+染料。

图5芽孢漆酶对染料的脱色效率

其中，a.漆酶；b.漆酶+ABTS；c.漆酶+丁香醛；d.漆酶+乙酰丁香酮

图6pH对芽孢漆酶染料脱色影响

（A）pH对芽孢漆酶对孔雀石绿脱色影响；（B）pH对芽孢漆酶对亮绿脱色影响；（C）pH对芽孢漆酶对苯胺蓝脱色影响；

其中，a.漆酶；b.漆酶+ABTS；c.漆酶+丁香醛；d.漆酶+乙酰丁香酮

图7孔雀石绿降解的全波长扫描

生物材料保藏信息：

本发明提供的该菌株为死亡谷芽孢杆菌（Bacillus vallismortis）fmb-103，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，缩写CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.6198，保藏日期为2012年06月08日。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1产芽孢漆酶死亡谷芽孢杆菌（Bacillus vallismortis）fmb-103的获得

将来源于印染工厂污染的土壤样品10g在无菌条件下，加入到250mL带有玻璃珠并已灭菌的富集培养基内（富集培养基组分：1％（W/V）胰蛋白胨；0.5％（W/V）酵母粉；1％（W/V）NaCl；终浓度0.2mmol/L CuSO₄）。37℃，200rpm震荡24-48h，进行富集培养基。培养结束后，10000rpm、4℃条件下离心10min，获得上清液进行梯度稀释，得到10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9的稀释倍数。每一梯度100μL菌液滴加于营养琼脂平板（营养琼脂平板组分：10.0g/L蛋白胨；3.0g/L牛肉粉；5.0g/L氯化钠；15.0g/L琼脂；1000ml蒸馏水；pH值7.3±0.1）后涂布，37℃培养2-4天。取含有单菌落平板，在菌落及其周围滴加1mm/L的ABTS，若在滴定区域显现绿色表示有漆酶存在。挑取使ABTS溶液发生颜色变化的单菌落，进行多次重复验证，获得具有漆酶活性的菌株，命名为fmb-103，送交CGMCC保藏，保藏号为CGMCCNo.6198。

实施例2产芽孢漆酶死亡谷芽孢杆菌（Bacillus vallismortis）fmb-103菌株的鉴定

(1)菌株形态学鉴定

死亡谷芽孢杆菌fmb-103（CGMCC No.6198）菌株接种于营养琼脂培养基上，30℃培养24h，特征观察结果如表1，菌落形态见图1，革兰氏染色结果见图2。

表1菌株fmb-103的培养特征观察结果

(2)菌株的生物学特性研究

1）耐酸碱度的测定

将死亡谷芽孢杆菌fmb-103（CGMCC No.6198）菌株接种于pH值为3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10的营养琼脂液体培养基中（10.0g/L蛋白胨；3.0g/L牛肉粉；5.0g/L氯化钠；1000ml蒸馏水；pH值7.3±0.1），30℃培养，每隔12h与未接种的对照管对比，目测菌株的生长情况。观察3天，结果如下：

pH值低于4.5的试管中，随pH值降低菌体沉淀增多，培养基中生长菌体数减少；pH值高于5的试管中，随pH值升高漂浮的菌膜增多，培养基中生长菌体数减少。pH=9.5、10时，培养基澄清，无菌体生长迹象。pH=4.5时菌体混浊度高于pH=5，且这两试管中均略有沉淀和漂浮的菌膜。由此可以得出结论：菌种fmb-103最适生长的pH值范围为4.5~5；pH>9时，无法生长。

2）需氧性及运动性的测定

取活化24h的死亡谷芽孢杆菌fmb-103（CGMCC No.6198）菌株穿刺接种于营养琼脂半固体培养基中（10.0g/L蛋白胨；3.0g/L牛肉粉；5.0g/L氯化钠；15.0g/L琼脂；1000ml蒸馏水；pH值7.3±0.1），30℃培养3天后观察生长状况如下：

穿刺的上部菌体密度最大，往下菌体数减少；穿刺的底部菌体数多于中部。由此可以得出结论：死亡谷芽孢杆菌fmb-103（CGMCC No.6198）沿穿刺线生长，上部最为密集，鉴定为兼性厌氧菌；底部较多，说明具有运动性。

3)耐盐性试验

将死亡谷芽孢杆菌fmb-103（CGMCC No.6198）菌株接种于加入NaCl至终浓度为0%、2%、5%、7%、10%的营养琼脂液体培养基中，30℃培养，在第3天和第7天各观察一次，与未接种的对照管对比，目测生长情况如下：

第3天，2%和0%中菌体混浊度相似，较为混浊；5%浓度下菌体数减少，培养基混浊度降低；5%、7%、10%随着NaCl浓度升高，菌体数减少，培养基混浊度降低，10%时菌体数最少。

第7天，0%NaCl浓度培养基最为混浊，有大量菌体漂浮，即为菌膜；2%0%NaCl浓度培养基较为混浊，有大量菌体漂浮，部分悬浮；5%混浊度降低，无菌体漂浮，有少量悬浮；7%、10%混浊度最低，略微混浊，无漂浮，菌体颗粒状均匀分布于试管中。

结论：死亡谷芽孢杆菌fmb-103（CGMCC No.6198）在超过5%NaCl浓度时，生长受到一定抑制。

(3)菌株的生理生化鉴定

根据生理生化试验结果、结合形态学观察，并参考《伯杰细菌鉴定手册》，死亡谷芽孢杆菌fmb-103（CGMCC No.6198）菌株fmb-103的生理生化特征结果见表2。

表2菌株fmb-103生理生化特征

“+”：阳性；“-”：阴性

（4）基于16S rDNA基因的分子生物学鉴定

1）细菌总DNA的制备

吸取10ml 28℃160r·min^-1培养至对数期的死亡谷芽孢杆菌fmb-103（CGMCC No.6198）培养液，5000r·min^-1离心10min，沉淀用TE洗涤后，再次离心，菌体重悬于4ml TE溶液，加入50mg·ml^-1溶菌酶溶液8μl，37℃保温20min，加入RNase（10mg·mL^-1）10μl，至终浓度为25μg·ml^-1，然后加入10％SDS溶液0.5ml，37℃保温30min，加入蛋白酶K（20mg·ml^-1）10μL，至终浓度为50μg·ml^-1，37℃保温60～90min，加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），混匀，8000r·min^-1离心5min，取上清液转入另一离心管中，如此2~3次，将上清液中加入0.1倍体积的醋酸钠和2倍体积的冷冻的无水乙醇，旋转离心管，出现沉淀物DNA，70％乙醇洗涤一次，室温下干燥，加入0.5ml TE或双蒸水溶解DNA作为PCR模板待用。

2）16S rRNA基因的PCR扩增和序列测定

采用原核生物16S rRNA扩增的通用引物

用于16S rRNA基因的PCR反应的引物为一对通用引物（由北京三博远志生物技术有限公司合成）

正向引物fD15’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’（SEQ ID NO.1）

反向引物rP15’–GGTTACCTTGTTACGACTT–3’（SEQ ID NO.2）

PCR反应体系

PCR反应程序

PCR产物（菌株fmb-103的16S rDNA序列）全长1511bp，经1%琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统下观察并拍照记录结果。PCR产物通过电泳，利用TaKaRa公司Gel Extraction Kit试剂盒割胶回收纯化。送至上海生工测序。测序结果见SEQ ID NO.3。

3）绘制系统发育树

将死亡谷芽孢杆菌fmb-103（CGMCC No.6198）的16S rDNA序列和GenBank中芽孢杆菌属的其它种的16S rDNA序列用clustalx1进行比对分析，采用MEGA软件用邻近法(neighbour-joining)构建系统发育树(见附图3)，用自展法(bootstrap)检验系统发育树的可靠性，自展500次。从系统发育树上可看出死亡谷芽孢杆菌fmb-103（CGMCC No.6198）与解淀粉芽孢杆菌、死亡谷芽孢杆菌进化关系较近。

结合形态学特征及生理生化结果，鉴定死亡谷芽孢杆菌fmb-103（CGMCC No.6198）为死亡谷杆菌（Bacillus vallismortis）。

实施例3：利用死亡谷芽孢杆菌（Bacillus vallismortis）fmb-103发酵获得芽孢漆酶

（1）挑取营养琼脂平板（（10.0g/L蛋白胨；3.0g/L牛肉粉；5.0g/L氯化钠；30.0g/L琼脂；1000ml蒸馏水；pH值7.3±0.1））上生长的死亡谷芽孢杆菌fmb-103（CGMCC No.？）单菌落，于100mL BPY种子液培养基中（牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖10g/L，NaCl 5g/L），37℃，180rpm，培养12~16小时。

（2）按3%的接种量将培养好的种子液转接到发酵培养基中（玉米粉4.65g/L，黄豆粉5.88g/L，MgSO₄2.53g/L，MnSO₄0.1g/L，K₂HPO₄0.3g/L，FeSO₄0.5g/L，pH 7.0），37℃，180rpm，发酵48小时。

（3）收集发酵液，抽滤方法除去发酵液中的不溶物；

（4）抽滤液，9000rpm离心30min；

（5）离心结束后，弃去上清，沉淀物用去离子水重悬，9000rpm离心15min，重复两次，得到沉淀物，即为芽孢漆酶；

（6）芽孢漆酶活性测定采用2,2’-连氮-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）法稍作改动：反应体系总体积3mL，包括2.45mL 0.2mol/L pH 5.0柠檬酸-磷酸盐缓冲液、0.5mL 6mmol/LABTS及50μl用pH 5.0柠檬酸-磷酸盐缓冲液适当稀释的酶粗提液，45℃测定反应的前3min内反应液在420nm处吸光值OD的增加量，以灭活酶液做空白对照。将每分钟内生成1μmol反应物所需的酶量定义为一个酶活力单位。漆酶酶活计算公式：漆酶活力（U）=V_总×ΔOD/(V_酶×ε×Δt×10^-6)×总酶酶液稀释倍数；其中，ε=3.6×10⁴mol/cm；Δt：3min；ΔOD：3min内吸光度OD的变化值；V_总：酶反应中，反应液的总体积；V_酶：酶反应中，酶液的体积。实验重复3次，取平均值，上述制备的芽孢漆酶酶活为6.5U/g（芽孢干重）。

实施例4：利用fmb-103所产芽孢漆酶降解苯胺蓝、孔雀石绿、亮绿

（1）芽孢漆酶fmb-103催化三苯甲烷类染料脱色及介体的影响

菌株及漆酶对染料的脱色能力采用比色法测定。测染料降解前后在最大吸收波长处的吸光值，苯胺蓝、亮绿、孔雀石绿和靛蓝的最大吸收波长分别为585nm、627nm、617nm和610nm。降解前后的吸光值分别为A₁、A₂，其脱色率用下述公式计算：

脱色率（%）=（A₁-A₂）/A₁×100%

利用芽孢漆酶催化染料脱色降解的反应体系：总体积4mL，包括0.1mol/L的介体ABTS、丁香醛或乙酰丁香酮，0.2mol/LpH6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液，5.38U/mL fmb-L820和50mg/L的染料（雀石绿、亮绿或苯胺蓝），以不加芽孢漆酶为对照，于37℃下静置反应48h，结果如附图4。

从脱色效果来看，重组芽孢漆酶对孔雀石绿、亮绿和苯胺蓝的脱色均有催化作用，特别是对苯胺蓝作用效果较好；添加介体后，这种催化作用更为明显，ABTS对漆酶催化四种染料脱色都有很好的效果，丁香醛和乙酰丁香酮对四种染料脱色都有促进作用，特别是对靛蓝，可以使其颜色完全脱去。三种介体对脱色反应影响的具体结果如附图5所示。

在只有漆酶的反应体系中，三种染料的脱色效果均较差，脱色率都不足15%，加入ABTS、丁香醛和乙酰丁香酮三种介体后，脱色效果都有明显的提高，但以丁香醛效果最差，脱色率在25%~40%之间。在孔雀石绿的脱色中，ABTS对其促进作用最好，脱色率达到77.84%。对于亮绿，ABTS和乙酰丁香酮对脱色反应的促进作用都很强，脱色率均在95%左右。在苯胺蓝的脱色中，乙酰丁香酮的作用效果最佳，脱色率为81.17%。

（2）pH对芽孢漆酶fmb-103催化染料脱色的影响

pH4.0、5.0、6.0的4mL脱色反应体系置于37℃下静置反应48h，研究pH对三种染料脱色反应的影响，结果如附图6。

pH值对孔雀石绿的脱色效果影响较大，当pH为4.0时，只有当介体为ABTS时，才有脱色效果，且脱色率达到66.27%，随着pH升高，各个反应体系中的脱色效果均升高，且以pH为6.0，介体为ABTS的脱色效果最好，脱色率为76.84%。pH对亮绿的影响类似于孔雀石绿，但是pH的升高对脱色效果的改善更为明显。pH值从5.0上升6.0时，在丁香醛为介体的体系中，脱色率由5.12%升到了39.84%；在以乙酰丁香酮为介体的体系中，pH4.0时，无脱色效果，pH5.0、6.0时，脱色率达到了66.21%、96.56%。

在只有漆酶和以ABTS为介体的反应体系中，苯胺蓝在pH5.0时的脱色率最高，而在另外两种介体中，随着pH的升高，脱色率逐渐升高。当pH为6.0，介体为乙酰丁香酮时，苯胺蓝的脱色率最高，达到81.17%。

综上，在pH4.0~6.0范围内，随着pH的升高，三种染料的脱色效果也提高，在pH6.0达到最佳。这是由pH对酶反应活性的影响，介体对酶的不同作用，以及pH对染料解离情况的影响综合作用的结果。

（3）孔雀石绿脱色后的全波长扫描结果

用紫外-可见光分光光度计对降解前后的反应混合液进行200-800nm的全波段扫描，观察特征峰的变化，判断染料降解情况。如附图7可见-紫外光谱扫描后发现，孔雀石绿在617nm处有最大吸收峰，在经过重组芽孢漆酶fmb-L820处理48h后，最大吸收峰消失，说明孔雀石绿也被降解了。

Claims (8)

1.一株产芽孢漆酶的死亡谷芽孢杆菌（Bacillus vallismortis）fmb-103，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年06月08日，保藏号为CGMCC No.6198。

2.权利要求1所述的保藏号为CGMCC No.6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103在降解三苯甲烷类染料中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于利用保藏号为CGMCC No.6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103产生的芽孢漆酶在降解三苯甲烷类染料中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的三苯甲烷类染料选自孔雀石绿、亮绿、苯胺蓝中的任意一种或多种。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的芽孢漆酶主要通过如下步骤制备：

a.将保藏号为CGMCC No.6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103接种于100mL BPY种子液培养基，37℃，180rpm，培养12～16小时得种子液；

b.按3％的接种量将种子液转接到发酵培养基中，37℃，180rpm，发酵48小时，所述的发酵培养基配方为玉米粉4.65g/L，黄豆粉5.88g/L，MgSO₄ 2.53g/L，MnSO₄ 0.1g/L，K₂HPO₄ 0.3g/L，FeSO₄ 0.5g/L，pH 7.0；

c.取出发酵液，滤纸抽滤，弃去菌体；

d.抽滤液10000～12000rpm离心25～30min，弃去上清，沉淀物用去离子水重悬，10000～12000rpm离心10～15min，重复两次，所得沉淀物即为所述的芽孢漆酶。

6.一种利用权利要求1所述的保藏号为CGMCC No.6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103降解三苯甲烷类染料的方法，其特征在于在0.2mol/LpH6的醋酸-醋酸钠缓冲液中，加入终浓度为0.1mol/L的介体，5.38U/mL fmb-L820和50mg/L的三苯甲烷类染料，于37℃下静置反应48h，所述的介体选自2，2’-连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)、丁香醛或乙酰丁香酮中的任意一种；其中所述的fmb-L820为保藏号为CGMCC No.6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103产生的芽孢漆酶。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的保藏号为CGMCC No.6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103产生的芽孢漆酶主要通过如下步骤制备：

a.将保藏号为CGMCC No.6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103接种于100mL BPY种子液培养基，37℃，180rpm，培养12～16小时得种子液；

b.按3％的接种量将种子液转接到发酵培养基中，37℃，180rpm，发酵48小时，所述的发酵培养基配方为玉米粉4.65g/L，黄豆粉5.88g/L，MgSO₄ 2.53g/L，MnSO₄ 0.1g/L，K₂HPO₄ 0.3g/L，FeSO₄ 0.5g/L，pH 7.0；

c.取出发酵液，滤纸抽滤，弃去菌体；

d.抽滤液10000～12000rpm离心25～30min，弃去上清，沉淀物用去离子水重悬，10000～12000rpm离心10～15min，重复两次，所得沉淀物即为所述的芽孢漆酶。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的三苯甲烷类染料选自孔雀石绿、亮绿、苯胺蓝中的任意一种或多种。

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