CN101544958B - 一种高产甲壳素脱乙酰酶的解淀粉芽孢杆菌csuft F14及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高产甲壳素脱乙酰酶的解淀粉芽孢杆菌csuft F14及其应用，该菌株保藏单位为CCTCC，保藏号为CCTCC M 209062。本发明的优点是用该菌株生产甲壳素脱乙酰酶，培养方法简单，产酶活性高，有利于甲壳素脱乙酰酶的开发和利用，具有广阔的应用前景。

Description

一种高产甲壳素脱乙酰酶的解淀粉芽孢杆菌csuft F14及其应用 

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种高产甲壳素脱乙酰酶的细菌及其应用。 

背景技术

甲壳素，又名甲壳质、壳多糖等，化学名为聚[(1，4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖]，是一种天然高分子多糖，但其溶解性能很差，因而其应用受到一定限制。壳聚糖(chitosan)是甲壳素分子中的乙酰基被部分或全部脱除后的产物，其溶解性能得到很大改善。壳聚糖在国内外的应用十分广泛。目前已在食品、医药、化工、生物、纺织、环保、功能材料等领域得到了广泛应用。如在医药工业中可以制作人造皮肤、药物载体等。在轻纺工业中用作增染剂、固色剂等。在日用化学工业中可制作洗发香波等。在食品工业中可作为酒类和饮料的澄清剂、食品添加剂；也可研制成为减肥功能食品等。在环境保护方面可用作污水处理的絮凝剂等。此外，在制作功能材料方面，可制作超滤膜、反渗透膜等；也可作为纤维材料、催化剂、酶和细胞的固定化载体等。甲壳素和壳聚糖由于其天然无毒和在许多领域的广泛用途，已引起许多国家的重视，现已成为最热门的研究领域之一。目前国内外生产壳聚糖主要采用浓碱法，但其制备工艺存在诸多问题，如：未除尽蛋白质及钙盐、脱己酰度低、粘度低、操作步骤多、生产周期长、原料和能量消耗大、生产成本高等。目前，还有利用微波法制备壳聚糖，但是技术尚未成熟应用较少。 

甲壳素脱乙酰酶(chitin deacetylase，E.C.3.5.1.41，以下简称CDA)是催化甲壳素转变为壳聚糖的重要生产酶。其通过催化N-乙酰氨基-D-葡萄糖胺脱去乙酰基将甲壳素转变为壳聚糖。1974年，Araki从真菌Mucorroxii培养液中获得并部分纯化。1982年，Kauss在植物病原体Colletotrichum lindemuthianum中也发现甲壳素脱乙酰酶，这是首次报道从非接合菌类中分离得到该酶。甲壳素脱乙酰酶(chitindeacetylase，E.C.3.5.1.41)可替代现有的浓碱法生产高质量的壳聚糖，这不仅可以解决环境污染问题，而且可以生产出用化学法较难得到的高质量的壳聚糖产品。因此，该酶具有重要的学术及应用价值。 

从甲壳素富集的土壤中分离筛选得到高产甲壳素脱乙酰酶菌株，对壳聚糖的生产具有重要的意义。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的能产甲壳素脱乙酰酶的微生物及其应用。 

本发明要解决的另一个技术问题是筛选产甲壳素脱乙酰酶的方法，以及研究菌株csuftF14的生理生化特征。 

一种高产甲壳素脱乙酰酶的解淀粉芽孢杆菌csuft F14，保藏号为CCTCC M 209062。 

所述的高产甲壳素脱乙酰酶的解淀粉芽孢杆菌csuft F14为革兰氏阳性菌、具运动性、兼性厌氧、菌体短杆状、形成内生芽孢，芽孢卵圆形，孢囊膨大，游离芽孢表面着色弱，Gram染色阳性；在LB培养基上呈白色不透明菌落，表面粗糙，菌落边缘不规则，在LB培养基上不产色素，生长温度为28～30℃。 

所述的解淀粉芽孢杆菌csuft F14还具有以下生理生化特征：还原硝酸盐；水解淀粉；发酵D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、甘露醇和D-木糖；接触酶阳性；氧化酶阴性；硫化氢阳性；酯酶阳性；乙酸氧化阴性。 

所述的解淀粉芽孢杆菌csuft F14可用于制备生产壳聚糖的制剂。 

本发明的产甲壳素脱乙酰酶菌株csuft F14不同于已有的普通解淀粉芽孢杆菌，具有产甲壳素脱乙酰酶能力，且酶活高于一般的产甲壳素脱乙酰酶菌株，如构巢曲霉、毛霉、黑曲霉等。与国内的产甲壳素脱乙酰酶微生物相比，该菌株培养条件简单，繁殖快，容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。 

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，csuft F14 

保藏日期：2009年03月26日 

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心 

保藏单位简称：CCTCC 

保藏号：CCTCC M 209062 

附图说明

图1为csuft F14菌株产甲壳素脱乙酰酶的显色作用图； 

图2为csuft F14菌株显微观察图； 

图3为csuft F14菌株相对酶活。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。 

实施例1：本发明菌株的筛选方法 

1)平板初筛 

采用平板涂布法。称取10g采自湘江河岸的土样，倾入90mL含玻璃珠的无菌水中，充分振荡20min后，在无菌环境下，移取1mL梯度稀释至10^-6倍浓度，取1ml，涂布于加入了PDA培养基的培养皿中；同时取1ml，涂布于加入了牛肉膏蛋白胨培养基的培养皿中。将PDA培养基于26℃培养4d，牛肉膏蛋白胨培养基于30℃培养2d，从培养基中挑取单菌落，继续纯化，重复3次菌落特征一致，无异常菌落出现者，可认为是单菌落，即完全纯化。挑取最后一次纯化的平板上的单一菌落接种到斜面培养基上培养保存，备用。 

选取分离、纯化后所得斜面菌种，在产甲壳素脱乙酰酶筛选培养基(培养基成分：甲壳素10％，NaNO₃ 0.2％，KH₂PO₄ 0.1％，K₂HPO₄ 0.1％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，PN 0.05％，琼脂2％)上进行培养。真菌培养4d，放线菌、细菌培养2d，取出观察，根据产甲壳素脱乙酰酶菌株周围的显色圈的深浅判断菌株的产酶能力。筛选出甲壳素脱乙酰酶酶活力较高的菌株9株。其中霉菌3株，放线菌2株，细菌4株。 

2)摇瓶复筛 

平板初筛挑选出来的9株菌株进行摇瓶复筛，150ml三角瓶装液发酵培养基(培养基成分：甲壳素(大于120目)1.5％，NaNO₃ 0.2％，K₂HPO₄ 0.1％，KH₂PO₄ 0.1％，MgSO₄ 0.05％)60ml，30℃，180rpm/min培养48h，用酶法测定滤液中的乙酸含量，通过测定乙酸含量的高低反映酶活力。测得这9株菌株的甲壳素脱乙酰酶相对酶活力，见图3，Z7菌株csuft F14的相对酶活力最高。 

试验和观察的结果如下： 

一、本发明菌株csuft F14的形态特征： 

该菌株为：菌体呈短杆状，染色均匀，具运动性，兼性厌氧，可形成内生芽孢，芽孢囊膨大，呈椭圆形，游离芽孢表面着色弱，Gram染色阳性。在LB培养基上呈白色不透明菌落，表面粗糙，菌落边缘不规则，在多种培养基上均不产色素。 

二、本发明菌株csuft F14的生理生化特征： 

可利用还原硝酸盐；水解淀粉；可发酵D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，甘露醇，D-木糖；接触酶阳性；氧化酶阴性；硫化氢阳性；酯酶阳性；乙酸氧化阴性。 

三、本发明菌株csuft F14的分子鉴定： 

PCR扩增和序列分析：采用菌株基因组总DNA，16S rDNA扩增采用引物F27、1541(上海生工合成)。PCR反应体系(25μL)：10倍缓冲液2.5μL，dNTP(各2.5mmol·L^-1)1μL，引物各1μL，Taq酶(5u·μL^-1)0.25μL，模板DNA稀释50倍后取2μL(对照组加双蒸水，其它 条件同)，ddH2O，18.25μL。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火31min，72℃延伸90s，30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。 

取4μLPCR产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR扩增产物委托上海生工公司测序，所测序列提交GenBank进行同源性比较，采用邻接法构建出进化树。 

菌株csuft F14的16s rDNA间隔区序列与GenBank接收号为EU855192.1的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens的16S rDNA相似性为99％。 

实施例2：本发明菌株的应用 

将甲壳素加入发酵培养基(培养基成分：甲壳素(大于120目)1.5％，豆饼粉2.0％，玉米粉2％，葡萄糖2％，NaNO₃ 0.2％，K₂HPO₄ 0.1％，KH₂PO₄ 0.1％，MgSO₄ 0.05％)中，36℃，160rpm/min，培养2天，发酵液过滤后加入10％NaOH溶液，边加边搅拌，至pH值10-11，出现白色絮状沉淀，静置后离心，将沉淀物用蒸馏水洗涤至pH值中性，离心，收集沉淀物，烘干，即为壳聚糖制品。 

Claims (2)

1.一种高产甲壳素脱乙酰酶的解淀粉芽孢杆菌csuft F14，其特征在于，所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)csuft F14，保藏号为CCTCC M 209062。

2.权利要求1所述的高产甲壳素脱乙酰酶的解淀粉芽孢杆菌csuft F14的应用，其特征在于，所述的解淀粉芽孢杆菌csuft F 14用于制备生产壳聚糖的制剂。 

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