CN103421709B

CN103421709B - 一株产芽孢漆酶的芽孢杆菌及利用该菌产芽孢漆酶的方法

Info

Publication number: CN103421709B
Application number: CN201310315314.6A
Authority: CN
Inventors: 汪春蕾; 李凡姝; 赵敏; 崔岱宗; 卢磊; 李德斌; 王天女; 陶雷
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2013-07-25
Filing date: 2013-07-25
Publication date: 2014-11-19
Anticipated expiration: 2033-07-25
Also published as: CN103421709A

Abstract

一株产芽孢漆酶的芽孢杆菌及利用该菌产芽孢漆酶的方法，涉及一株芽孢杆菌及利用该菌产芽孢漆酶的方法。本发明提供一株产芽孢漆酶的芽孢杆菌及利用该菌产芽孢漆酶的方法，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2013年6月8日，保藏号为CGMCC No.7683。方法：一、将芽孢杆菌CLb划线接种于固体产孢培养基上培养；二、用去离子水将芽孢冲洗下来，加入溶菌酶，水浴；三、清洗芽孢；四、无菌去离子水清洗芽孢；五、水浴热击后清洗；六、用去离子水悬浮芽孢，得到芽孢悬液，即为粗酶液。该菌株可产芽孢漆酶，所产的芽孢漆酶对不同化学结构的工业合成染料具有较好的脱色作用。

Description

一株产芽孢漆酶的芽孢杆菌及利用该菌产芽孢漆酶的方法

技术领域

本发明涉及一株芽孢杆菌及利用该菌产芽孢漆酶的方法。

背景技术

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，它可利用活性中心的铜离子催化氧化多种结构的芳香化合物，同时将分子氧还原成水。由于漆酶催化的底物范围十分广泛，因此漆酶已被广泛应用于造纸工业、纺织工业、食品工业以及土壤的生物修复等领域。

漆酶催化氧化底物一般包括两种作用方式，第一种是底物分子直接与漆酶铜簇反应氧化成相应的激发态分子。然而有些底物不能有漆酶直接氧化，原因在于它们分子太大而不能渗透进入酶的活性部位，或者由于其氧化还原电位较高而不能被漆酶直接氧化。漆酶氧化底物的第二种方式是通过一些小分子的介体物质为媒介，漆酶先将小分子介体氧化成激发态，然后这些激发态的介体再与大分子的或氧化还原电位较高的底物反应，该方式也被成为漆酶—介体系统（LMS）。漆酶—介体系统的应用有助于进一步扩大漆酶的底物范围，提高漆酶的工业应用范围。

在自然界中，漆酶广泛分布于植物、真菌和细菌中，特别是真菌，是目前漆酶的主要生产者。虽然目前对细菌漆酶的理论研究不如真菌漆酶深入，但细菌具有生长快、易于培养的特点，细菌漆酶较真菌漆酶在碱性环境和高温下具有更好的稳定性。由于工业造纸废水等一般温度较高，碱性较强，真菌漆酶在实际应用中受到稳定性的限制，因此细菌漆酶在工业上具有更好的应用前景。

染料被广泛应用于纺织、印染、皮革等行业，全球每年生产染料万种之余，至少有10%–15%的染料通过废水排放到自然环境中，对水体的生态环境造成严重破坏。工业使用的合成染料多是芳香族化合物，结构复杂，难降解。目前染料废水的处理反复主要有物理化学法和生物处理法，物化处理技术费用高，存在二次污染；生物法因其经济环保而成为较好的治理方法。其中漆酶由于具有广泛的底物作用范围，可催化降解多种结构的染料在工业染料废水处理上具有较好地应用前景。已有很多关于应用白腐真菌或其他真菌来源的漆酶脱色染料的研究，但关于细菌漆酶以及细菌漆酶-介体系统在染料脱色方面的研究报道较少。通过研究细菌漆酶对不同合成染料的脱色效果，可以进一步推动细菌漆酶的工业应用。

发明内容

本发明提供一株产芽孢漆酶的芽孢杆菌及利用该菌产芽孢漆酶的方法，该菌株可产芽孢漆酶，所产的芽孢漆酶对不同化学结构的工业合成染料具有较好的脱色作用。

本发明产芽孢漆酶的芽孢杆菌为芽孢杆菌（Bacillus sp.）CLb，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2013年6月8日，保藏号为CGMCC No.7683；本发明芽孢杆菌CLb革兰氏染色阳性，细胞大小为（1μm～2μm）×（5μm～7μm），具有侧鞭毛和荚膜；在固体LB培养基上37℃培养24h，菌落乳白色、扁平、呈圆形，菌落表面干燥、光滑，菌落边缘呈叶状，菌落不透明且正反颜色一致。

本发明芽孢杆菌CLb V-P试验呈阳性，甲基红试验呈阳性，硝酸盐还原试验呈阳性，丙二酸盐试验呈阳性。芽孢杆菌CLb可利用麦芽糖、木糖、蔗糖、阿拉伯糖、甘露醇、肌醇醇、山梨醇、密二糖和乳糖；芽孢杆菌CLb具有明胶液化酶、脂肪酶、氧化酶、过氧化氢酶、蛋白酶和尿素酶。

本发明芽孢杆菌CLb可在LB培养基上生长，最适生长温度为37℃，最适生长pH为7.0。

本发明芽孢杆菌（Bacillus sp.）CLb通过16S rDNA序列比对分析，与芽孢杆菌属（Bacillus）的亲缘关系最为接近，保守区相似性为95%。通过结合菌体形态特征、生长条件确定芽孢杆菌CLb为芽孢杆菌属（Bacillus）的一株新菌株，命名为芽孢杆菌CLb。

本发明芽孢杆菌CLb能够产芽孢漆酶，所产的芽孢漆酶对不同化学结构的工业合成染料具有较好的脱色作用。在介体乙酰丁香酮的参与下，在pH7.0时对RBBR（雷马素艳蓝R）、活性黑KN-B、靛红和结晶紫6h后的脱色率分别为79.13%、91.83%、94.67%和92.5%。

利用上述芽孢杆菌CLb产芽孢漆酶的方法，按以下步骤进行：

一、将芽孢杆菌CLb划线接种于固体产孢培养基上，37℃倒置培养5d；

二、然后用无菌去离子水将固体产孢培养基上的芽孢冲洗下来，加入终浓度为0.1mg/mL的溶菌酶，37℃水浴10min；

三、然后依次用含有10mmol/L EDTA的1mol/L NaCl溶液、0.14mol/L NaCl溶液和质量浓度为0.1%的SDS分别清洗芽孢一遍；

四、再用无菌去离子水清洗芽孢一遍；

五、将芽孢于80℃水浴热击10min后用无菌去离子水清洗三遍；

六、用去离子水悬浮芽孢，得到芽孢悬液，即为粗酶液；

七、取出500μL芽孢悬液，置于80℃烘箱内烘至恒重，计算出芽孢悬液浓度，并记录，剩余的芽孢悬液放在4℃冰箱中储存备用。

步骤一所述固体产孢培养基由0.04g/L的CuSO₄、10g/L的Tryptone（胰蛋白胨）、5g/L的Yeast Extract（酵母抽提物）、10g/L的NaCl、17g/L的琼脂和蒸馏水组成，调pH至7.0后高温高压灭菌。

本发明所提供的芽孢杆菌（Bacillus sp.）CLb经发酵培养，可制备具有漆酶活性的芽孢悬液，改制备方法操作简单，成本较低。所制备的芽孢漆酶具有广泛的pH和温度催化范围，在碱性和高温条件具有较好的稳定性，比真菌来源的漆酶具有更优越的适用性。在介体物质乙酰丁香酮的参与下，该芽孢漆酶能对不同化学结构合成染料有效脱色，因此本发明提供的芽孢漆酶在工业染料废水的处理上具有较好地应用前景。

本发明芽孢杆菌（Bacillus sp.）CLb属于芽孢杆菌属（Bacillus），保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2013年6月8日，保藏号为CGMCC No.7683。

附图说明

图1是芽孢杆菌CLb和相近菌株的16S rDNA序列进行同源性比对构建的系统发育树图；

图2是pH7.0时芽孢杆菌CLb芽孢漆酶以乙酰丁香酮为介体对RBBR、活性黑KN-B、靛红和结晶紫的脱色结果。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式产芽孢漆酶的芽孢杆菌为芽孢杆菌（Bacillus sp.）CLb，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2013年6月8日，保藏号为CGMCC No.7683；本发明芽孢杆菌CLb革兰氏染色阳性，细胞大小为（1μm～2μm）×（5μm～7μm），具有侧鞭毛和荚膜；在固体LB培养基上37℃培养24h，菌落乳白色、扁平、呈圆形，菌落表面干燥、光滑，菌落边缘呈叶状，菌落不透明且正反颜色一致。

本实施方式芽孢杆菌（Bacillus sp.）CLb由东北林业大学实验林场樟子松林下的土壤中筛选得到。筛选方法按以下步骤进行：称量采自东北林业大学实验林场樟子松林下的土壤样品10g，将土样重悬于120mL M9培养基中，振荡混匀，于150r/min37℃培养2d，取5mL上清液接种到100mL富集培养基中，于150r/min37℃培养4d，然后取2mL上清液接种到100mL富集培养基中，再于150r/min 37℃培养7d，将培养液适当稀释后涂布于含0.2mmol/L Cu²⁺的LB平板上，37℃培养3d，平板上长出单菌落，用质量浓度0.1%的丁香醛连氮溶液（用无水乙醇配制）滴加到单个菌落上，挑取滴加丁香醛连氮后显现粉红色的单菌落划线于含0.4mmol/LCu²⁺的LB平板上，37℃培养3d，平板上长出单菌落，再用质量浓度0.1%的丁香醛连氮溶液滴加到单个菌落上，得到产漆酶细菌的单克隆，选取对丁香醛连氮显色最深的一株，即得到芽孢杆菌CLb。

每1000mL M9培养基由20mL质量浓度为20%的葡萄糖溶液、200mL 5×M9盐溶液和余量的蒸馏水组成；所述5×M9盐溶液由64g/L的Na₂HPO₄·7H₂O、15g/L的KH₂PO₄、2.5g/L的NaCl、5g/L的NH₄Cl和蒸馏水组成。

所述富集培养基由0.05g CuSO₄·5H₂O和1000mL M9培养基组成。

对筛选得到的芽孢杆菌CLb进行分子鉴定，按以下步骤进行：提取菌株的总DNA，采用细菌的16S rDNA通用引物，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。然后利用胶回收试剂盒（购自于大连宝生物工程有限公司）回收纯化PCR产物，之后进行克隆、转化，筛选阳性克隆子菌落，经扩大培养后委托英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。

芽孢杆菌CLb的16SrDNA序列长度为1515bp，其序列如SEQ ID NO：1所示，测序结果与GenBank中的16S rDNA序列进行同源性比对，用Lasergene软件包中的Editseq和Megalign进行同源性分析并构建系统发育树（图1），以确定菌株的种属关系。同源性分析结果表明，该序列与芽孢杆菌属（Bacillus）的亲缘关系最为接近，保守区相似性为95%。通过结合菌体形态特征、生长条件确定芽孢杆菌CLb为芽孢杆菌属（Bacillus）的一株新菌株，命名为芽孢杆菌CLb。

具体实施方式二：利用具体实施方式一所述的芽孢杆菌CLb产芽孢漆酶的方法，按以下步骤进行：

四、再用无菌去离子水清洗芽孢一遍；

五、将芽孢于80℃水浴热击10min后用无菌去离子水清洗三遍；

六、用去离子水悬浮芽孢，得到芽孢悬液，即为粗酶液；

步骤一所述固体产孢培养基由0.04g/L的CuSO₄、10g/L的Tryptone（胰蛋白胨），5g/L的Yeast Extract（酵母抽提物）、10g/L的NaCl、17g/L的琼脂和蒸馏水组成，调pH至7.0后高温高压灭菌。

本实施方式的芽孢杆菌CLb所产的芽孢漆酶对不同化学结构的工业合成染料具有较好的脱色作用，验证实验具体如下：

1.脱色实验的反应体系

实验反应体系为6mL，在体系中依次加入pH 7.0柠檬酸-磷酸盐缓冲液（0.1mol/L）、染料（种类及终浓度见表1）、芽孢杆菌CLb芽孢漆酶（终浓度为1mg/ml）和乙酰丁香酮（终浓度为0.1mmol/L）。同时以不加入芽孢杆菌CLb芽孢漆酶的反应体系为空白对照。定时取样，12000r/min离心2min后测各染料最大吸收波长（见表1）下的吸收光值。所有测量均重复三次取平均值。然后计算染料脱色率。

2.脱色率的计算

染料的脱色率计算公式为（A₀-A）/A₀×100%，其中A₀为初始染料吸光值，A为定期取样测的吸光值。

表1 染料类型、终浓度及最大吸收波长

染料类型	染料名称	终浓度(mg/mL)	最大吸收波长(nm)
				蒽醌	RBBR	100	591
偶氮	活性黑KN-B	40	597

靛蓝	靛红	25	610
				三苯甲烷	结晶紫	5	583

pH7.0时芽孢杆菌CLb芽孢漆酶以乙酰丁香酮为介体对RBBR、活性黑KN-B、靛红和结晶紫的脱色结果如图2所示，图2中为RBBR，为活性黑KN-B，为靛红，为结晶紫。结果表明，芽孢杆菌CLb芽孢漆酶显示出较强的脱色染料的能力。在介体乙酰丁香酮的参与下，经过6h脱色后四种不同结构的合成染料的脱色率均在80%以上，其中对靛红的脱色率高达94.67%。

序列表

<110> 东北林业大学

<120> 一株产芽孢漆酶的芽孢杆菌及利用该菌产芽孢漆酶的方法

<160> 1

<210> 1

<211> 1515

<212> DNA

<213>芽孢杆菌属（Bacillus）

<400> 1

gagtttgatc ctggctcagg atgaacgctg gcggcgtgcc taatacatgc aagtcgagcg 60

aatggattaa gagcttgctc ttatgaagtt agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta 120

acctgcccat aagactggga taactccggg aaaccggggc taataccgga taatattttg 180

aaccgcatgg ttcgaaattg aaaggcggct tcggctgtca cttatggatg gacccgcgtc 240

gcattagcta gttggtgagg taactgctca ccaaggcaac gatgcgtagc cgacctgaga 300

gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtag 360

ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggctt 420

tcgggtcgta aaactctgtt gttagggaag aacaagtgct agttgaataa gctggcacct 480

tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta 540

ggtggcaagc gttatccgga attattgggc gtaaagcgcg cgcaggtggt ttcttaagtc 600

tgatgtgaaa gcccacggct caaccgtgga gggtcattgg aaactgggag acttgagtgc 660

agaagaggaa agtggaattc catgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatat ggaggaacac 720

cagtggcgaa ggcgactttc tggtctgtaa ctgacactga ggcgcgaaag cgtggggagc 780

aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagagg 840

gtttccgccc tttagtgctg aagttaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacggccg 900

caaggctgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta 960

attcgaagca acgcgaagaa ccttacctgg ccttgacatg ctgagaactt tccagagatg 1020

gattggtgcc ttcgggaact cagacacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt 1080

gagatgttgg gttaagtccc gtaacgagcg caacccttgt ccttagttac cagcacctcg 1140

ggtgggcact ctaaggagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaag 1200

tcatcatggc ccttacggcc agggctacac acgtgctaca atggtcggta caaagggttg 1260

ccaagccgcg aggtggagct aatcccataa aaccgatcgt agtccggatc gcagtctgca 1320

actcgactgc gtgaagtcgg aatcgctagt aatcgtgaat cagaatgtca cggtgaatac 1380

gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gtgggttgct ccagaagtag 1440

ctagtctaac cgcaaggggg acggttacca cggagtgatt catgactggg gtgaagtcgt 1500

aacaaggtaa ccgta 1515

Claims

1.一株产芽孢漆酶的芽孢杆菌（Bacillus sp.），其特征在于该菌为芽孢杆菌（Bacillus sp.）CLb，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2013年6月8日，保藏号为CGMCC No.7683。

2.利用如权利要求1所述的芽孢杆菌CLb产芽孢漆酶的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：

（1）、将芽孢杆菌CLb划线接种于固体产孢培养基上，37℃倒置培养5 d；

（2）、然后用无菌去离子水将固体产孢培养基上的芽孢冲洗下来，加入终浓度为0.1 mg/mL的溶菌酶，37℃水浴10 min；

（3）、然后依次用含有10 mmol/L EDTA的1 mol/L NaCl溶液、0.14 mol/L NaCl溶液和质量浓度为0.1%的SDS分别清洗芽孢一遍；

（4）、再用无菌去离子水清洗芽孢一遍；

（5）、将芽孢于80℃水浴热击10 min后用无菌去离子水清洗三遍；

（6）、用去离子水悬浮芽孢，得到芽孢悬液，即为粗酶液；

（7）、取出500 μL芽孢悬液，置于80℃烘箱内烘至恒重，计算出芽孢悬液浓度，并记录，剩余的芽孢悬液放在4℃冰箱中储存备用；

步骤（1）所述固体产孢培养基由0.04g/L的CuSO₄、10g/L的Tryptone、5g/L的Yeast Extract、10g/L的NaCl、17g/L的琼脂和蒸馏水组成。