CN104745567B - 一种固定化芽孢漆酶及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种固定化芽孢漆酶及其制备与应用，属于固定化技术领域和废水处理领域。本发明固定化芽孢漆酶是由芽孢杆菌属菌株所产的芽孢漆酶通过离子键和氢键固定在DEAE‑纤维素上形成的，它保留了芽孢漆酶广泛的pH适应能力和耐热性；在含有机溶剂、金属离子或抑制剂的溶液中，固定化芽孢漆酶具有比游离芽孢漆酶更强的稳定性。其制备过程主要包含芽孢的制备、载体预处理、吸附和收集四个步骤，操作简便，固定化率高。本发明提供的固定化芽孢漆酶具有很强的染料脱色能力，将其应用于纺织染料如甲基绿、甲基红、酸性红1和结晶紫的脱色处理，最高脱色率可达到95％左右。载体也可以选择性地吸附染料，与漆酶形成互补作用。

Description

一种固定化芽孢漆酶及其制备与应用

技术领域

本发明涉及一种固定化芽孢漆酶及其制备与应用，属于固定化技术领域和废水处理领域。

背景技术

漆酶(laccase)是一种含铜多酚氧化酶，广泛存在于真菌、细菌、植物和昆虫中。漆酶可以氧化许多酚类和非酚类物质，包括单酚、二酚、多酚、氨基酚、甲氧基苯酚、芳香胺和抗坏血酸盐等。漆酶在氧化底物的同时，将氧还原为水，本身不会产生有害物质，是一种非常环保的生物催化剂。漆酶由于具有宽泛的底物谱和较强的氧化性，在造纸工业、废水处理、纺织工业、食品加工、生物传感器以及生物诊断等方面都有良好的应用前景。

近年来，学者发现，细菌漆酶在碱性条件中的稳定性极高，而且通常比真菌漆酶更耐热。这说明细菌漆酶在纺织染料脱色应用中可能比真菌漆酶具有更大的潜力。芽孢杆菌属所产的CotA蛋白是芽孢外衣蛋白的一种，是研究得最深入的细菌漆酶。芽孢上还可能存在其他漆酶。所有这些依赖于芽孢并且以芽孢整体作为催化剂的漆酶被称之为芽孢漆酶，这些芽孢漆酶都具有极强的耐碱和耐热能力。游离的芽孢漆酶虽然比真菌漆酶更耐碱耐热，但在含有机溶剂、金属离子或抑制剂的溶液中其酶活仍会受到不同程度的抑制，而且难以重复利用，在工业化应用中受到限制。

酶的固定化可以增加酶在各种环境中的稳定性，还可以提高酶的重复利用率，是一种提高酶的使用价值的常见技术。然而，根据芽孢与固定化方法本身的特点及已有的芽孢固定化报道可知，芽孢的固定化相比一般酶或菌体的固定化更具难度。芽孢的固定化不同于一般酶的固定化，它体积大，重量大，不可伸展，难以利用多孔材料对其进行吸附，一般多孔材料的孔径都小于芽孢，而且所形成的氢键不足以稳固大重量的芽孢，也难以通过包埋对其进行固定，具非常严重的扩散限制现象，也难以通过共价结合和交联法来对其进行固定，芽孢与载体间较少的接触面难以提供足够的作用力使其芽孢固定在载体上。芽孢的固定化也不同于一般的细胞或菌体，因为芽孢的固定化不需要营养成份，不需过分注意剪切力，尤其是不能像丝头真菌一样能够形成菌丝球或缠绕在多孔材料上生活。

本发明旨在提供一种固定化芽孢漆酶，使芽孢漆酶耐碱、耐热，在含有机溶剂或金属离子或抑制剂的溶液中仍保持较高活力，而且更有利于回收重复利用。

发明内容

本发明首先提供了一种固定化芽孢漆酶，这种固定化芽孢漆酶耐碱、耐热、在含有机溶剂或金属离子或抑制剂的溶液中仍保持较高活力，而且更有利于回收重复利用。

所述固定化芽孢漆酶通过以下步骤来制备：

(1)制备芽孢；

(2)载体预处理：添加1－20倍柱体积的去离子水对DEAE-纤维素进行溶涨、搅拌，并静置过夜；DEAE-纤维素溶涨过夜后沉降下来，倾去含悬浮微粒的上清液，过滤；过滤所得的DEAE-纤维素，用酸处理0.5－2h，水洗到中性，过滤，再用碱处理0.5－2h，水洗到中性，过滤并收集；

(3)将制备好的芽孢按0.01－0.5g湿重芽孢：1gDEAE-纤维素的比例混合在缓冲液中，在4－40℃，50－250r/min条件下吸附1－48h；

(4)芽孢与DEAE-纤维素的混合物经混合吸附后，过滤，用缓冲液冲洗0－5次，过滤，收集固定化芽孢漆酶，保藏于0－40℃。

其中，DEAE-纤维素为棉纤维，所述的芽孢漆酶的来源菌株包括但不限于BacilluspumilusW3。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述的芽孢制备包括以下步骤：

①将产漆酶的芽孢杆菌属菌株在37℃条件下在生孢培养基上培养2－7d；

②以离心转速为6000－12000r/min，离心时间为5－30min的条件对上述培养物进行离心，收集芽孢；

③水洗芽孢0－3次；

④水洗所得的的芽孢加入溶菌酶使其终浓度为0.1－2mg/ml，在37℃条件下保温0.5－3h。

⑤溶菌酶处理后，先后经0.1MNaCl和0.1MKCl洗，6000－12000r/min离心5－30min收集芽孢。

⑥对芽孢进行湿重称量，用去离子水重悬芽孢，浓度为10mg/ml－100mg/ml。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述的芽孢制备方法，菌株培养时间为2d，离心转速为8000r/min，离心时间为10min，水洗芽孢1次，所加溶菌酶终浓度为1mg/ml，在37℃条件下保温的时间为2h。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的载体预处理方法，溶涨DEAE-纤维素的水的体积为5倍柱体积。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述酸为0.5MHCl，处理时间为1h。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述碱为0.5MNaOH，处理时间为1h。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)收集载体的方式可以是布氏漏斗或其他抽滤装置，如果没有抽滤装置，可以使其自然过滤，但需时间更长。收集的载体无需过干，不滴水即可。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)所述吸附过程的条件为：芽孢与DEAE-纤维素的配比为50mg湿重芽孢：1g干重DEAE-纤维素。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)、(4)所用缓冲液的离子强度为0.05M，pH值范围为5.0－10.5的缓冲液。可以是pH5.0－pH7.0的柠檬酸－磷酸盐缓冲液，或pH7.0－9.0的Tris-HCl缓冲液，或pH9.0－10.5的碳酸钠－碳酸氢钠缓冲液。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)所用缓冲液的pH范围为pH8.0－10.5，最适pH值为10.0。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)吸附过程的温度为37℃，转速180r/min，吸附时间为10h，最适pH范围为8.0－10.5。

在本发明的一种实施方式中，步骤(4)芽孢与DEAE-纤维素的混合物经混合吸附后，过滤，用缓冲液冲洗1次，过滤，收集固定化芽孢漆酶，保藏于4℃。

本发明还提供应用上述固定化芽孢漆酶对纺织染料废水进行脱色处理的方法，是向染料废水中添加适量固定化芽孢漆酶，在适当温度、pH条件下，对纺织染料废水进行脱色处理。

所述染料废水中的染料包括但不限于甲基绿、甲基红、酸性红1和结晶紫。

所述脱色处理的pH条件为3.0－10.0。不同染料的最适脱色pH值可能会有不同。

所述脱色处理的的温度范围为30－70℃。

所述脱色处理过程中，可以添加1－羟基苯并三唑(HBT)、2,2'-联氮基-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、丁香醛、香草醛和4－羟基苯甲酸中的任一种化合物作为介体。其中以ABTS的效果最佳，但也可以选用此五种以外的化合物作为介体，或者不用介体。介体添加浓度可以为0.1mM。

针对不同染料脱色时，可先利用游离芽孢漆酶作为催化剂确定漆酶对各种染料脱色时偏好的反应条件。

本发明的优点和有益效果在于：(1)本发明提供的固定化芽孢漆酶仍然保留了芽孢漆酶广泛的pH适应能力和耐热性；在含有机溶剂、金属离子或抑制剂的溶液中，固定化芽孢漆酶具有比游离芽孢漆酶更强的稳定性。本发明得到的固定化芽孢漆酶的所有酶学特性都要优于一般的真菌漆酶。本发明提供的固定化芽孢漆酶可以重复利用8次以上。(2)本发明所述的固定化芽孢漆酶的制备方法成本低，操作简便，固定化率平均高达90％以上。(3)本发明所提供的固定化芽孢漆酶应用于纺织染料脱色中，在芽孢量相同的情况下，具有比游离芽孢漆酶的更强的脱色能力。本发明所提供的固定化芽孢漆酶中的载体-DEAE－纤维素也能选择性地吸附染料，与漆酶起到互补作用。相对于游离芽孢漆酶而言，本发明所提供的固定化芽孢漆酶可以使更高浓度的染料脱色。

附图说明

图1为芽孢量对芽孢漆酶固定化的影响。

图2为吸附时间对芽孢漆酶固定化的影响。

图3为固定化芽孢漆酶在电镜扫描下的状态。

图4为固定化芽孢漆酶的pH稳定性。

图5为固定化芽孢漆酶的温度稳定性。

图6为固定化芽孢漆酶用于染料脱色。

具体实施方式

漆酶酶活测定方法：将50mg干重DEAE-纤维素所获得的固定化芽孢漆酶置于3.5ml缓冲液中，在37℃保温15min，添加底物反应5min，然后冰水浴10min以终止反应，以10000r/min离心反应样品，取上清液检测吸光值。底物为ABTS(0.5mM)或丁香醛连氮(0.05mM)或2,6－甲氧基苯酚(2mM)，检测波长为420nm(ABTS)、525nm(丁香醛连氮)和469nm(2,6－甲氧基苯酚)。

初始酶活是指：游离芽孢漆酶酶活。该游离芽孢漆酶作为对照组，与固定化芽孢漆酶具有相同的芽孢量，其处理过程与固定化芽孢漆酶相同(不添加载体)。

滤出液酶活是指：芽孢与DEAE-纤维素的混合物经混合吸附后，过滤处理得到的滤出液的酶活。

固定化率＝(初始酶活－滤出液酶活)/初始酶活*100％

相对酶活是指：在固定化条件选择、最适pH和最适温度实验中，相对酶活为各条件下的酶活与最高酶活的百分比，设最高酶活为100％；在稳定性实验中，相对酶活为各条件下的酶活与未经处理的固定化芽孢漆酶的酶活的百分比，设未经处理的固定化芽孢漆酶的酶活为100％。

实施例1芽孢漆酶的固定化方法1

添加5倍柱体积的去离子水对DEAE-纤维素进行溶涨、搅拌，并静置过夜。抽滤溶涨好的DEAE-纤维素，然后用0.5MHCl处理1h，水洗到中性，过滤，再用碱处理1h，水洗到中性，过滤并收集。将活化好的DEAE-纤维素与制备好的芽孢以配比为50mg湿重芽孢﹕1g干重DEAE-纤维素进行混合，在37℃，180r/min条件下吸附10h，然后过滤，收集固定化芽孢漆酶和滤液并检测酶活。最终固定化芽孢漆酶的固定化率为99.23％。在检测芽孢量的影响中，本实验条件得到的固定化芽孢漆酶的相对酶活达到最大值的98.22％。在检测吸附时间的影响中，本实验条件得到的固定化芽孢漆酶其相对酶活达到最大值的99.69％。

实施例2芽孢漆酶的固定化方法2

吸附pH为8，其他步骤与实施例1相同。最终固定化芽孢漆酶的固定化率为90.41％。

实施例3芽孢漆酶的固定化方法3

吸附pH为5，其他步骤与实施例1相同，最终固定化芽孢漆酶的固定化率为80.73％。

实施例4芽孢漆酶的固定化方法4

芽孢量与DEAE－纤维素的配比变为30mg:1g，其他步骤与实施例1相同。最终固定化芽孢漆酶的相对酶活达到最大值的72.68％。

实施例5芽孢漆酶的固定化方法5

芽孢量与DEAE－纤维素的配比变为90mg:1g，其他步骤与实施例1相同。最终固定化芽孢漆酶的相对酶活为100.00％。

实施例6芽孢漆酶的固定化方法6

吸附时间为0.5h，其他步骤与实施例1相同。最终固定化芽孢漆酶的相对酶活为62.31％。实施例7芽孢漆酶的固定化方法7

吸附时间为24h，其他步骤与实施例1相同。最终固定化芽孢漆酶的相对酶活达到最大值的的100.00％。

实施例8固定化芽孢漆酶的最适pH和pH稳定性

以实施例1制得的固定化芽孢漆酶作为测试对象检测其最适pH与pH稳定性。

最适pH的检测：将50mg干重DEAE-纤维素所获得的固定化芽孢漆酶置于3.5ml缓冲液中(缓冲液pH范围为3.0－9.0)，根据处理的缓冲液选择底物并检测吸光值，检测方法如前所述。结果表明固定化芽孢漆酶的最适pH分别为3.2、7.0和7.0。

pH稳定性的检测：取上述相同酶量的固定化芽孢漆酶置于5ml离心管中。离心管被分为pH3、pH7和pH9三组，每组11管，各添加3.5ml缓冲液，分别保存0－10天，检测残余酶活。检测体系与检测方法如前所述。结果如图4所示，固定化芽孢漆酶具有广泛的pH适应能力。例如，在pH3、pH7和pH9三个条件下保存10天，固定化芽孢漆酶的相对酶活分别为29.73％，52.46％和46.35％。

上述的缓冲液包括：0.1M柠檬酸－磷酸盐缓冲液(pH3.0－pH7.0)，0.1MTris-HCl缓冲液(pH7.0－9.0)。底物为ABTS(0.5mM，在酸性条件下使用)，丁香醛连氮(0.05mM，在中性条件使用)，2,6－甲氧基苯酚(2mM，在碱性条件下使用)。

实施例9固定化芽孢漆酶的最适温度及温度稳定性

最适温度检测：与实施例8的检测方法基本相同，不同之处在于，保温及反应温度分别为25℃、35℃、45℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃和90℃，共10个梯度，缓冲液统一为0.1M柠檬酸－磷酸盐缓冲液(pH6.8)。实验结果表明，固定化芽孢漆酶的最适温度为55℃。

温度稳定性检测：分别检测固定化芽孢漆酶在60℃、70℃、80℃和90℃条件下保温10h的温度稳定性。检测方法与最适温度的检测基本相同，不同之处在于，所有固定化芽孢漆酶置于相应温度下保温，每隔1h测一次酶活，直到10h，或直到酶活消失(当酶活在10h以前消失时)，反应时间为3min。结果如图5所示，固定化芽孢漆酶在70℃、80℃的半衰期分别为5.5h和2.2h，而在60℃条件下保温10h仍保留有73.75％，在90℃保温1h时还具初始酶活的10.10％。结果说明，芽孢杆菌漆酶是非常耐热的。

实施例10固定化芽孢漆酶在含有机溶剂溶液中的稳定性

将干重50mgDEAE－纤维素所获得的固定化芽孢漆酶置于3.5ml含相应浓度有机溶剂的缓冲液中(缓冲液pH6.8)，在37℃保温2h，添加丁香醛连氮反应5min，然后冰水浴10min以终止反应，以10000r/min离心反应样品，在λ＝525nm的波长下检测吸光值。以不添加任何有机溶剂作为对照，并取其吸光值为100％。所得结果如表1所示：

表1：有机溶剂对固定化芽孢漆酶活性的影响

实施例11固定化芽孢漆酶在含金属离子溶液中的稳定性

操作方法与实施例10基本相同，不同之处在于，将固定化芽孢漆酶置于3.5ml含相应浓度金属离子的缓冲液中(缓冲液pH6.8)，在37℃保温15min。得结果如表2所示：

表2：金属离子对固定化芽孢漆酶活性的影响

实施例12固定化芽孢漆酶在含抑制剂溶液中的稳定性

操作方法与实施例11基本相同，不同之处在于，溶液中不含金属离子，而含相应浓度的漆酶酶活抑制剂。得结果如表3所示：

表3：抑制剂对固定化芽孢漆酶活性的影响

实施例13固定化芽孢漆酶在纺织染料废水中的脱色应用1

称取适量固定化酶(份量为0.2g载体的固定化量)置于0.1M柠檬酸－磷酸盐缓冲(pH7.0)中，往缓冲液中添加ABTS使其终浓度为0.1mM,再向缓冲液中添加甲基绿，使其终浓度为100mg/L。将反应样品置于37℃、180r/min条件下，振荡保温24h，检测吸光度。此外，不加酶的载体经同样的处理用来作为载体吸附脱色的对照，不添加酶的样品作为空白对照，与上述实验组样品并行处理。结果如图6所示，载体吸附脱色率为6.85％，而固定化芽孢漆酶的脱色率为86.82％。结果表明，固定化芽孢漆酶具有很强的脱色能力。

实施例14固定化芽孢漆酶在纺织染料废水中的脱色应用2

步骤与实施例13基本相同，不同之处在于，所加的染料为甲基红，终浓度为50mg/L。结果结果如图6所示，载体吸附脱色率为58.96％，固定化芽孢漆酶的脱色率为78.14％。

实施例15固定化芽孢漆酶在纺织染料废水中的脱色应用3

步骤与实施例14基本相同，不同之处在于，所加的染料为酸性红1，反应温度为60℃。结果如图6所示，载体载体吸附脱色率为91.95％，固定化芽孢漆酶的脱色率为90.94％。这说明载体对部分染料如酸性红1有极强的吸附作用，芽孢漆酶固定在载体上，占去了部分吸附位点，使得总体脱色率降低。

实施例16固定化芽孢漆酶在纺织染料废水中的脱色应用4

步骤与实施例13基本相同，区别在于所加染料为结晶紫，反应温度为60℃。结果如图6所示，载体吸附脱色率为91.77％，固定化芽孢漆酶的脱色率为95.22％。

实施例17芽孢漆酶的固定化方法8

芽孢量与DEAE－纤维素的配比变为500mg:1g，其他步骤与实施例1相同。最终固定化芽孢漆酶的相对酶活达到100.00％。

实施例18芽孢漆酶的固定化方法9

吸附时间为48h，其他步骤与实施例1相同。最终固定化芽孢漆酶的相对酶活达到99.81％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一种制备固定化芽孢漆酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备芽孢杆菌属菌株的芽孢；

(2)载体预处理：添加5倍柱体积的去离子水对DEAE-纤维素进行溶涨、搅拌，并静置过夜；DEAE-纤维素溶涨过夜后沉降下来，倾去含悬浮微粒的上清液，过滤；过滤所得的DEAE-纤维素，用酸处理1h，所述酸为0.5M HCl，水洗到中性，过滤，再用碱处理 1h，所述碱为0.5MNaOH，水洗到中性，过滤并收集；

(3)将制备好的芽孢按0.01－0.5g湿重芽孢：1gDEAE-纤维素的比例混合在缓冲液中，在4－40℃， 50－250r/min 条件下吸附 1－48h；

(4)芽孢与DEAE-纤维素的混合物经混合吸附后，过滤，用缓冲液冲洗1－5次，过滤，收集固定化芽孢，保藏于 0－40℃。

2.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)芽孢与 DEAE-纤维素的配比为50mg湿重芽孢：1g干重 DEAE-纤维素；所用缓冲液的离子强度为 0.05M，pH值范围为5.0－10.5。

3.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)吸附过程的温度为37℃，转速180r/min，吸附时间为10h，缓冲液pH范围为pH8.0－10.5。

4.根据权利要求1所述方法制备的固定化芽孢漆酶，其特征在于，以离子交换剂为载体，通过氢键和离子键的作用将芽孢漆酶固定在离子交换剂表面；所述离子交换剂为DEAE-纤维素；所述芽孢漆酶是芽孢杆菌属菌株所产的具有漆酶活力的芽孢。

5.权利要求4所述的固定化芽孢漆酶在纺织染料废水的脱色处理中的应用。

6.根据权利要求 5所述的应用，其特征在于，向废水中添加介体，所述介体为1－羟基苯并三唑、2,2'-联氮基-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐、丁香醛、香草醛或4－羟基苯甲酸。

7.根据权利要求 6所述的应用，其特征在于，所述的纺织染料为甲基绿、甲基红、酸性红 1或结晶紫中的一种或几种。