KR102276594B1 - 키토산 코팅된 효소-다공성물질 복합체 및 이의 제조방법 - Google Patents

키토산 코팅된 효소-다공성물질 복합체 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 키토산 코팅된 효소-다공성물질 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것으로 (A) 다공성 담체의 기공 내부에 효소를 흡착시키는 단계; (B) 효소가 흡착된 다공성 담체의 표면에 키토산을 흡착시키는 단계; 및 (C) 키토산에 글루타릭 디알데히드를 첨가하여 키토산의 아민기 간의 가교결합을 수행하는 단계를 포함함으로써, 효소의 변성을 최소화하고 다공성 담체 내부에 흡착된 효소의 누출을 효과적으로 방지할 수 있다.
또한, 바이오전환 소재, 바이오정화 소재, 오염방지(Antifouling)용 도료, 세제용 생촉매 소재, 효소기반 컬럼, 이산화탄소 전환용 패킹 소재, 바이오센서, 바이오연료전지 등의 다양한 분야에 적용시킬 수 있다.

Description

키토산 코팅된 효소-다공성물질 복합체 및 이의 제조방법{chitosan coated enzyme-porous material complex and manufacturing method thereof}
본 발명은 다공성 담체 내부에 흡착된 효소의 누출을 효과적으로 방지할 수 있는 가교결합된 키토산 코팅된 효소-다공성물질 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
효소의 경제성을 향상시키기 위해서는 고정화된 효소를 통한 효소의 재사용과 회수 과정이 필요하다. 또한, 고정화된 효소의 사용은 반응기의 설계나 컨트롤을 매우 간편하게 할 수 있어 효소를 산업적으로 활용하기 위해 필수적인 요소라 할 수 있다.
다공성 물질(porous materials)은 내부에 형성된 기공들의 높은 표면적을 활용하여, 기존의 방법들에 비해 훨씬 높은 효소 담지량을 실현할 수 있다. 상기 다공성 물질을 이용한 일반적인 효소 고정화 방법으로는 단순 흡착(adsorption)이나 공유결합을 이용한 효소 부착(covalent attachment)의 방법이 있다. 하지만, 상기 단순 흡착방법은 기공 내의 효소가 누출되는 현상을 방지할 수 없으며, 공유결합을 통해 효소를 다공성 물질의 내부 표면에만 부착시켜 다공성 물질의 기공을 효율적으로 활용할 수 없는 문제점들이 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위해, 다공성 물질 내에 효소 담지량을 높이고 효소의 누출을 방지하는 아주 간단하고 효과적인 방법으로 NER(Nanoscale Enzyme Reactor) 접근방식이 고안되었다. 쉽-인-어-바틀(ship-in-a-bottle) 접근방식으로도 불리는 상기 NER 기술은 다공성 물질의 기공 안에서 효소를 가교결합시켜 효소의 누출을 효과적으로 방지함으로써 효소활성을 안정화할 수 있다. 상기 기술은 효소활성의 안정성 향상뿐만 아니라, 효소의 고집적, 반응기질의 물질전달저항 감소 등 다양한 장점이 존재한다. 그러나, 상기 효소간의 가교결합 과정에서 효소의 구조적 변성에 의한 활성 저하가 발생할 수 있으며, 특히 활성부위에 가교결합제와 반응할 수 있는 아미노기가 존재하는 일부 효소의 경우, 가교결합 과정을 통해 심각한 활성 저하가 발생할 수 있다.
따라서 다공성 물질 내에 집적된 효소의 누출을 방지함과 동시에, 가교결합에 의한 효소의 구조적 변성을 방지할 수 있는 혁신적인 효소 고정화 기술이 필요하다.
대한민국 공개특허 제2014-0055566호 대한민국 공개특허 제2013-0130640호
본 발명의 목적은 다공성 담체 내부에 흡착된 효소의 누출을 효과적으로 방지할 수 있도록 가교결합된 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체의 제조방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법에 따라 제조된 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체를 제공하는데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체의 제조방법은 (A) 다공성 담체의 기공 내부에 효소를 흡착시키는 단계; (B) 상기 효소가 흡착된 다공성 담체의 표면에 키토산을 흡착시키는 단계; 및 (C) 상기 키토산과 가교제를 반응시켜 상기 키토산의 아민기 간의 가교결합을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 가교제는 글루타릭 디알데히드, 디이소시아네이트, 디안히드라이드, 디에폭사이드, 디알데하이드, 디이미드, 비스(이미도 에스테르), 비스(석신이미딜 에스테르) 및 디애시드 클로라이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 키토산의 농도가 0.01 내지 10.0 mg/mL, 바람직하게는 0.1 내지 1.0 mg/mL인 키토산 용액일 수 있다.
상기 가교제는 0.0001 내지 10.0% (w/w) 바람직하게는 0.001 내지 1.0% (w/w)인 글루타릭 디알데히드 용액일 수 있다.
상기 효소는 탄산무수화효소(carbonic anhydrase), 트립신(trypsin), 당산화효소(glucose oxidase), 알코올탈수소효소(alcohol dehydrogenase), 포름산탈수소효소(formate dehydrogenase) 및 포름알데하이드탈수소효소(formaldehyde dehydrogenase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 다공성 담체의 기공 내부에 코펙터(cofactor)가 추가로 흡착될 수 있다.
상기 코펙터는 수소전이 조효소 및 기전이 조효소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 다공성 담체는 다공성 실리카담체, 다공성 탄소담체 및 고분자 담체로 이루어진 군에서 선택된 1종일 수 있다.
또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체는 상기 제조방법에 따라 제조될 수 있다.
또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위하여 상기 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체는 바이오전환 소재, 바이오정화 소재, 오염방지(Antifouling)용 도료, 세제용 생촉매 소재, 효소기반 컬럼, 이산화탄소 전환용 패킹 소재, 바이오센서 또는 바이오연료전지에 함유될 수 있다.
본 발명의 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체는 다공성 담체와 글루타릭 디알데히드를 사용함으로써 기공에 효소가 흡착된 다공성 담체의 표면을 키토산 코팅층으로 코팅시켜 상기 흡착된 효소의 누출을 효과적으로 방지할 수 있으며, 효소 활성 및 안정성을 증진시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체는 기공에 흡착되는 효소를 다양하게 함으로써 바이오전환 소재, 바이오정화 소재, 오염방지(Antifouling)용 도료, 세제용 생촉매 소재, 효소기반 컬럼, 이산화탄소 전환용 패킹 소재, 바이오센서 또는 바이오연료전지에 적용시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체를 제조하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 2a는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따라 제조된 복합체의 고정화된 탄산무수화효소의 초기활성을 나타낸 그래프이다.
도 2b는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따라 제조된 복합체의 고정화된 탄산무수화효소의 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 다른 실시예에 따라 제조된 복합체에 담지되어 고정화된 탄산무수화효소를 이용하여 사이클에 따라 생성된 탄산염의 함량을 나타낸 그래프이다.
도 4a는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따라 제조된 복합체의 고정화된 트립신의 초기활성을 나타낸 그래프이다.
도 4b는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따라 제조된 복합체의 고정화된 트립신의 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 5a는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따라 제조된 복합체의 고정화된 당산화효소의 초기활성을 나타낸 그래프이다.
도 5b는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따라 제조된 복합체의 고정화된 당산화효소의 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 6a는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따라 제조된 복합체의 고정화된 알코올탈수소효소의 초기활성을 나타낸 그래프이다.
도 6b는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따라 제조된 복합체의 고정화된 알코올탈수소효소의 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 7a는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따라 제조된 복합체의 고정화된 포름산탈수소효소의 초기활성을 나타낸 그래프이다.
도 7b는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따라 제조된 복합체의 고정화된 포름산탈수소효소의 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 8a는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따라 제조된 복합체의 고정화된 포름알데하이드탈수소효소의 초기활성을 나타낸 그래프이다.
도 8b는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따라 제조된 복합체의 고정화된 포름알데하이드탈수소효소의 안정성을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 가교결합시 효소의 변성을 최소화하고 다공성 담체 내부에 흡착된 효소의 누출을 효과적으로 방지할 수 있는 키토산 코팅된 효소-다공성물질 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체의 제조방법은 (A) 다공성 담체의 기공 내부에 효소를 흡착시키는 단계; (B) 상기 효소가 흡착된 다공성 담체의 표면에 키토산을 흡착시키는 단계; 및 (C) 상기 키토산과 가교제를 반응시켜 상기 키토산의 아민기 간의 가교결합을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
먼저, 상기 (A)단계에서는 다공성 담체의 기공 내부에 효소를 흡착시킨다.
상기 효소는 탄산무수화효소, 트립신, 당산화효소, 알코올탈수소효소, 포름산탈수소효소 및 포름알데하이드탈수소효소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 들 수 있다.
본 발명에 사용된 상기 효소 외에 서브틸리신, 파파인, 리파아제, 허스래디시 퍼옥시다아제, 소이빈 퍼옥시다아제, 클로로 퍼옥시다아제, 망가네이즈 퍼옥시다아제, 티록시나제, 락카아제, 셀룰라아제, 자일라나제, 수크라아제, 오가노 포스포 히드라아제, 콜린 에스터아제, 글루코스 히드라아제, 글루코스 이소머아제, 콜레스테롤 옥시다제, 폴리페놀 옥시다제, 모노아민 옥시다제, 잔틴 옥시다제, 시토토크롬 옥시다제, 아스코르브산 옥시다제, 및 D-아라비노-1,4-락톤 옥시다제 등도 사용이 가능하다.
또한, 상기 다공성 담체로 다공성 실리카담체, 다공성 탄소담체 및 고분자 담체로 이루어진 군에서 선택된 1종을 사용함으로써 가교제를 사용시 다공성 담체 표면에 최대한 밀착되면서 키토산을 코팅시켜 효소가 다공성 담체 외부로 누출되는 것을 방지한다. 이때 다공성 담체로 실리카담체, 탄소담체, 고분자담체 대신에 다공성의 알루미나담체, 니오비움담체, 탄탈룸담체, 지르코늄담체, 티타늄담체, 비닐고분자담체 등을 사용할 수도 있다.
상기 다공성 담체의 기공 내부에는 효소와 함께 코펙터(cofactor)가 흡착될 수 있다.
상기 코펙터는 수소전이 조효소 및 기전이 조효소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
다음으로, 상기 (B)단계에서는 상기 효소가 흡착된 다공성 담체의 표면에 키토산을 흡착시킨다.
도 1에 도시된 바와 같이, 상기 키토산은 다공성 담체의 표면에 위치되어 있을 뿐 다공성 담체와 밀착되어 있거나 키토산 간에 긴밀하게 결합되어 있지 않다.
다음으로, 상기 (C)단계에서는 가교제를 이용하여 상기 다공성 담체의 표면에 위치된 키토산을 가교결합시킨다.
상기 키토산과 가교제를 반응시키면 키토산의 아민기 간의 가교결합이 수행됨으로써, 키토산끼리 긴밀하게 결합되어 나노다공성 담체 표면에 키토산 코팅층을 형성한다.
또한, 상기 가교제로는 글루타릭 디알데히드, 디이소시아네이트, 디안히드라이드, 디에폭사이드, 디알데하이드, 디이미드, 비스(이미도 에스테르), 비스(석신이미딜 에스테르) 및 디애시드 클로라이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 들 수 있으며, 바람직하게는 글루타릭 디알데히드이다.
본 발명에서는 상기 가교제를 사용하므로 상기 키토산 코팅층과 다공성 담체 표면이 결합되지 않고 밀착된다.
상기 키토산의 농도가 0.01 내지 10.0 mg/mL 바람직하게는 0.1 내지 1.0 mg/mL인 키토산 용액일 수 있다. 상기 키토산 용액의 농도가 하한치 미만인 경우에는 키토산 코팅층이 형성되지 않을 수 있으며, 상한치 초과인 경우에는 키토산 코팅층과 다공성 담체의 표면이 밀착되지 않을 수 있다.
상기 가교제는 0.0001 내지 10.0% (w/w) 바람직하게는 0.001 내지 1.0% (w/w)인 글루타릭 디알데히드 용액일 수 있다. 상기 가교제 용액의 농도가 상기 하한치 미만인 경우에는 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체의 활성 및 안정성이 저하될 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 키토산 코팅층이 다공성 담체의 표면에 빽빽이 밀착되어 효소의 반응물 및 생성물의 유출입이 제한될 수 있다.
특히, 가교제 용액의 농도가 낮을수록 키토산의 가교결합이 용이하지 못하여 효소의 누출을 효과적으로 방지할 수 없으며, 알코올탈수소효소와 같은 반응부위 내에 가교제와 결합 가능한 아미노기가 존재하는 경우에는 가교제의 농도가 높아질수록 내부의 효소에도 영향을 주기 때문에 활성이 크게 감소하게 된다. 그러므로 효소별로 적절한 가교제의 농도 설정하는 것이 바람직하다.
상기의 제조방법에 따라 제조된 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체는 효소 활성 및 안정성을 증진시킬 수 있으며, 효소를 다양하게 함으로써 바이오전환 소재, 바이오정화 소재, 오염방지(Antifouling)용 도료, 세제용 생촉매 소재, 효소기반 컬럼, 이산화탄소 전환용 패킹 소재, 바이오센서, 바이오연료전지 등의 다양한 소재 개발에 적용시킬 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
<탄산무수화효소>
실시예 1. 탄산무수화효소
탄산무수화효소를 고정화하기 위해 자성 분리가 가능한 구형 나노다공성 실리카 4 mg에 탄산무수화효소 용액(4 mg효소/mlPB, 100 mM 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer, PB)) 2 mL을 넣어 1시간 동안 200 rpm으로 교반시켰다. 그 뒤 자성 분리를 통해 흡착되지 않은 효소를 제거하고, 0.5 mg/mL의 키토산 용액을 2 mL 첨가하였다. 키토산 분자가 실리카의 표면에 충분히 흡착되도록 상온에서 15시간 동안 200 rpm에서 교반시켜준 후 자성 분리를 통해 남은 키토산을 제거하였다. 그 뒤, 가교제로 0.001% 글루타릭 디알데히드(glutaraldehyde, GA)를 첨가하고, 2시간 동안 200 rpm에서 교반시켜 키토산 간의 가교결합을 유도하였으며, 반응에 참여하지 않고 남아있는 글루타릭 디알데히드를 비활성화하기 위해 PB 2 mL을 넣고 2시간 동안 200 rpm에서 교반시켜 준 후 트리스 버퍼(100 mM Tris buffer)를 이용해 1시간 동안 200 rpm에서 추가로 교반시켜 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체를 제조하였다. 이후 효소고정화 물질을 PB를 이용하여 세척한 후 4 ℃에서 보관하였다.
실시예 2. 탄산무수화효소
상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 상기 0.001% 글루타릭 디알데히드 대신 0.01% 글루타릭 디알데히드를 사용하여 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체를 제조하였다.
실시예 3. 탄산무수화효소
상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 상기 0.001% 글루타릭 디알데히드 대신 0.1% 글루타릭 디알데히드를 사용하여 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체를 제조하였다.
비교예 1. 키토산 및 글루타릭 디알데히드 사용 안함
자성 분리가 가능한 구형 나노다공성 실리카 입자 4 mg에 탄산무수화효소 용액(4 mg효소/mlPB, 100 mM 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer, PB)) 2 mL을 넣어 1시간 동안 200 rpm으로 교반시켜 복합체를 제조하였다. 이후 상기 복합체를 PB를 이용하여 세척한 후 4 ℃에서 보관하였다.
비교예 2. 키토산 사용 안함
자성 분리가 가능한 구형 나노다공성 실리카 입자 4 mg에 탄산무수화효소 용액(4 mg효소/mlPB, 100 mM 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer, PB)) 2 mL을 넣어 1시간 동안 200 rpm으로 교반시켰다. 그 뒤 자성 분리를 통해 흡착되지 않은 효소를 제거하고, 0.1%의 글루타릭 디알데히드 용액을 2 mL을 첨가하였다. 그 뒤 효소 흡착 물질과 글루타릭 디알데히드 용액 혼합물을 30분간 세워 둔 후 30분 동안 200 rpm에서 교반시킨 다음 트리스 완충용액(100 mM Tris buffer)을 이용하여 1시간 동안 200 rpm에서 교반시켜 복합체를 제조하였다. 이후 상기 복합체를 PB를 이용하여 세척한 후 4 ℃에서 보관하였다.
비교예 3. 글루타릭 디알데히드 사용 안함
자성 분리가 가능한 구형 다공성 실리카 4 mg에 탄산무수화효소 용액(4 mg효소/mlPB, 100 mM 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer, PB)) 2 mL을 넣어 1시간 동안 200 rpm으로 교반시켰다. 그 뒤 자성 분리를 통해 흡착되지 않은 효소를 제거하고, 0.5 mg/mL의 키토산 용액 2 mL를 첨가하였다. 키토산 분자가 실리카의 표면에 충분히 흡착되도록 상온에서 15시간 동안 200 rpm에서 교반시켜준 후 자성 분리를 통해 남은 키토산을 제거하였다. 그 뒤, PB 2 mL을 넣고 2시간 동안 200 rpm에서 교반시켜 준 후 트리스 버퍼(100 mM Tris buffer)를 이용해 1시간 동안 200 rpm에서 추가로 교반시켜 복합체를 제조하였다. 이후 상기 복합체를 PB를 이용하여 세척한 후 4 ℃에서 보관하였다.
시험예 1. 고정화된 탄산무수화효소의 활성 및 안정성 측정
도 2a는 실시예 1 내지 3 및 비교예 1 내지 3에 따라 제조된 복합체의 고정화된 탄산무수화효소의 초기활성을 나타낸 그래프이며, 도 2b는 실시예 1 내지 3 및 비교예 1 내지 3에 따라 제조된 복합체의 고정화된 탄산무수화효소의 안정성을 나타낸 그래프이다. 상기 고정화된 탄산무수화효소에서 '고정화'는 나노다공성 실리카담체의 기공 내부에 흡착되고 키토산 코팅층에 의해 외부로 누출되지 않도록 상기 기공 내부에 고정화된 것을 의미한다.
상기 탄산무수화효소 활성의 측정은 수용액 버퍼 내에서의 탄산무수화효소의 반응 기질인 4-nitrophenyl acetate(4-NA)의 가수분해를 통해 측정하였다. 4-NA 용액은 4-NA를 아세토나이트릴을 이용해 용해시킨 용액(10.9 mg/mL in acetonitrile)을 100 mM 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer, pH 7.6)를 이용하여 1/20 희석하여 사용하였다. 구형 나노다공성 실리카에 고정화된 효소(enzyme)의 경우에는 실시간으로 측정이 불가능하므로 2 mL의 4-NA 용액에 상기 복합체를 넣어 200 rpm으로 반응시킨 후, 시간별로 0.1 mL씩 샘플을 취하여 측정하는 방법을 사용하였다. 다음으로, 100 mM 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer, pH 7.6)를 이용하여 1/10로 희석한 후 생성물의 농도를 348 nm에서 분광광도계(spectrophotometer)로 흡광도를 측정하였다. 효소의 안정성 측정은 시간에 따라 상기와 같은 방법으로 활성을 측정하는 방법, 같은 샘플을 재사용하여 활성을 측정하여 초기 활성과 비교하는 방법의 두 가지 방법을 통하여 측정하였다.
도 2에 도시된 바와 같이, 본 발명의 실시예 1 내지 3에 따라 제조된 복합체는 비교예 1 및 3의 복합체에 비하여 활성이 우수한 것을 확인하였으며, 특히 0.1% 글루타릭 디알데히드를 사용한 실시예 3의 복합체가 다른 실시예에 비하여 가장 우수한 활성을 나타낸 것을 확인하였다.
또한, 실시예 1 내지 3의 복합체는 비교예 1 및 3의 복합체에 비하여 80일까지 효소가 거의 누출되지 않은 것으로 보아 우수한 안정성을 보이는 것을 확인하였다. 이러한 특성은 실시예 3이 가장 우수하였다.
상기 도 2b에서 free CA는 유리된 효소, 예컨대 고정화 과정 없이 용매에 용해된 효소 그 자체이다. 교반조건에서 안정성을 확인하게 되면 빠르게 활성이 저하된다.
시험예 2. 고정화된 탄산무수화효소를 이용한 탄산염 전환
도 3은 본 발명의 실시예 3에 따라 제조된 복합체에 담지되어 고정화된 탄산무수화효소를 이용하여 사이클에 따라 생성된 탄산염의 함량을 나타낸 그래프이다.
실시예 3의 복합체 2 mg을 20 mL의 100 mM 트리스 버퍼(Tris buffer, pH 7.6)에 넣은 후 100 v/v% CO2가스를 0.15 L/min의 속도로 5분 동안 병에 폭기시켜 이산화탄소를 중탄산염 이온(bicarbonate ion)으로 전환시킨 다음 자성 분리를 통해 실시예 3의 복합체와 중탄산염 이온 수용액을 분리시킨다. 그 후 상기 중탄산염 이온 수용액을 10 mL의 670 mM 염화칼슘 수용액에 넣어준 후 중탄산염 이온이 탄산칼슘 결정으로 충분히 전환될 수 있도록 상온에서 하룻밤 동안 200 rpm에서 교반시킨다. 교반시킨 용액은 진공 펌프를 이용하여 종이 필터에 거른 후 이 종이 필터를 100 ℃에서 하룻밤동안 건조시켜 그 질량을 측정하였다.
도 3에 도시된 바와 같이, 실시예 3의 복합체는 탄산무수화효소를 이용하여 이산화탄소를 탄산칼슘으로 전환하는 과정을 30회 동안 수행하면서 일정한 양의 탄산칼슘(120-160 mg)을 지속적으로 생성할 수 있다는 것을 확인하였다.
<트립신>
실시예 4. 트립신, 0.001% 글루타릭 디알데히드
상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 상기 탄산무수화효소 대신 트립신을 사용하여 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체를 제조하였다.
실시예 5. 트립신, 0.01% 글루타릭 디알데히드
상기 실시예 4와 동일하게 실시하되, 상기 0.001% 글루타릭 디알데히드 대신 0.01% 글루타릭 디알데히드를 사용하여 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체를 제조하였다.
실시예 6. 트립신, 0.1% 글루타릭 디알데히드
상기 실시예 4와 동일하게 실시하되, 상기 0.001% 글루타릭 디알데히드 대신 0.1% 글루타릭 디알데히드를 사용하여 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체를 제조하였다.
비교예 4. 키토산 및 글루타릭 디알데히드 사용 안함
상기 비교예 1과 동일하게 실시하되, 상기 탄산무수화효소 용액 대신 트립신 용액을 사용하여 복합체를 제조하였다.
비교예 5. 키토산 사용 안함
상기 비교예 2와 동일하게 실시하되, 상기 탄산무수화효소 용액 대신 트립신 용액을 사용하여 복합체를 제조하였다.
비교예 6. 글루타릭 디알데히드 사용 안함
상기 비교예 3과 동일하게 실시하되, 상기 탄산무수화효소 용액 대신 트립신 용액을 사용하여 복합체를 제조하였다.
시험예 3. 고정화된 트립신의 활성 및 안정성 측정
도 4a는 실시예 4 내지 6 및 비교예 4 내지 6에 따라 제조된 복합체의 고정화된 트립신의 초기활성을 나타낸 그래프이며, 도 4b는 실시예 4 내지 6 및 비교예 4 내지 6에 따라 제조된 복합체의 고정화된 트립신의 안정성을 나타낸 그래프이다.
트립신 활성의 측정은 수용액 버퍼 내에서의 트립신의 반응 기질인 N-Benzoyl-L-arginie 4-nitroanilide ahydrochloride (BAPNA)의 반응을 통해 측정하였다. BAPNA 용액은 BAPNA를 N,N-Dimethylformamide(DMF)로 용해시킨 용액(10 mg/mL in DMF)을 100 mM 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer, pH 7.9)를 이용하여 1/100 희석하여 사용하였다. 구형 나노다공성 실리카에 고정화된 효소(enzyme)의 경우에는 실시간으로 측정이 불가능하므로 2 mL의 BAPNA 용액에 상기 복합체를 넣어 200 rpm으로 반응시킨 후, 시간별로 0.1 mL씩 샘플을 취하여 측정하는 방법을 사용하였다. 다음으로, 100 mM 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer, pH 7.9)를 이용하여 1/10로 희석한 후 생성물의 농도를 410 nm에서 분광광도계(spectrophotometer)로 흡광도를 측정하였다. 효소의 안정성 측정은 시간에 따라 상기와 같은 방법으로 활성을 측정하는 방법, 같은 샘플을 재사용하여 활성을 측정하여 초기 활성과 비교하는 방법의 두 가지 방법을 통하여 측정하였다.
도 4에 도시된 바와 같이, 본 발명의 실시예 5 및 6에 따라 제조된 복합체가 비교예 4 내지 6의 복합체에 비하여 활성이 우수한 것을 확인하였으며, 특히 0.1% 글루타릭 디알데히드를 사용한 실시예 6의 복합체가 다른 실시예에 비하여 가장 우수한 활성을 나타낸 것을 확인하였다.
또한, 실시예 5 및 6의 복합체는 비교예 4 및 6의 복합체에 비하여 120일까지 우수한 안정성을 보이는 것을 확인하였다. 이러한 특성은 실시예 6이 가장 우수하였다.
상기 도 4b에서 free TR은 유리된 효소, 예컨대 고정화 과정 없이 용매에 용해된 효소 그 자체이다. 교반조건에서 안정성을 확인하게 되면 빠르게 활성이 저하된다.
< 당산화효소>
실시예 7. 당산화효소, 0.001% 글루타릭 디알데히드
상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 상기 탄산무수화효소 대신 당산화효소를 사용하여 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체를 제조하였다.
실시예 8. 당산화효소, 0.01% 글루타릭 디알데히드
상기 실시예 7과 동일하게 실시하되, 상기 0.001% 글루타릭 디알데히드 대신 0.01% 글루타릭 디알데히드를 사용하여 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체를 제조하였다.
실시예 9. 당산화효소, 0.1% 글루타릭 디알데히드
상기 실시예 7과 동일하게 실시하되, 상기 0.001% 글루타릭 디알데히드 대신 0.1% 글루타릭 디알데히드를 사용하여 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체를 제조하였다.
비교예 7. 키토산 및 글루타릭 디알데히드 사용 안함
상기 비교예 1과 동일하게 실시하되, 상기 탄산무수화효소 용액 대신 당산화효소 용액을 사용하여 복합체를 제조하였다.
비교예 8. 키토산 사용 안함
상기 비교예 2와 동일하게 실시하되, 상기 탄산무수화효소 용액 대신 당산화효소 용액을 사용하여 복합체를 제조하였다.
비교예 9. 글루타릭 디알데히드 사용 안함
상기 비교예 3과 동일하게 실시하되, 상기 탄산무수화효소 용액 대신 당산화효소 용액을 사용하여 복합체를 제조하였다.
시험예 4. 고정화된 당산화효소의 활성 및 안정성 측정
도 5a는 실시예 7 내지 9 및 비교예 7 내지 9에 따라 제조된 복합체의 고정화된 당산화효소의 초기활성을 나타낸 그래프이며, 도 5b는 실시예 7 내지 9 및 비교예 7 내지 9에 따라 제조된 복합체의 고정화된 당산화효소의 안정성을 나타낸 그래프이다.
당산화효소 활성의 측정은 수용액 버퍼 내에서의 당산화효소의 반응 기질인 글루코스(glucose)의 반응을 통해 측정하였다. 먼저 0.96 mg 3,3,5,5-tetramethylbenzidine (TMB)를 1 mL의 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹인 후 19 mL의 100 mM 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer, PB, pH 7.0)로 희석시켜 TMB 용액을 제조하였다. 상기 제조된 TMB 용액 12 mL에 2.5 mL의 글루코스 용액(110.3 w/v% in PB)을 섞어 반응 기질 용액을 만들었다. Peroxidase (POD)는 PB에 녹여 3.79 mg/mL이 되도록 제조하였다. 상기와 같이 제조된 두 가지 용액을 가지고 효소의 활성을 측정하였다. 효소의 활성을 측정하기 위해 890 uL 반응 기질 용액, 10 uL POD 용액, 그리고 100 uL의 당산화효소가 고정화된 용액을 섞어 655 nm에서 분광광도계(spectrophotometer)에서 흡광도를 측정하였다. 효소의 안정성 측정은 시간에 따라 상기와 같은 방법으로 활성을 측정하는 방법, 같은 샘플을 재사용하여 활성을 측정하여 초기 활성과 비교하는 방법의 두 가지 방법을 통하여 측정하였다.
도 5에 도시된 바와 같이, 본 발명의 실시예 8 및 9에 따라 제조된 복합체는 비교예 7 내지 9의 복합체에 비하여 활성이 우수한 것을 확인하였으며, 특히 0.1% 글루타릭 디알데히드를 사용한 실시예 9의 복합체가 다른 실시예에 비하여 가장 우수한 활성을 나타낸 것을 확인하였다.
또한, 실시예 8 및 9의 복합체는 비교예 1 및 3의 복합체에 비하여 120일까지 우수한 안정성을 보이는 것을 확인하였다. 이러한 특성은 실시예 9가 가장 우수하였다.
< 알코올탈수소효소>
실시예 10. 알코올탈수소효소, 0.01% 글루타릭 디알데히드
상기 실시예 2와 동일하게 실시하되, 상기 탄산무수화효소 대신 알코올탈수소효소를 사용하여 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체를 제조하였다.
실시예 11. 알코올탈수소효소, 0.05% 글루타릭 디알데히드
상기 실시예 10과 동일하게 실시하되, 상기 0.01% 글루타릭 디알데히드 대신 0.05% 글루타릭 디알데히드를 사용하여 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체를 제조하였다.
실시예 12. 알코올탈수소효소, 0.1% 글루타릭 디알데히드
상기 실시예 10과 동일하게 실시하되, 상기 0.01% 글루타릭 디알데히드 대신 0.1% 글루타릭 디알데히드를 사용하여 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체를 제조하였다.
비교예 10. 키토산 및 글루타릭 디알데히드 사용 안함
상기 비교예 1과 동일하게 실시하되, 상기 탄산무수화효소 용액 대신 알코올탈수소효소 용액을 사용하여 복합체를 제조하였다.
비교예 11. 키토산 사용 안함
상기 비교예 2와 동일하게 실시하되, 상기 탄산무수화효소 용액 대신 알코올탈수소효소 용액을 사용하여 복합체를 제조하였다.
비교예 12. 글루타릭 디알데히드 사용 안함
상기 비교예 3과 동일하게 실시하되, 상기 탄산무수화효소 용액 대신 알코올탈수소효소 용액을 사용하여 복합체를 제조하였다.
시험예 5. 고정화된 알코올탈수소효소의 활성 및 안정성 측정
도 6a는 실시예 10 내지 12 및 비교예 10 내지 12에 따라 제조된 복합체의 고정화된 알코올탈수소효소의 초기활성을 나타낸 그래프이며, 도 6b는 실시예 10 내지 12 및 비교예 10 내지 12에 따라 제조된 복합체의 고정화된 알코올탈수소효소의 안정성을 나타낸 그래프이다.
알코올탈수소효소 활성의 측정은 수용액 버퍼 내에서의 알코올탈수소효소의 반응 기질인 에탄올의 반응을 통해 측정하였다. 먼저 10 mg β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD+)를 1 mL의 증류수에 녹인다. 그 후 99.8% 에탄올 0.2 mL, NAD+수용액 0.8 mL 100 mM과 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer, PB, pH 7.6) 1.6 mL을 섞어 반응 기질 용액을 만든다. 구형 나노다공성 실리카에 고정화된 효소(enzyme)의 경우에는 실시간으로 측정이 불가능하므로 2 mL의 반응 기질 용액에 상기 복합체를 넣어 200 rpm으로 반응시킨 후, 시간별로 0.1 mL씩 샘플을 취하여 측정하는 방법을 사용하였다. 다음으로, 100 mM 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer, pH 7.6)을 이용해 1/10로 희석한 후 생성물의 농도를 340 nm에서 분광광도계(spectrophotometer)로 흡광도를 측정하였다. 효소의 안정성 측정은 시간에 따라 상기와 같은 방법으로 활성을 측정하는 방법, 같은 샘플을 재사용하여 활성을 측정하여 초기 활성과 비교하는 방법의 두 가지 방법을 통하여 측정하였다.
도 6에 도시된 바와 같이, 본 발명의 실시예 10 내지 12에 따라 제조된 복합체는 비교예 10 내지 12의 복합체에 비하여 활성이 우수한 것을 확인하였으며, 특히 0.01% 글루타릭 디알데히드를 사용한 실시예 10의 복합체가 다른 실시예에 비하여 가장 우수한 활성을 나타낸 것을 확인하였다.
또한, 실시예 11 및 12의 복합체는 비교예 10 및 12의 복합체에 비하여 50일까지 우수한 안정성을 보이는 것을 확인하였다. 이러한 특성은 실시예 12가 가장 우수하였다.
비교예 11은 상기 비교예 2, 5 및 8과 달리 효소간의 가교결합에 의하여 효소의 구조적 변성이 발생하여 활성을 확인할 수 없었다. 알코올탈수소효소의 경우에는 활성부위 내부에 반응에 참여하는 아미노기가 존재하기 때문에 가교제에 의해 쉽게 활성을 잃을 수 있다.
< 포름산탈수소효소>
실시예 13. 포름산탈수소효소, 0.001% 글루타릭 디알데히드
상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 상기 탄산무수화효소 대신 포름산탈수소효소를 사용하여 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체를 제조하였다.
실시예 14. 포름산탈수소효소, 0.005% 글루타릭 디알데히드
상기 실시예 13과 동일하게 실시하되, 상기 0.001% 글루타릭 디알데히드 대신 0.005% 글루타릭 디알데히드를 사용하여 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체를 제조하였다.
실시예 15. 포름산탈수소효소 , 0.01% 글루타릭 디알데히드
상기 실시예 10과 동일하게 실시하되, 상기 0.001% 글루타릭 디알데히드 대신 0.01% 글루타릭 디알데히드를 사용하여 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체를 제조하였다.
실시예 16. 포름산탈수소효소 , 0.02% 글루타릭 디알데히드
상기 실시예 10과 동일하게 실시하되, 상기 0.001% 글루타릭 디알데히드 대신 0.02% 글루타릭 디알데히드를 사용하여 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체를 제조하였다.
비교예 13. 키토산 및 글루타릭 디알데히드 사용 안함
상기 비교예 1과 동일하게 실시하되, 상기 탄산무수화효소 용액 대신 포름산탈수소효소 용액을 사용하여 복합체를 제조하였다.
비교예 14. 글루타릭 디알데히드 사용 안함
상기 비교예 3과 동일하게 실시하되, 상기 탄산무수화효소 용액 대신 포름산탈수소효소 용액을 사용하여 복합체를 제조하였다.
시험예 6. 고정화된 포름산탈수소효소의 활성 및 안정성 측정
도 7a는 실시예 13 내지 16 및 비교예 13 및 14에 따라 제조된 복합체의 고정화된 포름산탈수소효소의 초기활성을 나타낸 그래프이며, 도 7b는 실시예 13 내지 16 및 비교예 13 및 14에 따라 제조된 복합체의 고정화된 포름산탈수소효소의 안정성을 나타낸 그래프이다.
포름산탈수소효소 활성의 측정은 수용액 버퍼 내에서의 포름산탈수소효소의 반응 기질인 포름산의 반응을 통해 측정하였다. 먼저 51.0 mg sodium formate (SF)와 1.5 mg β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD+)를 각각 1 mL의 증류수에 녹인다. 그 후 SF 수용액과 NAD+ 수용액 각각 0.2 mL과 100 mM 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer, PB, pH 7.6) 1.6 mL을 섞어 반응 기질 용액을 만든다. 구형 나노다공성 실리카에 고정화된 효소(enzyme)의 경우에는 실시간으로 측정이 불가능하므로 2 mL의 반응 기질 용액에 상기 복합체를 넣어 200 rpm으로 반응시킨 후, 시간별로 0.1 mL씩 샘플을 취하여 측정하는 방법을 사용하였다. 그 후, 100 mM 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer, pH 7.6)을 이용해 1/10로 희석한 후 생성물의 농도를 340 nm에서 분광광도계(spectrophotometer)로 흡광도를 측정하였다. 효소의 안정성 측정은 시간에 따라 상기와 같은 방법으로 활성을 측정하는 방법, 같은 샘플을 재사용하여 활성을 측정하여 초기 활성과 비교하는 방법의 두 가지 방법을 통하여 측정하였다.
도 7에 도시된 바와 같이, 본 발명의 실시예 13 내지 16에 따라 제조된 복합체는 비교예 13 및 14의 복합체에 비하여 활성이 우수한 것을 확인하였으며, 특히 0.01% 글루타릭 디알데히드를 사용한 실시예 15의 복합체가 다른 실시예에 비하여 가장 우수한 활성을 나타낸 것을 확인하였다.
또한, 실시예 13 내지 16의 복합체는 비교예 13 및 14의 복합체에 비하여 25일까지 우수한 안정성을 보이는 것을 확인하였다.
< 포름알데하이드탈수소효소>
실시예 17. 포름알데하이드탈수소효소, 0.01% 글루타릭 디알데히드
상기 실시예 2와 동일하게 실시하되, 상기 탄산무수화효소 대신 포름알데하이드탈수소효소를 사용하여 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체를 제조하였다.
비교예 15. 키토산 및 글루타릭 디알데히드 사용 안함
상기 비교예 1과 동일하게 실시하되, 상기 탄산무수화효소 용액 대신 포름알데하이드탈수소효소 용액을 사용하여 복합체를 제조하였다.
비교예 16. 키토산 사용 안함
상기 비교예 2와 동일하게 실시하되, 상기 탄산무수화효소 용액 대신 포름알데하이드탈수소효소 용액을 사용하여 복합체를 제조하였다.
비교예 17. 글루타릭 디알데히드 사용 안함
상기 비교예 3과 동일하게 실시하되, 상기 탄산무수화효소 용액 대신 포름알데하이드탈수소효소 용액을 사용하여 복합체를 제조하였다.
시험예 7. 고정화된 포름알데하이드탈수소효소의 활성 및 안정성 측정
도 8a는 실시예 17 및 비교예 15 내지 17에 따라 제조된 복합체의 고정화된 포름알데하이드탈수소효소의 초기활성을 나타낸 그래프이며, 도 8b는 실시예 17 및 비교예 15 내지 17에 따라 제조된 복합체의 고정화된 포름알데하이드탈수소효소의 안정성을 나타낸 그래프이다.
포름알데하이드탈수소효소 활성의 측정은 수용액 버퍼 내에서의 포름알데하이드탈수소효소의 반응 기질인 포름알데하이드의 반응을 통해 측정하였다. 먼저 0.057 mL 포름알데하이드와 1.5 mg β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD+)를 각각 1 mL의 증류수에 녹인다. 그 후 포름알데하이드 수용액과 NAD+ 수용액 각각 0.2 mL과 100 mM 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer, PB, pH 7.6) 1.6 mL을 섞어 반응 기질 용액을 만든다. 구형 나노다공성 실리카에 고정화된 효소(enzyme)의 경우에는 실시간으로 측정이 불가능하므로 2 mL의 반응 기질 용액에 상기 복합체를 넣어 200 rpm으로 반응시킨 후, 시간별로 0.1 mL씩 샘플을 취하여 측정하는 방법을 사용하였다. 그 후, 100 mM 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer, pH 7.6)을 이용해 1/10로 희석한 후 생성물의 농도를 340 nm에서 분광광도계(spectrophotometer)로 흡광도를 측정하였다. 효소의 안정성 측정은 시간에 따라 상기와 같은 방법으로 활성을 측정하는 방법, 같은 샘플을 재사용하여 활성을 측정하여 초기 활성과 비교하는 방법의 두 가지 방법을 통하여 측정하였다.
도 8에 도시된 바와 같이, 본 발명의 실시예 17에 따라 제조된 복합체는 비교예 15 내지 17의 복합체에 비하여 활성이 우수한 것을 확인하였다.
비교예 16은 효소간의 가교결합에 의하여 효소의 구조적 변성이 발생하였다.
또한, 실시예 17의 복합체는 비교예 15 내지 17의 복합체에 비하여 50일까지 우수한 안정성을 보이는 것을 확인하였다.

Claims (12)

  1. (A) 다공성 담체의 기공 내부에 효소를 흡착시키는 단계;
    (B) 상기 효소가 흡착된 다공성 담체의 외부 표면에 키토산을 흡착시키는 단계; 및
    (C) 상기 키토산과 가교제를 반응시켜 상기 키토산의 아민기 간의 가교결합을 수행하는 단계;
    를 차례로 수행하는 것을 특징으로 하는 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 가교제는 글루타릭 디알데히드, 디이소시아네이트, 디안히드라이드, 디에폭사이드, 디알데하이드, 디이미드, 비스(이미도 에스테르), 비스(석신이미딜 에스테르) 및 디애시드 클로라이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 가교제는 0.0001 내지 10.0% (w/w) 글루타릭 디알데히드 용액인 것을 특징으로 하는 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 가교제는 0.001 내지 1.0% (w/w) 글루타릭 디알데히드 용액인 것을 특징으로 하는 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 키토산의 농도가 0.01 내지 10.0 mg/mL인 것을 특징으로 하는 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 키토산의 농도가 0.1 내지 1.0 mg/mL인 것을 특징으로 하는 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 효소는 탄산무수화효소, 트립신, 당산화효소, 알코올탈수소효소, 포름산탈수소효소 및 포름알데하이드탈수소효소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 다공성 담체의 기공 내부에 코펙터(cofactor)가 추가로 흡착되는 것을 특징으로 하는 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 코펙터는 수소전이 조효소 및 기전이 조효소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체의 제조방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 다공성 담체는 다공성 실리카담체, 다공성 탄소담체 및 고분자 담체로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체의 제조방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중에서 선택된 어느 한 항의 제조방법에 따라 제조된 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체.
  12. 제11항에 있어서, 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체는 바이오전환 소재, 바이오정화 소재, 오염방지(Antifouling)용 도료, 세제용 생촉매 소재, 효소기반 컬럼, 이산화탄소 전환용 패킹 소재, 바이오센서 또는 바이오연료전지에 사용하기 위한 것인 키토산이 코팅된 효소-다공성물질 복합체.
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