JPS5950317B2 - 加圧酵素結合膜 - Google Patents

加圧酵素結合膜

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は昭和５０年１１月７日出願の米国特許願第６２
９９４０号に包含されているよりも相当に範囲の広いマ
トリックス膜、結合（ｃｏｕｐｌ ｉｎｇ）反応および
酵素を包含するものである。
本発明は、酵素および類似の接触作用を有するその他の
分子が化学的な結合によって結合されている広〜・範囲
の膜フィルターの製造に関するものであり、本発明にお
いてその次の結合（必−要ならば）のためにこれらの膜
の孔表面の活性化方法が加圧（ｐｒｅ−ｓｓｕｒｅｄｒ
１ｖｅｎ ）条件下で実施され、また結合された酵素
系は同様な加圧条件下、すなわち処理されるべき基質を
加圧下に膜に通すことによって使用される。
固定された酵素の通常の使途については科学文献、工業
技術文献および特許文献から周知である。
従って、この一般的な技術の利点は周知である。
これまで用いられてきた通常の技術は天然もしくは合成
重合体あるいは無機多孔性材料の小粒子を使用すること
であった。
酵素は化学的結合によりまたはこれらの酵素の存在下で
の不溶性ゲルの生成法によりあるいは酵素を小さいビー
ズもしくは多孔性の中空繊維内に包接することにより結
合されている。
これら常法はいずれもがそれぞれ利点および不利な点を
有している。
本発明の加圧酵素結合膜の目的は当該膜の新規な製法な
らびにこのようにして製造された膜およびか〜る膜の種
々な適用例に対する用途にある。
これらの膜の主たる用途は化学反応を実施するための触
媒としての用途に存する。
本文記載の形態で系は含有される酵素の量で示される高
い能力および高い酵素活性を示１−１これによってこれ
らの系は大規模な工業的方法に特に有用なものとなる。
このように安定化された酵素は先に述べた利点に加えて
それらの化学的、熱安定性によって安定化された酵素の
通例の本質的な利点を有している。
本発明によれば、高い活量および長期にわたる安定性を
有し、大規模な工業的用途に特に適合した種類の酵素反
応剤が次のようにして製造し得ることが見い出された。
まず、適切な均一多孔性のマトリックス膜を製造する。
これらのマトリックス膜はホモポリマー、共重合体また
はインターポリマー混合物から製造することができる。
ホモポリマーから製造した場合、これらの膜は適度な化
学的、機械的安定性を有していなければならず、その結
果からの多孔度（孔の容積分率）、孔直径または寸法に
顕著な変化を受けることなく溶媒（通常は水）の存在下
に何ケ月間も使用することができる。
従って、使用するホモポリマーは不溶性でなければなら
ない。
これらのポリマーは例えば水のような溶媒中で限られた
程度であるが膨潤することができる。
本発明の目的のために有用なホモポリマーの数には制限
がある。
セルロースは一つのホモポリマーであり、またポリビニ
ルベンジルクロライドが他の一つのホモポリマーである
。
これらの種類の膜を製造する常法は、適切な溶媒からフ
ィルムとして流延し、次に溶媒の一部な蒸発させてゲル
様フィルムを形成させた後、系を凝固させてフィルムの
容量の少くとも５０％を適切な分子ディメンションの孔
として含有するフィルムを生成せしめることにある。
これらの種類の膜を製造するのに使用し得る技術は多数
存在するが、好適な操作法は溶媒を十分に蒸発せしめて
ゲル様構造となし次に蒸気相を経て重合体を沈澱もしく
は凝固させる作用をもつ第二の溶媒を導入することにあ
る。
蒸気相での第二の溶媒を導入するのは凝固の速度および
程度を調節し例えば望ましい性質をもつ高度に均一多孔
性の膜を生成する助けをなす。
このようにして製造し得るフィルムの例には、ジメチル
スルホキサイドとパラホルムアルデヒドの混合物に溶解
したセルロースを原料とし、Ｄ、Ｃ，ジコンソン（Ｄ、
Ｃ，Ｊｏｈｎｓｏｎ）等の方式％式％ （ ５ｃｏｎｓｉｎ））に従って製造されたフィルムが包含
される。
この場合マトリックスポリマー沈澱は水またはメタノー
ル蒸気によって行われ、望ましい特性をもつフィルムが
セルロースの再生と共に生成される。
あるいはまた、ビニルベンジルクロライドのホモポリマ
ーもしくはコポリマーを使用することができ、この場合
ポリビニルベンジルクロライドまたはビニルベンジルク
ロライドとスチレンとのコポリマーが使用される。
これらの重合体は適当な溶媒例えばメチレンクロライド
に溶解し、これからフィルムを流延し次にメタノールを
使用する蒸気相での凝固を行うことにより所望の特性を
有する膜が生成される。
マトリックス膜を製造するための代替的でかつ通常好ま
し〜・方法は、米国特許第３８０８３０５号にＨ，Ｐ、
ブレボア（Ｈ、Ｐ 、 Ｇｒｅｇｏｒ ）によって定め
られている一般操作法を使用することであり、この方法
では膜をインターポリマー混合物から流延する。
典型的な例では、ポリアクリル酸２部をフィルム形成性
マトリックスポリマー例えばポリフッ化ビニリデン〔キ
ナル（Ｋｙｎａｒ ）、ペンヴアルト・カンパ＝ −（
Ｐｅｎｎｗａｌｔ Ｃｏ、） ’：） １部と共に米国
特許第３８０８３０５号に記載されているような適当な
エポキサイド交さ結合剤と併せて適当な溶媒例えばジメ
チルホルムアミドに溶解し、それから常法で流延する。
適当な多孔度の膜とするために、流延された膜を部分的
に乾燥し、次に部分的凝固させるが膜の構造上の本質を
損わない蒸気相を導入することにより凝固させる。
この場合の適当な溶媒は水または電解性重合体をイオン
性となすその他の物質例えばアンモニアまたはトリエチ
ルアミンであり、次にフィルムを最終乾燥および交さ結
合による硬化させて適切なディメンジョンの孔を有しか
つ結合反応が起り得るカルボキシル基を高濃度で含有す
る膜とする。
同じく、例えばポリビニルイミダゾールもしくはポリ−
Ｎ−メチルエチレンイミンのようなアミンを本処方物に
使用し得る。
ポリスチレンスルホン酸を包含する重合体混合物は膜内
で高い極性をもつ陰電荷を付与し、結合し得る基例えば
ポリアクリル酸と一緒に使用し得る。
従って、マトリックスポリマーおよび結合が起り得る重
合体をうまく選択することにより広範囲の適当なマトリ
ックス膜を製造し得ることが明らかとなった。
それで、広い範囲の親水性および疎水性を有する一層の
マトリックスポリマーを製造し得ることが明らかであり
、この範囲は強い親水性をもつ重合体としてポリスチレ
ンスルホン酸を包含するポリマーから高度の疎水性をも
つ重合体としてポリビニルベンジルクロライドを含有す
るポリマーにまで及ぶものである。
同じように、広汎な結合のための化学的手段が利用可能
である。
場合によっては、セルロースを臭化シアンによって処理
するかまたはポリビニルアルコール含有膜を塩化シアヌ
ルによって処理するかのような活性化が必要である。
これらの操作はいずれも当業者間に周知であり、文献特
にＯｌＲ，ザボルスキイ（０，Ｒ，Ｚａｂｏｒｓｋｙ）
の著書〔「イモビライズド・エンザイムズＪ （Ｉｍ
ｍｏ−ｂｉｌｉｚｅｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ）、Ｃ０Ｒ，Ｃ
，プレス・クリ−グランド（Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ）、オ
ハイオ（Ｏｈｉｏ）１９７４年〕に記載されている。
これらの活性化反応または次の結合反応のための新規な
化学反応を開示するのは本発明の目的とするところでは
なくて、本文に記載の通り材料と操作法との特異な組合
せを強調するところに本発明の目的があり、すなわち加
圧条件下に適当な膜マトリックスで結合および活性化操
作を実施し得るところにあるものである。
結合される酵素分子のサイズおよび膜孔のサイズは本発
明の重要な考慮すべき事項である。
酵素分子のサイズは数多くの技術によって測定すること
ができる。
しかし、拡散速度を基にするその計算は一つである。
膜孔のサイズは通常膜孔を通るサイズの異った分子の拡
散もしくは涙過の相対速度を測定し、次に流体力学方程
式を用いて有効孔直径を算出することによって求めるこ
とができる。
カワベ（Ｋａｗａｂｅ ）等によって報告される操作法
〔ジャーナル・コロイダル・インタフェイス・サイエン
ス（Ｊ、 Ｃｏ１１ｏｉｄａｌ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ
Ｓｃｉ、）第２１巻、第７９頁、１９６６年〕がこの目
的に有用である。
本発明者は、円筒形孔モデルよりもむしろ平行のプレー
トを使用する計算法が本発明の目的に対して一層有効で
あることを見〜・出した。
例えば、結合される酵素の直径が膜孔の直径の弄である
場合でまた蛋白質の応力変性をきたすほど高い加圧を使
用する場合、多少の部分（孔全表面の少くとも３０係）
が酵素で占められることを本発明者は見い出した。
従って、簡単な機械的モデルがこれらの予備操作の指針
として十分であることが見い出された。
孔壁が酵素浴、液で膜の一方の側から他の側に圧力する
ことによって酵素で内張すされていると、孔入口は、孔
直径が酵素分子それ自体の直径の少くとも３倍ないと、
ふさがれてしまう。
この原則の適用は厳格でなくてよい。その理由は酵素分
子が変形可能だからである。
この理由から、孔は結合される酵素分子の直径の少くと
も２倍、好ましくは約３−５倍の大きさでなければなら
ない。
その他のサイズについて考慮すべき事項は基質分子のサ
イズに起因する事項である。
例えば、大型の基質分子例えば蛋白質な膜孔に結合して
いるプロテアーゼで消化するとき、孔を通過せしめられ
る間に結合された酵素のせん断変性を大型の酵素が生じ
させないことが肝要である。
加圧酵素結合膜の着想を適切に使用するためには、マト
リックス膜が一定の特性を有していることが肝要である
。
まず、膜孔が、その中に適合されるべき酵素のサイズの
少くとも２倍、好適には酵素分子の直径の３−１０倍、
但しこれらの直径の２０倍未満であって膜が結合のため
の大きな内表面を有し得るような分子ディメンジョンを
有していなければならない。
μの寸法の巨大孔を有する膜は本願発明の目的に対して
有用ではない。
その理由はそれらの膜の内部孔表面が相当に小さくなる
からである。
マトリックス膜はそれにか匁る圧力変化度に対してこわ
れることなく抵抗性を有していなければならない。
この系にか〜る比較的低い圧力差、すなわち平均して０
．６８−１０．２１気圧−ゲージ（１０−１５０ｐｓｉ
ｇ ）であっても、極めて歌いゲル様構造がこわれ、こ
の方法の利点が失われる。
膜が支持されてなくても圧に抵抗性を有することは必要
ではない。
その理由は利用し得る膜技術によれば薄くかつこわれや
すい膜を種種の支持材料で支持し得るからである。
しかし、膜孔が使用条件下でサイズケ実質的に一定に保
持することが重要な基準である。
補助要件としては、内部孔表面の実質的な部分が酵素分
子の結合のために利用可能であることにある。
水に対して浸透性を有しているが酵素分子に対して浸透
性を有していない極めて微細な孔を多数有することは望
ましくない。
これらの目的に使用し得るホモポリマーの数は限られて
いる。
例えば、ホモポリマーポリフッ化ビニリチン（キナル・
ペンヴアルト・カンパニー）そしてまたアクリロニトリ
ル−塩化ビニル共重合体〔ダイネル（Ｄｙｎｅｌ）、ユ
ニオンカーバイド（Ｕｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ））は
共に優れたフィルム形成体であり、所望の必要特性を数
多く有している。
しかしながら、これらの重合体は好都合な酵素結合を提
供する基をそれら自身では有してなく、その高度の化学
抵抗性のために活性化が難しい。
一方、硝酸セルロースは優秀なフィルム形成体であり、
この目的のために望ましい種類のマトリックス膜を形成
するのに伝統的に使用されているが、この重合体はそれ
自体用途に適した十分な化学安定性を有していない。
ホモポリマーセルロースは必須の化学安定性を有してお
り、酢酸セルロースからの再生によるかまたはジメチル
スルホキサイド−パラホルムアルデヒド溶媒系にセルロ
ースを溶解することにより直接に適切な特性をもつ膜に
形成することができる。
セルロースはまた酵素性の結合のための種々の異った試
薬によって活性化され、その種々の形態でこの目的のた
めに広く使用されてきた。
しかし、セルロースは化学安定性に制約がある。
更に１その性状のためにカルボヒドラーゼおよび類似の
酵素との反応または結合が限定下に可能であると考えら
れている。
それ故、セルロースはこれらの酵素を包括する酵素反応
剤のための好適なマトリックスポリマーであるとは言え
ない。
更に、セルロースそれ自体はセルラーゼによる分解を受
は易く、この理由によりある種の特定の適用例では望ま
しくない。
他方、インターポリマー系は酵素との化学結合をなし得
る第二の重合体と組合せたときに不溶性でかつ化学的に
抵抗性をもつフィルム形成性重合体の化学安定性を提供
する。
必要な場合、交さ結合剤を使用して必須の特性をもつ材
料を製造することもできる。
このインターポリマー技術はすでにブレボアにより非常
によく開発されている（米国特許第３８０８３０５号）
。
インターポリマー混合物の一部となり得る反応性重合体
には、セルロース、ポリビニルベンジルクロライドおよ
びその共重合体、ポリ−ｐ−アミノスチレンおよびその
重合体、メタクリル酸とメタクリル酸のフルオルアニリ
ド付加体との共重合体、ポリチオールスチレン、ポリア
クリル酸およびその重合体、無水マレイン酸のホモポリ
マーおよび共重合体、ポリ−Ｎ−ビニルイミダゾール、
ポリ−Ｎ−メチルエチレンイミンおよび線状ポリエチレ
ンイミンが包含される。
更に、インターポリマー混合物に膜孔内部での状態、所
謂結合酵素の微小状態を調節する作用をもつ重合体を使
用することもできる。
また、強酸性重合体、ポリスチレンスルホン酸、強塩基
性重合体ポリ−Ｎ−メチルイミダゾリウムクロライドを
例えば使用し得る。
弱塩基および弱酸重合体の使用は上述したところである
。
最後に、微小状態を一層疎水性にしようとするときは、
アシル置換ポリスチレンまたはその共重合体を添加する
とこれを達成する優秀な手段が提供され、ここでは炭化
水素鎖の長さは随意調節し得る。
不溶性重合体が酵素に結合するのは酵素のアミン基、カ
ルボキシル基、チロシン残基またはメルカプト基によっ
て生じる。
最も普通の結合手段は酵素のアミン基で達成され、この
ために臭化シアン、無水物、塩化シアヌルおよびゲルタ
ールアルデヒドカップリング操作法が周知である。
ジアゾニウムカップリング操作法はチロシン残基による
結合に使用され、そしてインシアン化物もしくはＵｇｉ
反応はカルボキシル基により結合する。
チオール基は酵素のメルカプト残基により結合する。
一方、ウッドワード試薬Ｋを用いて酵素のアミン基もし
くはカルボキシル基と結合させることができる。
また、マトリックスのカルボキシル基はカルボジイミド
で処理してアミノ基またはカルボキシル基により酵素と
結合させることができる。
これらの加圧酵素結合膜系の主要適用分野の一つは甘し
ょ糖およびビート糖工業、とうもろこし加工処理工業へ
の適用であり、そして加圧酵素結合形態での使用が特に
有利である。
この群のある種の酵素は通常Ｇ、マネツケ（Ｇ 、Ｍａ
ｎｅｃｋｅ ）が報告して〜・るように〔ピュア・アン
ド・アプライド・ケミストリー（Ｐｕｒｅ ＆ Ａｐｐ
ｌｉｅｄ Ｃｈｅ−ｍｉｓｔｒｙ）、第４巻、第５０７
頁、１９６２年〕メタクリル酸−３−フルオルアニリド
の共重合体（次にニトロ化する）の使用により結合に適
合するようＫされる。
この重合体はポリフッ化ビニリデン（キナル・ペンヴア
ルト・カンパニー）と一緒に溶媒混合物に溶解すること
ができ、次にフィルムを流延し、部分的に乾燥しそれか
ら凝固させて望ましＶ開孔の°フィルムを形成させる。
この膜はすでに活性化されていて、その結果次に酵素の
直接結合をこの場合酵素のアミン基により行う。
あるいは、メタクリル酸とメタクリル酸−３−フルオル
アニリドとの共重合体を製造し、同じマトリックスポリ
マーと組合せて適度な多孔度のフィルムを形成させ、次
にニトロ化し、フルオルアニリド基を活性化し次〜・で
結合させる。
この結合操作に特に受は入れられやすい酵素にはデキス
トラナーゼ、インベルターゼ、セルラーゼ、デキストラ
ンスクラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−アミラーゼ
およびグルコースオキシダーゼが包含される。
結合がジアゾニウム結合による加圧酵素結合系で使用す
るのに特に受は入れられやすい操作法ではキナルとポリ
アミノスチレンとのインターポリマー混合物を使用し得
る。
セルロースを含むインターポリマーフイルムはマトリッ
クスフィルムのセルロース部分と反応するために臭化シ
アンを使用することができ、次にｐ−フェニレンジアミ
ンまたはベンジジンで処理し、それからジアゾニウム塩
を形成させる処理をして直接結合を可能とする。
ジアゾニウムカップリングに対して特に受は入れられや
すい酵素にはインベルターゼ、α−アミラーゼ、β−ア
ミラーゼ、グルコースイソメラーゼ、アミログルコシダ
ーゼおよびβ−ガラクトシダーゼを包含する。
゛セルロースと四塩化チタンとの反応をインベルターゼ
、α−アミラーゼ、アミログルコシダーゼおよびグルコ
ースオキシダーゼを結合するのに使用し得る。
最後に、ポリアミンを含有するインターポリマー膜をゲ
ルタールアルデヒドで処理してβ−ガラクトシダーゼお
よびグルコースオキシダーゼを結合させることができる
。
従って、これらのカルボヒドラーゼおよび関連酵素の結
合を型接続いて行い、加圧酵素結合膜系な使用する場合
特に好都合である。
本発明の他の特に有用な実施態様は、数種の酵素が同一
の膜または一連の膜に結合されていて、交互に使用しで
特定の変換を行うことにある。
この場合、４種の酵素結合膜、すなわち一つはトリプシ
ン、二つ目はキモトリプシン、三つ目はアミノペブシダ
ーゼＭそして四つ目はブロリダーゼを用〜・てそれぞれ
調製した。
これらの膜はすべて臭化シアン活性化次いで結合によっ
て調製した。
この一連の膜を通してポリペプチドまたは蛋白質の溶液
を順次再循環させると、完全なアミノ酸加水分解が得ら
れた。
酵素が完全に固定され、相互に侵食することなくまた膜
から浸出しないために、汚染することなく完全な消化が
達成される。
この酵素による加水分解形態は分析の目的に特に有用で
ある。
その理由は、測定に先立って通常の酸加水分解により通
常完全にもしくは部分的破壊されるアミノ酸すなわちト
リプトファン、チロシン、セリン、アスパラギンおよび
グルタミンはこの操作では破壊されない。
次の実験において、これらの４種の酵素の混合物は同時
に結合され、そして尚また各酵素の希薄溶液が順次同一
の膜に結合される。
本発明の操作は、酵素を単離しかつ自己消化および相互
消化を阻害する働きをする固定されたマトリックスへの
迅速な結合を包含しているので、特に有用で簡便なポリ
ペプチドおよび蛋白質消化系が得られる。
この多種酵素系については数多くの適用例が利用可能で
ある。
例えば、アレルギーを起し、それで抗原性を有する多く
の物質が適用し得ることが確立された。
その理由はこれらの物質は痕跡量の異質蛋白で汚染され
ているからである。
例えば、ペニシリンおよび関連した抗生物質は当初の酵
素による生産方法から生じるかあるいはペニシリンが関
連化合物に変換されることから生じる小量の蛋白質を混
在していることが多い。
それでペニシリン溶液を処理して全痕跡量の蛋白質を除
去することがこの多種酵素反応剤によって行うことがで
きる。
同様に、小量の蛋白質を含有する種々のその他の物質す
なわち常法で除去するのが難しい物質てこの操作法によ
る処理を施しやすい。
また、アルギン酸塩の工業的製造に当って存在する痕跡
量の蛋白質を分解して蛋白抗原性を有していない化合物
を製造するのに使用することができる。
本発明の加圧酵素結合膜は製薬および醗酵工業での種々
の重要な工業上の工程にも有用である。
適用の一つの重要な分野にはこの種の結合された酵素を
使用して様々な合成、天然物から有用な誘導体を製造す
ることが包含される。
特定な例としテ、ペニシリンを６−アミノペニシラン酸
（６−ＡＭＰまたは６−ＡＰＡとも言われている）に変
換し得るアシラーゼ酵素を結合して〜・る膜を使用する
ことがあげられる。
この有用な誘導体は通常の醗酵法を用いての醗酵によっ
て得られるペニシリンから製造される。
加圧酵素結合反応剤はこの際重要である。
それはそれらの高い能力、反応性および安定性ならびに
得られる製品の高純度によるものである。
以下に掲げる実施例は実験室の研究から得られ、またパ
イロットプラントおよび完全なプラントの条件下で得ら
れる結果を表わすものである。
この方法は本質的には所定の基質を含む溶液を酵素が結
合されている膜に圧入することからなるので、同一の過
程が小規模の場合のとおり大規模な場合にも生じ得る。
従って、これらの過程のスケール・アップでは細管問題
が起らず、これが利点のもう一つである。
例として通常の醗酵では小規模の実験室培養タンクで得
られるパラメータから大規模な醗酵法でのパラメータの
予測は危険とされている。
本発明の対象と共に使用するために種々の機械的な構成
が利用し得る。
使用する装置は通常の限外濾過および可逆浸透法で普通
に使用されているものである。
これらの装置には、通常のプレート−フレーム装置、ら
せん巻きつけ装置、中空繊維装置、管装置および小管装
置が包含され、これらはすべで技術文献および特許文献
で周知である。
市場の培養タンクでの目的は最小限の費用で接触活性に
関して最大限の能力を得るところにあり、また酵素の費
用はその他の考慮すべき事項で左右されるので、装置の
残りの部分の費用を最小限とするのが明らかに有利であ
る。
本発明の目的である酵素結合加圧限外濾過膜は、特に安
価な酵素を取り扱うものでな〜・限り、膜の経費、結合
の経費および機械装置の経費が膜自体の経費よりも見積
りでは相当に低くなるような装置を製作し得るという点
で特異なものである。
この種の系において大きな膜面積、容量を比較的小型で
簡単な装置に組み入れることができるので、加圧系はそ
の他のすべての構成物にまさる多くの明白な利点を備え
ている。
結合された酵素を含む加圧限外ア過法の明白な難点がも
しあるとすれば、その一つに粒状物、懸濁された固形分
等を含み、しかもそれらの直径が孔開口部の直径よりも
大きい溶液を加工処理することができない点があげられ
る。
従って、これらの粗大なプロセス流を処理可能とする方
法を使用し得るようにする必要がある。
この目的に対しては、ブレボアの一定負荷限外ｐ過膜（
米国特許第３８０８３０５号）が理想的な前処理を提供
し、かへる目的のために使用されている。
本発明の開示事項でのその他の利点は反応剤の単位容量
当り高い触媒能力が得られる点である。
仕上り膜の乾燥重量の少くとも２０チで６０％の程度が
酵素自体の重量である膜が製造された。
この高い能力は膜の極めて大きい内部孔表面および結合
のための加圧法に由来するものである。
μサイズの孔を有する通常の微細孔フィルター媒体はこ
のような大ぎい能力を備えてなく、それ故にこれらを用
〜・て作った系は本発明の系に匹敵し得るものではない
。
次に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明する。
実施例は例示のためのものであって本発明を限定してい
るものと解すべきではないことは明らかである。
組成は他に明記しない限りすべて重量部である。
例Ｉ ＭＳＯ−パラホルムアルデヒド溶液中のキナルおよびセ
ルロースの１：１混合物から膜を製造し、空気中で２分
間で乾燥させ、おおいをしそして１時間溶媒蒸気で平衡
化させ、次に水蒸気で凝固させそして洗浄して厚さ２０
μ、水分含量９０係および１１．３ｃｎｆｆ面積に対し
て３．４０気圧−ゲージ（５０ｐｓｉｇ）の圧力で４．
５１／時の水浸透性を有した。
臭化シアンによる活性化（ｐＨ１１の水でＣＮＢ ｒ
４０ｍｇ ）は２５分間３．４０気圧−ゲージ（５０ｐ
ｓｉｇ）で行った。
膜は１分間ｐＨ７，５の０．１Ｍりん酸塩緩衝剤中で洗
い、次に同じ緩衝剤１００ｍ１中の酵素馬肝臓アルコー
ルデヒドロゲナーゼ５０ｍｇからなる溶液を３．４０気
圧−ゲージ（５０ｐｓｉｇ）で通した。
膜を４℃で２４時間この流出液中に貯蔵し、次いで水で
洗いそしてその蛋白質含量が膜の乾燥重量の１８係であ
ることがわかった。
この酵素の活性をワシントン・バイオケミカル・コーポ
レーション・マニュアル（Ｗｏ ｒ ｔｈ ｉ ｎｇ−
ｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ
ｏｎ Ｍａｎｕａｌ）〔フリーホルト（Ｆｒｅｅｈｏｌ
ｄ ）、ニュージャーシイ、１９７２年〕に記載の標準
操作法を用いて測定した。
この馬肝臓アルコールデヒドロゲナーゼの遊離溶液活性
を補酵素としてＮＡＤそして基質としてエタノールを用
いてりん酸塩緩衝剤中ｐＨ７，５で測定した。
この酵素の遊離溶液活性は０．３１単位／ｍｇであり、
また６、８０気圧−ゲージ（１００ｐｓｉｇ）の基質圧
で結合された酵素の活性は０．１９単位／ｍｇであった
。
例２ ジャック・ビーン（Ｊａｃｋ ｂｅａｎ） ウレアーゼ
（ワシントン、バイオケミカル）を例１で製造したキナ
ル−セルロース膜に３．４０気圧−ゲージ（５０ｐｓｉ
ｇ）の圧力下に臭化シアン活性化を用いて結合させた。
膜は平均孔直径３００オングストロームに相当する水浸
透性を有しでいた。
この酵素は４８３００００分子量を有し、そして痕跡量
の金属の存在に対して感受性を有し、それで実験は全て
０．００１ＭＥＤＴＡの存在下で実施した。
膜を活性化後１分間冷水で洗った後、ｐＨ７，０で０．
０２Ｍリン酸塩緩衝剤１００ｍ１中のウレアーゼ５０ｍ
ｇの溶液を１．７０気圧−ゲージ（２５ｐｓｉｇ）
で通した。
次に膜を結合反応からの流出液中に４℃で一夜保存し、
次に緩衝剤で十分に洗浄した。
その蛋白含量は乾燥膜の重量の５５％が蛋白質であるこ
とを示していた。
その活性は、尿素の分解の結果形成されるアンモニアに
ついてワシントン・バイオケミカル・コーポレーション
・カタログ（フリーホルト・二ニージャーシイ・１９７
２年）の操作に則って滴定することにより測定した。
この試験を用いると、結合状態のウレアーゼ活性は遊離
の酵素の活性の６０係であることがわかった。
例３ アルペルギルス・ニガー（Ａ、ｎｉｇｅｒ）からのグル
コースオキシダーゼ（ワシントン）を例１のセルロース
−キナル膜に結合させた。
臭化シアンで活性化しそして冷水で１分間洗浄した後、
蒸留水１００ｍ１中のグルコースオキシダーゼ４０ｍｇ
を４．７６気圧−ゲージ（７０ｐｓｉｇ）で通した。
次に、膜を４℃で２４時間この流出液に保存し、次に十
分に洗浄した。
その蛋白含量はロウリイ（Ｌｏ−ｗｒｙ）で測定して乾
燥膜の４．４ｍｇもしくは４２重量係であった。
その活性をワシントン操作法（但し、西洋わさびペルオ
キシダーゼの不存在下）により測定した。
このペルオキシダーゼの不存在は、形成される過酸化水
素が酵素を抑制しないが、使用する加圧条件下では除去
されることに因るものである。
それで、基質としてグルコースの標準１８チ溶液を用い
、また与圧ガスとして純粋な酸素を用いて酸素含量が速
度を制限しないようにして、ペルオキサイドの生成速度
を測定し、自然のままの酵素の速度の８０係であること
を知った。
例４ 本発明の別の変法では、加圧条件下に無水マレイン酸基
を含む膜にペニシリンアシラーゼを結合させた。
等モル量でのビニルメチルエーテルと無水マレイン酸と
の共重合体２部からフィルムを製造し、エポキサイド交
さ結合剤と共にヘキサメチレンホスホルアミドとＤＭＦ
との混合物に溶解したキナル（Ｋｙｎａｒ） １部を結
合させ、そしてこれらから流延された膜を部分的に乾燥
した。
６０℃の乾燥空気中で１０分間乾燥した後、膜にトルエ
ンの微細な霧をスプレーしてフィルムの部分凝固をさせ
、次いで最終の硬化をなす乾燥をして高度に多孔性のフ
ィルムを生成した。
ペニシリンアシラーゼの結合は、ｐＨ６の緩衝剤１００
ｍ１に１５単位／ｍｇの特異活性を有する該酵素１ｇを
溶解し、膜をこの緩衝剤で湿潤して膨潤せしめ次いで酵
素溶液を４℃で２時間２．７２気圧−ゲージ（４０ｐｓ
ｉｇ）で膜を通して再循環させることによつて達成され
た。
希薄な塩基を添加してｐＨを一定に保った。
少しの間で膜は十分に膨潤して酵素溶液が膜中を容易に
通り得るようになった。
膜は膨潤を続け、またその水浸透性も増大した。
最終の膜は３０％の蛋白含量を有し、その酵素活性は同
量の自然のままの酵素の活性の４５チであった。
ペニシリンＧから６−ＡＭＰを生産するためには、一定
ｐＨ７，８の水ｌｌ中の基質１００ｇを４．７６気圧−
ゲージ（７０ｐｓｉｇ）、３８℃で２時間膜を通過させ
た。
生成物の収率は理論値の８８％であることがわかった。
例５ エツシエリヒア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）から得られたペ
ニシリンアシラーゼを例１のセルロース−キナル膜に結
合させた。
この膜を４．７６気圧−ゲージ（７０ｐｓｉｇ）で臭化
シアン（塩基を添加してｐＨを一定して１１に保持して
１００ｍ１中４０ｍｇ）での処理によって活性化し、次
に膜を１分間洗浄し、ｐＨ５，５のりん酸塩緩衝剤中の
酵素溶液（溶液２００ｍ１中酵素５ｇを含む）で処理し
た。
この溶液を４．７６、気圧−ゲージ（７０ｐｓｉｇ）で
膜を通過せしめた後、室温で一夜培養し、洗浄した。
得られたフィルムは酵素蛋白としてその乾燥重量の３１
係を有していた。
この膜の典型的な適用例では、７−（２−チェニル）−
アセトアミドセファロスポラン酸ナトリウム塩１ｇを３
７℃、ｐＨ７，５で３．４０気圧−ゲージ（５０ｐｓｉ
ｇ）においてこの酵素結合膜で処理して１０分間の反応
後に９８チの収率で７−ＡＳＰを製造した。
この実験で膜の有効面積は１ｌｃｔｄ、結合酵素量は３
ｍｇまたその活性は本反応での自然のままの酵素の活性
の６０％であった。
例６ ポリメチルアクリル酸２部をポリフッ化ビニリデン（キ
ナル・ペンヴアルト）１部に対してエポキサイド（０，
１部）交さ結合剤と共にヘキサメチレンホスホルアミド
とＤＭＦの１０％溶液に溶解することによってカルボン
酸系の膜を製造した。
膜を流延し、６０℃で部分的に乾燥させ、そして水蒸気
で凝固させてその多孔度を増大させ、それから、６０℃
で乾燥完了後に、１２０℃で最終的に硬化させた。
水で湿潤すると、膜は８０％の水分含量および１８０オ
ングストロームの孔直径に相当する水浸透性を有した。
酵素結合膜を製造するだめに、２５係グルタルアルデヒ
ド水溶液５容量およびジアミノペンタン５容量を水５０
ｍＡに加え、全容量を１００ｍＡとなし、そしてｐＨを
６に調節した。
この溶液を２時間４．７６気圧−ゲージ（７０ｐｓｉｇ
）’室温で膜を通過せしめ、膜を純粋なｐＨ６緩衝剤で
洗浄し、次にＥ、コリ（Ｅ。
ｃｏｌｉ）から得られ、ｐＨ５の緩衝剤１１に溶解した
アシラーゼ製剤の０．５％溶液を室温、４．０８気圧−
ゲージ（６０ｐｓｉｇ）で３時間膜を通した。
水洗すると、膜の蛋白含量は乾燥膜の２０重量％に相当
することがわかった。
膜の活性は、２．０４気圧−ゲージ（３０ｐｓｉｇ）で
実施してｐＨ７，８，３７℃でベンジルペニシリンにの
５％溶液の２００μモル／分／乾燥膜ｇの変換率に相当
するものであり、また９５％を超える変換が得られた。
例７ キナル対セルロースの比を２：１として１８０オングス
トローム孔直径のフィルムを得る以外は例１のようにし
て膜を製造した。
臭化シアンで活・ 性化し、１分間水洗し〔いずれも４
゜７６気圧−ゲージ（７０ｐｓｉｇ）で実施した。
〕、次に膜を１０分間ｐＩ（８，０でｐ−フェニレンジ
アミンの溶液（１００ｍｌ中１００ｍｇ）で処理し次い
で一夜培養した〔いずれも室温で実施し、最後の処理は
暗所で実施した。
〕。次に水および１Ｍ塩化ナトリウムで洗った後、水で
再び洗い、膜を３０分間０℃で２Ｎ塩酸で処理してジア
ゾ化した。
１４チ亜硝酸ナトリウム５ｍｌをゆっくりと酸溶液に加
え、膜を１時間この溶液中に保持し、次に０℃で・ ０
．３％スルファミン酸で洗った。
次に、膜を１時間の再循環で０℃、２．０４気圧−ゲー
ジ（３０ｐｓｉｇ） で酵素グルコースイソメラーゼ
溶液（ｐＨ８，５の緩衝剤１００ｍ１中４０’ｍｇ）で
処理し、４℃で一夜培養した。
３．４０気圧−ゲージ（５０ｐｓｉｇ）で蒸留水で洗浄
した後、酵素結合膜を０．５塩化ナトリウム溶液で処理
した。
用時、膜に６０℃、ｐＨ８，０で２．０４気圧−ゲージ
（３０ｐｓｉｇ）においてグルコースの０．５Ｍ溶液を
適用してフルクトース含有流出液を製造した。
この酵素の原潜； 性は１５単位／ｍｇであり、結合酵
素の活性は１３単位／ｍｇであった。
酵素負荷は乾燥膜の１８重量％であった。
前文に説明したとおりの本発明の方法において、活性化
液および（または）酵素の膜の通過を促進させるのに任
意の超大気圧を使用し得るが、少くとも約０．６８気圧
−ゲージ（１０ｐｓｉｇ）、殊に約２．０４−８．１６
気圧−ゲージ（３０−１２０ｐｓｉｇ）の圧力によって
特に良好な結果が得られる。
酵素結合膜により作用を受ける溶液については、少くと
も約０．３４気圧−ゲージ（５ｐｓｉｇ）の圧力−ゲー
ジが望ましい。
空気圧もしくは水圧系の代りに、圧力もしくはポテンシ
ャルは電気的性状のものでもよく、すなわち、電気浸透
および（または）電気泳動での周知の現象のとおりであ
ってよぐ、この場合電位は膜もしくはフィルターにかげ
られ、そして活性化−結合および使用操作の組合せは当
該方法で行われる。
それで、例えばキモトリプシンを結合させ次いで臭化シ
アンで活性化する場合、４．７６気圧−ゲージ（７０ｐ
ｓｉｇ）の圧力変化度によるものと匹敵し得る膜を通る
溶液流れを生じるような電流によって４．７６気圧−ゲ
ージ（７０ｐｓ ｉｇ）下で製造したのとほぼ同程度の
酵素活性をもつ系が生成される。
本文中の説明および実施例は説明のためにあげたもので
あって限定をするものではなく、本発明の精神、範囲を
逸脱することなく種々の変化、変形をなし得ることは明
らかである。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 少くとも約０．６８気圧−ゲージ（１０ｐｓｉｇ
    ）に等しい圧力下に酵素溶液を活性化された多孔性限外
    濾過膜中な通過せしめ、而して活性化された部位は前記
    酵素と反応性を有し、それにより前記酵素を前記膜に結
    合させ、そして基質溶液を少くとも約０．３４気圧−ゲ
    ージ（５ｐｓｉｇ ）に等しい圧力下に前記膜中を通過
    せしめ、而して前記基質溶液は前記酵素によって変換さ
    れ得る物質を含有し、これによって前記酵素結合膜が前
    記物質の酵素による変換を行うことを特徴とする酵素反
    応を行う方法。 ２ 活性化された膜が少くとも約２．０４気圧−ゲージ
    （３０ｐｓｉｇ）に等しい圧力下に活性化剤を膜中に通
    過せしめることによって製造される前記第１項記載の方
    法。 ３ 前記膜が前記酵素の直径の約３−５倍の平均サイズ
    の孔を有する前記第１項記載の方法。 ４ 活性化された膜が約４．７６−８．１６気圧−ゲー
    ジ（７０−１２０ｐｓｉｇ ）に等しい圧力下に活性化
    剤を前記膜中に通過せしめることによって製造され、ま
    た酵素が約４．７６−８．１６気圧−ゲージ（７０−１
    ２０ｐｓｉｇ ）に等しい圧力下に前記膜中を通過せし
    められる前記第３項記載の方法。 ５ 前記酵素溶液が多数のプロテアーゼを含有し、前記
    物質に少くとも１種の蛋白質もしくはポリペプチドが混
    在し、これによって前記混在物が酵素によって変換され
    る前記第１項記載の方法。 ６ 前記酵素がアミラーゼであり、前記物質が可溶性デ
    ンプンであり、これによって前記デンプンが酵素により
    グルコースに変換される前記第１項記載の方法。 ７ 前記酵素がグルコースイソメラーゼであり、前記物
    質がグルコースであり、これによって前記グルコースが
    部分的に酵素によりフルクトースに変換される前記第１
    項記載の方法。 ８ グルコースの溶液が可溶性デンプンをアミラーゼ結
    合された膜中に通すことによって生成される前記第７項
    記載の方法。 ９ 前記酵素がペニシリンアシラーゼであり、前記物質
    がペニシリンであり、これによってペニシリンがペニシ
    ラン酸に変換される前記第１項記載の方法。
JP51131809A 1975-11-07 1976-11-04 加圧酵素結合膜 Expired JPS5950317B2 (ja)

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