JPS638749B2 - - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は固定化酵素配合体（immobilized
enzyme conjugate）に関する。 本質的に蛋白質であり及び通常水溶性である酵
素が多くの且つ様々な生活有機体内で起こる化合
反応を調節するのに役立つ生機触媒（bioca−
talysts）として作用することは公知である。酵
素は分離もでき、分析、医薬及び工業の用途に使
用されている。例えばそれはチーズ又はパンのよ
うな食品の製造において並びにアルコール性飲料
の製造において工業的に使用されている。酵素グ
ルコースイソメラーゼは、高フルクトースのコー
ンシロツプの製造においてグルコースをフルクト
ースへ転換するのに良く使用されている。 酵素は通常水溶性であり並びに一般に不安定で
あり、従つて不活性化を受けるから、それを利用
した溶液から再使用のために取り出すことが困難
であり、またそれは延長された期間に亘つてその
触媒活性を保持しえない。これらの難点は、酵素
をしばしば交換する必要性があるために、商業的
規模の運転で酵素を用いるとき費用の増大をもた
らす。酵素の交換による高い費用を減ずるため
に、酵素をその使用に先立つて固定化する又は不
溶化する種々の方法が工夫されてきた。この酵素
の固定化はその再使用を可能にし、さもなければ
酵素は使用した反応媒体中で不活性化を受け或い
は失なわれる。これらの固定化酵素系は生化学的
に反応させる物質の性質に依存して種々の反応器
系、例えば充填塔及び撹拌式タンク反応器で使用
することができる。 酵素の固定化を行なうためには、いくつかの一
般的な方法並びに多くのその改変法が報告されて
いる。 米国特許第3796634号には、ポリアミンをコロ
イド状の、寸法を統一した粒子の表面上に吸着さ
せ、このポリアミンを通常のアミンと反応する架
橋剤、例えばグルタルアルデヒドで架橋し、得ら
れる反応生成物をNaBH4で処理してアルデヒド
基を還えし且つこれによつてアルデヒド基及び酵
素のアミノ基間での共有結合を防止し、及びコロ
イド状吸着剤が酵素分子と反対の正の電荷を有
し、そのイオン結合が他の非共有結合力を助ける
ようなPHにおいて酵素を粒子の処理した表面上に
吸着させることを含む固定化法が開示されてい
る。この特許は吸着剤粒子を直径約50〜約20000
Å、好ましくは約100〜200Åの範囲のものとして
記述し、また吸着剤が活性炭、ヒドロキシアパタ
イト、アルミナＣガンマ、及びベントナイトであ
ることを述べている。この系は、酵素を処理した
粒子に結合させることを電荷の相互作用に依存し
ている。この種類の結合は、イオン的相互作用が
この種の結合に対する環境条件、例えばPH、イオ
ン強度及び温度に敏感であるが故に共有結合の形
成より望ましくない。 Liuらは、Biotechnol、Bioeng.17、1695〜
1696（1975）において、ラクターゼの粒状炭への
固定化法を開示している。この方法はＰ−アミノ
フエノール又は１−フエノール−２−アミノ−４
−スルホン酸の炭素への吸着を含む。これらの吸
着された化合物はグルタルアルデヒドが反応し、
順次酵素の結合するアミノ基を提供する。言及さ
れたアミノ基含有化合物はポリエチレンイミンの
ようなポリアミンと異なる化学的及び物理的性質
を有する単量体である。 他のグループ（Choら、Immobilization of
Enzymes on Activated Carbon：Properties of
Immobilized Glucoamylase、Glucose Oxidase
and Gluconolactonase、Biotechnol.Bioeng.20、
1651〜1665（1978））も、共有結合により酵素を粒
状炭に固定化した。この方法においては、粒状炭
をカルボジイミドで活性化し、次いで酵素でカル
ボジイミドを置換し、酵素−炭素複合体を形成さ
せる。 米国特許第4141857号（1979年２月27日付け）
は、無機の有孔性担体材料、例えば細孔直径約
100〜約55000Å及び表面積約100〜500m2／ｇを有
するγ−アルミナを、水溶性ポリアミンの溶液で
処理し、この処理した担体材料を２官能性単量体
物質、例えばグルタルアルデヒドの溶液と接続さ
せることを含む酵素の固定化法を開示している。
この処理により、酵素との反応で酵素とペンダン
トのアルデヒド基との間に共有結合を形成させる
のに適当な担体材料が得られる。この特許の実施
例には、有孔性のアルミナ球を続いてポリエチ
レンイミン、グルタルアルデヒド及びグルコアミ
ラーゼの溶液で処理することによる固定化酵素配
合体の製造法が記述されている。 粒状活性炭の使用は、その多くの魅力的な性質
及び理にかなつた価格にもかかわらず、固定化酵
素に対する担体として殆んど注目されなかつた。
粒状炭はシロツプ及び他の食品生成物、製薬学的
生成物、有機酸及び種々の他の化学品の、連続式
カラム透過法による精製に対して工業的に使用さ
れている。 本発明の固定化酵素配合体は、 (a) 有孔性の（porous）粒状活性炭を、ペンダ
ントのアミン基を有するポリアミン化合物の溶
液と接触させて、ポリアミンを表面への吸着及
び細孔内への捕捉の双方により活性炭に付着さ
せ； (b) 活性炭との接触から水及びそれに分散した付
着してないポリアミンを除去し、及びこれを多
官能性アルデヒドであるアミンと反応する物質
の水性分散液と接触させてこの反応性基の１つ
をペンダントのアミン基と反応させ且つ更なる
反応のために存在するアミンと反応する残基を
残し；及び (c) 活性炭との接触から水及びそれに分散した未
反応のアミンと反応する物質を除去し、そして
この活性炭を固定化すべき酵素の水溶液と接触
させて、酵素のアミン基を共有結合の形成によ
つて未反応のアミンと反応する残基と反応さ
せ、これによつて酵素を固定化する。 工程を含んでなる固定化酵素配合体の製造法によ
つて得られる。 本発明で用いるのに適当な粒状炭は、典型的に
は米国ふるい系において12〜40メツシユの粒径を
有するであろう。細孔の寸法は好ましくは直径
で、35Å〜1000Åであり、また粒状炭担体材料は
200〜600m2／ｇの表面積を有する。 本発明で用いるのに適当なポリアミンの例は、
ポリアミンがポリエチレンジアミン、ポリエチレ
ンイミン、ポリヘキサメチレン−ジアミン、ポリ
メチレンジシクロヘキシルアミン、ポリメチレン
ジアニリン、ポリテトラエチレンペンタミン、及
びポリフエニレンジアミンを含む。エピハロヒド
リン及びアルキレンポリアミンの共重合体も適当
であることがわかつた。 上記するポリアミンの構造式を例示する。なお
各構造式においてペンダントアミン基は＊印を付
した。 (a) ポリエチレンジアミン H2Ｎ＊［−CH2CH2NH］−oＨ (b) ポリエチレンイミン H2Ｎ＊［−CH− 2CH2］−o (c) ポリヘキサメチレン−ジアミン H2Ｎ＊［−（CH2）6−NH］−oＨ (d) ポリメチレンジシクロヘキシルアミン (e) ポリメチレンジアニリン (f) ポリテトラメチレンペンタミン (g) ポリフエニレンジアミン (h) ポリジエチレントリアミン (i) ポリトリエチレンテトラミン (j) ポリペンタエチレンヘキサミン (k) ポリヘキサメチレンジアミン H2Ｎ＊［−（CH2）6−NH］−oＨ (l) エピハロヒドリンとアルキレンポリアミンと
の共重合体 ポリアミンの分子量は厳密なように見えないけ
れど、500〜100000の分子量範囲の重合体は好適
である。水溶性のポリアミンはその水溶液から活
性炭に適用され、一方非水溶性の重合体は有機溶
媒、例えばメチルアルコール、エチルアルコー
ル、プロピルアルコール、イソプロピルアルコー
ル、ｔ−ブチルアルコール、アセトン、メチルエ
ーテル、エチルエーテル、プロピルエーテル、イ
ソプロピルエーテル、トルエン、ベンゼン、キシ
レン、ヘキサン、シクロペンタン及びシクロヘキ
サンから適用される。活性炭を、普通溶媒１に
対して重合体１〜100ｇの濃度であるポリアミン
溶液と接触させることにより、ポリアミンが活性
炭粒子の表面に付着するようになる。重合体の１
部は活性炭粒子の表面に吸着されるけれど、多く
の部分は巨大分子が細孔から突き出て、更なる反
応のための官能基（アミノ基）を残すように有孔
性担体の孔の中に付着するであろう。これは前述
した米国特許第3796634号に記述される方法、即
ち炭素粉末をポリエチレンイミンの溶液で処理し
てその表面電荷を変化させ、これによつて酵素を
担体に付着させるという方法と対比される。この
方法は本発明の方法で生成する共有結合よりも非
常に望ましくない電荷での相互作用に依存する。
処置した活性炭をポリアミン溶液との接触から例
えば過によつて除去し、好ましくは脱イオン
（DI）水で洗浄していずれかの付着してない重合
体を除去する。 次いで重合体で処理した活性炭を、多官能性の
アミンと反応する物質、例えばグルタルアルデヒ
ドのようなアミンと反応する試剤を約１〜100
ｇ／で含有する水溶液と接触させることによつ
て処理する。アルデヒドが遊離のアミソ基を誘導
化するのに十分な時間に亘つて反応を進行させた
後、処理した活性炭をアルデヒド溶液から除去
し、好ましくは脱イオン水で数回洗浄する。本明
細書に用いる如き、「誘導体化」とは活性炭に結
合した重合体分子のアミノ官能基及びアミンの反
応する試剤のアミンと反応する残基間の反応生成
物を生成することを意味する。 粒状炭の孔内に捕捉され且つ吸着された重合体
物質に結合しているアミンと反応する残基と反応
しうるアミノ基を含有する酵素はいずれでも本方
法で固定化することができる。これらの酵素は例
えばトリプシン、パパイン、ヘキソキナーゼ、フ
イシン、ブロメリン、乳酸デヒドロゲナーゼ、ラ
クターゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコアミ
ラーゼ、キモトリプシン、プロナーゼ、アシラー
ゼ、イソベルターゼ、アミラーゼ、グルコースオ
キシダーゼ、ペプシン、レニン及び菌プロテアー
ゼを含む。誘導化された活性炭を酵素の水溶液と
混合する。これはバツチ型又は塔型反応器中で行
なうことができる。活性炭を酵素溶液から除去
し、次いで水洗することにより、生機触媒転化反
応に用いるのに適当な活性炭固定化酵素を得る。 本発明の酵素固定化法の予期を越えた観点の１
つは、粒状炭がその処理したものが未処理のもの
より微粉炭を生成しないという意味において強靭
になつたということである。この性質は次の実験
で例示されるように不均一生機触媒を考える時に
非常に重要である： 粒状炭の５つの試料を、ポリエチレンイミン
（PEI）の濃度を０〜0.5％（水中Ｗ／Ｖ）で変え
て処理した。このPEI処理後に、活性炭試料を洗
浄し、次いで0.02Mホウ酸塩緩衝液中PH9.0にお
いて１％グルタルアルデヒド（GA）（Ｗ／Ｖ水）
で処理した。グルタルアルデヒド溶液中の試料を
回転振とう機に取りつけ４時間撹拌した。次いで
液体を活性炭から傾斜し、懸濁液中の活性炭微粉
末の程度を０〜５の相対尺度で評価した。ゼロ値
は活性体微粉末の観察されなかつたことを表わ
し、一方５の値は完全に不透明になる活性炭微粉
末の懸濁を表わす。次の表は撹拌中に生成する活
性炭微粉末の程度を要約する。 １％GA溶液中におけるPEIで処理した粒状炭の
温撹中に生ずる活性炭微粉末 PEI処理 懸濁微粉末 対照PEIなし ５ 0.015％ PEI ３ 0.05％ PEI ２ 0.15％ PEI １ 0.5％ PEI 0.5 粒状炭粒子上に見かけ上生成する保護コーテイ
ング又は層は、存在するPEIの量に依存すること
がわかる。本方法は酵素を活性炭粒子に固定する
ばかりでなく、活性炭粒子を強化してその崩解を
減少させる。 本固定化法の他の独特な特徴は、先に使用した
粒状炭が塩基−酸洗浄を含む簡単な方法での再生
後に固定化に使用できるということである。本方
法のこの性質はそれが使用者を廃棄の問題から解
放し且つ同様に潜在的な経済的節約を提供すると
いうことで重要である。この再生の可能性は、
PEI−GA法によつて固定化された酵素を有する
粒状炭を乾燥し、次のように再生する実験によつ
て例示される： １ 50mlの乾燥した活性体複合体をDI水でスラ
リーとし、DI水の数倍容量で洗浄する。 ２ 水を傾斜し、0.5NのNaOH250mlを添加し、
数分間混合し、１時間放置する。 ３ アルカリ溶液を傾斜し、活性炭を多量の水で
洗浄する。 ４ 水の傾斜後、0.5NのHCl250mlを添加し、数
分間混合し、次いで１時間放置する。 ５ 酸を傾斜し、洗浄水のPHが3.6になるまで多
量の水で洗浄する。 この方法で再生成した活性炭を、続いてPEI−
GA法によるグルコアミラーゼの固定化に使用し
た。この活性炭で110単位／mlの活性が得られた。
これは固定化のために新しい粒状炭を用いた時に
得られる130単位／mlと非常に良く一致した。 本固定化法は酵素及び粒状炭に吸着した重合体
間に、非常に安定な結合を生成させる。ここに液
化したトウモロコシの殿粉の粗溶液を固定化酵素
の床中を通過させた時、活性炭粒子は蛋白質又は
他の物質が覆つたり、それによつて汚れたりしな
いということが発見された。 次の実施例は本発明を更に例示する。実施例
中、すべての寸法は米国標準ふるい系に基づくも
のである。 実施例 １ アミノグルコシダーゼの、PEI誘導体化粒状炭
への固定 固定化に使用する前に粒状炭を次のように酸洗
浄した： １ −20〜40メツシユの粒状活性炭（Darco）
100mlを濃塩酸と混合し、室温で数時間放置し
た。この時活性炭を完全に浸すのに十分な酸を
使用した。 ２ 次いで多量の脱イオン水を活性炭スラリーに
添加し、活性炭が沈降した後に傾斜した。 ３ 工程２の水洗浄を数回繰返した。 ４ 活性炭をガラスのカラム（2.6×70cm）に移
し、流出物がPH3.5に達するまで水を床中に流
した。 ５ 次いで活性炭をカラムから取り出し、室温で
水中に貯えた。 次の方法によりグルコアミラーゼを室温で固定
化した： １ 250mlの丸底フラスコ中において、PEI−600
（Dow製、分子量範囲40000〜60000のポリエチ
レンイミン）の４％溶液100mlを酸洗浄した粒
状炭10mlに添加し、ゆつくりと数時間撹拌し
た。 ２ 次いでポリアミンを傾斜し、活性炭を多量の
水で洗浄した。 ３ 活性炭上に吸着された固定化アミノ基を、PH
9.0に調節した１％グルタルアルデヒド溶液200
mlによりグルタルアルデヒドで誘導体化した。
PHを9.0に維持しながら反応を18時間継続した。 ４ グルタルアルデヒド溶液を傾斜し、活性炭を
水洗して未反応のグルタルアルデヒドを除去し
た。 ５ 希NaOH（2N）でPH7.0に調節したグルコア
ミラーゼ（AG、Diazyme Ｌ−100 2.5ml、
Miles Laboratories、Inc.）溶液を誘導体化炭
に添加した。穏やかに数時間撹拌しながら、反
応混合物のPHを7.0に保つた。 ６ この酵素溶液を傾斜し、固定化酵素を水洗し
た。 固定化酵素の活性及び安定性を、Fordら、
Enzyme Engineering、Wingard、Jr.、L.B.編、
267頁、John Willey ＆ Sons、New York
（1972）に記述されているように、循環式微分型
反応器において数回評価することによつて決定し
た。評価は基質としてMaltrin−15〔Grain
Processing Co.、Muscatine、Iowa、から入手
した低DE（15〜18）のトウモロコシ殿粉〕をPH
4.2の0.02M酢酸塩緩衝液中で用いることにより
50℃下に行なつた。評価を行なうために、物質を
受器中に入れ、生成するグルコースの量を
Glucostrate法（一般的な方法）で評価し、回帰
分析からグルコースの分当りに生成する初期速度
を決定した。活性の単位は実験条件下において１
分間にグルコース1μモルを生成する酵素の量を
表わす。 新しい基質を用い且つ活性の安定値を決定する
ために各評価間に緩衝液（0.02M酢酸塩、PH4.2）
で洗浄することにより酵素を連続的に３回評価し
た。次の結果は、AG誘導体化炭上に固定化され
且つ活性のあることを示す。
enzyme conjugate）に関する。 本質的に蛋白質であり及び通常水溶性である酵
素が多くの且つ様々な生活有機体内で起こる化合
反応を調節するのに役立つ生機触媒（bioca−
talysts）として作用することは公知である。酵
素は分離もでき、分析、医薬及び工業の用途に使
用されている。例えばそれはチーズ又はパンのよ
うな食品の製造において並びにアルコール性飲料
の製造において工業的に使用されている。酵素グ
ルコースイソメラーゼは、高フルクトースのコー
ンシロツプの製造においてグルコースをフルクト
ースへ転換するのに良く使用されている。 酵素は通常水溶性であり並びに一般に不安定で
あり、従つて不活性化を受けるから、それを利用
した溶液から再使用のために取り出すことが困難
であり、またそれは延長された期間に亘つてその
触媒活性を保持しえない。これらの難点は、酵素
をしばしば交換する必要性があるために、商業的
規模の運転で酵素を用いるとき費用の増大をもた
らす。酵素の交換による高い費用を減ずるため
に、酵素をその使用に先立つて固定化する又は不
溶化する種々の方法が工夫されてきた。この酵素
の固定化はその再使用を可能にし、さもなければ
酵素は使用した反応媒体中で不活性化を受け或い
は失なわれる。これらの固定化酵素系は生化学的
に反応させる物質の性質に依存して種々の反応器
系、例えば充填塔及び撹拌式タンク反応器で使用
することができる。 酵素の固定化を行なうためには、いくつかの一
般的な方法並びに多くのその改変法が報告されて
いる。 米国特許第3796634号には、ポリアミンをコロ
イド状の、寸法を統一した粒子の表面上に吸着さ
せ、このポリアミンを通常のアミンと反応する架
橋剤、例えばグルタルアルデヒドで架橋し、得ら
れる反応生成物をNaBH4で処理してアルデヒド
基を還えし且つこれによつてアルデヒド基及び酵
素のアミノ基間での共有結合を防止し、及びコロ
イド状吸着剤が酵素分子と反対の正の電荷を有
し、そのイオン結合が他の非共有結合力を助ける
ようなPHにおいて酵素を粒子の処理した表面上に
吸着させることを含む固定化法が開示されてい
る。この特許は吸着剤粒子を直径約50〜約20000
Å、好ましくは約100〜200Åの範囲のものとして
記述し、また吸着剤が活性炭、ヒドロキシアパタ
イト、アルミナＣガンマ、及びベントナイトであ
ることを述べている。この系は、酵素を処理した
粒子に結合させることを電荷の相互作用に依存し
ている。この種類の結合は、イオン的相互作用が
この種の結合に対する環境条件、例えばPH、イオ
ン強度及び温度に敏感であるが故に共有結合の形
成より望ましくない。 Liuらは、Biotechnol、Bioeng.17、1695〜
1696（1975）において、ラクターゼの粒状炭への
固定化法を開示している。この方法はＰ−アミノ
フエノール又は１−フエノール−２−アミノ−４
−スルホン酸の炭素への吸着を含む。これらの吸
着された化合物はグルタルアルデヒドが反応し、
順次酵素の結合するアミノ基を提供する。言及さ
れたアミノ基含有化合物はポリエチレンイミンの
ようなポリアミンと異なる化学的及び物理的性質
を有する単量体である。 他のグループ（Choら、Immobilization of
Enzymes on Activated Carbon：Properties of
Immobilized Glucoamylase、Glucose Oxidase
and Gluconolactonase、Biotechnol.Bioeng.20、
1651〜1665（1978））も、共有結合により酵素を粒
状炭に固定化した。この方法においては、粒状炭
をカルボジイミドで活性化し、次いで酵素でカル
ボジイミドを置換し、酵素−炭素複合体を形成さ
せる。 米国特許第4141857号（1979年２月27日付け）
は、無機の有孔性担体材料、例えば細孔直径約
100〜約55000Å及び表面積約100〜500m2／ｇを有
するγ−アルミナを、水溶性ポリアミンの溶液で
処理し、この処理した担体材料を２官能性単量体
物質、例えばグルタルアルデヒドの溶液と接続さ
せることを含む酵素の固定化法を開示している。
この処理により、酵素との反応で酵素とペンダン
トのアルデヒド基との間に共有結合を形成させる
のに適当な担体材料が得られる。この特許の実施
例には、有孔性のアルミナ球を続いてポリエチ
レンイミン、グルタルアルデヒド及びグルコアミ
ラーゼの溶液で処理することによる固定化酵素配
合体の製造法が記述されている。 粒状活性炭の使用は、その多くの魅力的な性質
及び理にかなつた価格にもかかわらず、固定化酵
素に対する担体として殆んど注目されなかつた。
粒状炭はシロツプ及び他の食品生成物、製薬学的
生成物、有機酸及び種々の他の化学品の、連続式
カラム透過法による精製に対して工業的に使用さ
れている。 本発明の固定化酵素配合体は、 (a) 有孔性の（porous）粒状活性炭を、ペンダ
ントのアミン基を有するポリアミン化合物の溶
液と接触させて、ポリアミンを表面への吸着及
び細孔内への捕捉の双方により活性炭に付着さ
せ； (b) 活性炭との接触から水及びそれに分散した付
着してないポリアミンを除去し、及びこれを多
官能性アルデヒドであるアミンと反応する物質
の水性分散液と接触させてこの反応性基の１つ
をペンダントのアミン基と反応させ且つ更なる
反応のために存在するアミンと反応する残基を
残し；及び (c) 活性炭との接触から水及びそれに分散した未
反応のアミンと反応する物質を除去し、そして
この活性炭を固定化すべき酵素の水溶液と接触
させて、酵素のアミン基を共有結合の形成によ
つて未反応のアミンと反応する残基と反応さ
せ、これによつて酵素を固定化する。 工程を含んでなる固定化酵素配合体の製造法によ
つて得られる。 本発明で用いるのに適当な粒状炭は、典型的に
は米国ふるい系において12〜40メツシユの粒径を
有するであろう。細孔の寸法は好ましくは直径
で、35Å〜1000Åであり、また粒状炭担体材料は
200〜600m2／ｇの表面積を有する。 本発明で用いるのに適当なポリアミンの例は、
ポリアミンがポリエチレンジアミン、ポリエチレ
ンイミン、ポリヘキサメチレン−ジアミン、ポリ
メチレンジシクロヘキシルアミン、ポリメチレン
ジアニリン、ポリテトラエチレンペンタミン、及
びポリフエニレンジアミンを含む。エピハロヒド
リン及びアルキレンポリアミンの共重合体も適当
であることがわかつた。 上記するポリアミンの構造式を例示する。なお
各構造式においてペンダントアミン基は＊印を付
した。 (a) ポリエチレンジアミン H2Ｎ＊［−CH2CH2NH］−oＨ (b) ポリエチレンイミン H2Ｎ＊［−CH− 2CH2］−o (c) ポリヘキサメチレン−ジアミン H2Ｎ＊［−（CH2）6−NH］−oＨ (d) ポリメチレンジシクロヘキシルアミン (e) ポリメチレンジアニリン (f) ポリテトラメチレンペンタミン (g) ポリフエニレンジアミン (h) ポリジエチレントリアミン (i) ポリトリエチレンテトラミン (j) ポリペンタエチレンヘキサミン (k) ポリヘキサメチレンジアミン H2Ｎ＊［−（CH2）6−NH］−oＨ (l) エピハロヒドリンとアルキレンポリアミンと
の共重合体 ポリアミンの分子量は厳密なように見えないけ
れど、500〜100000の分子量範囲の重合体は好適
である。水溶性のポリアミンはその水溶液から活
性炭に適用され、一方非水溶性の重合体は有機溶
媒、例えばメチルアルコール、エチルアルコー
ル、プロピルアルコール、イソプロピルアルコー
ル、ｔ−ブチルアルコール、アセトン、メチルエ
ーテル、エチルエーテル、プロピルエーテル、イ
ソプロピルエーテル、トルエン、ベンゼン、キシ
レン、ヘキサン、シクロペンタン及びシクロヘキ
サンから適用される。活性炭を、普通溶媒１に
対して重合体１〜100ｇの濃度であるポリアミン
溶液と接触させることにより、ポリアミンが活性
炭粒子の表面に付着するようになる。重合体の１
部は活性炭粒子の表面に吸着されるけれど、多く
の部分は巨大分子が細孔から突き出て、更なる反
応のための官能基（アミノ基）を残すように有孔
性担体の孔の中に付着するであろう。これは前述
した米国特許第3796634号に記述される方法、即
ち炭素粉末をポリエチレンイミンの溶液で処理し
てその表面電荷を変化させ、これによつて酵素を
担体に付着させるという方法と対比される。この
方法は本発明の方法で生成する共有結合よりも非
常に望ましくない電荷での相互作用に依存する。
処置した活性炭をポリアミン溶液との接触から例
えば過によつて除去し、好ましくは脱イオン
（DI）水で洗浄していずれかの付着してない重合
体を除去する。 次いで重合体で処理した活性炭を、多官能性の
アミンと反応する物質、例えばグルタルアルデヒ
ドのようなアミンと反応する試剤を約１〜100
ｇ／で含有する水溶液と接触させることによつ
て処理する。アルデヒドが遊離のアミソ基を誘導
化するのに十分な時間に亘つて反応を進行させた
後、処理した活性炭をアルデヒド溶液から除去
し、好ましくは脱イオン水で数回洗浄する。本明
細書に用いる如き、「誘導体化」とは活性炭に結
合した重合体分子のアミノ官能基及びアミンの反
応する試剤のアミンと反応する残基間の反応生成
物を生成することを意味する。 粒状炭の孔内に捕捉され且つ吸着された重合体
物質に結合しているアミンと反応する残基と反応
しうるアミノ基を含有する酵素はいずれでも本方
法で固定化することができる。これらの酵素は例
えばトリプシン、パパイン、ヘキソキナーゼ、フ
イシン、ブロメリン、乳酸デヒドロゲナーゼ、ラ
クターゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコアミ
ラーゼ、キモトリプシン、プロナーゼ、アシラー
ゼ、イソベルターゼ、アミラーゼ、グルコースオ
キシダーゼ、ペプシン、レニン及び菌プロテアー
ゼを含む。誘導化された活性炭を酵素の水溶液と
混合する。これはバツチ型又は塔型反応器中で行
なうことができる。活性炭を酵素溶液から除去
し、次いで水洗することにより、生機触媒転化反
応に用いるのに適当な活性炭固定化酵素を得る。 本発明の酵素固定化法の予期を越えた観点の１
つは、粒状炭がその処理したものが未処理のもの
より微粉炭を生成しないという意味において強靭
になつたということである。この性質は次の実験
で例示されるように不均一生機触媒を考える時に
非常に重要である： 粒状炭の５つの試料を、ポリエチレンイミン
（PEI）の濃度を０〜0.5％（水中Ｗ／Ｖ）で変え
て処理した。このPEI処理後に、活性炭試料を洗
浄し、次いで0.02Mホウ酸塩緩衝液中PH9.0にお
いて１％グルタルアルデヒド（GA）（Ｗ／Ｖ水）
で処理した。グルタルアルデヒド溶液中の試料を
回転振とう機に取りつけ４時間撹拌した。次いで
液体を活性炭から傾斜し、懸濁液中の活性炭微粉
末の程度を０〜５の相対尺度で評価した。ゼロ値
は活性体微粉末の観察されなかつたことを表わ
し、一方５の値は完全に不透明になる活性炭微粉
末の懸濁を表わす。次の表は撹拌中に生成する活
性炭微粉末の程度を要約する。 １％GA溶液中におけるPEIで処理した粒状炭の
温撹中に生ずる活性炭微粉末 PEI処理 懸濁微粉末 対照PEIなし ５ 0.015％ PEI ３ 0.05％ PEI ２ 0.15％ PEI １ 0.5％ PEI 0.5 粒状炭粒子上に見かけ上生成する保護コーテイ
ング又は層は、存在するPEIの量に依存すること
がわかる。本方法は酵素を活性炭粒子に固定する
ばかりでなく、活性炭粒子を強化してその崩解を
減少させる。 本固定化法の他の独特な特徴は、先に使用した
粒状炭が塩基−酸洗浄を含む簡単な方法での再生
後に固定化に使用できるということである。本方
法のこの性質はそれが使用者を廃棄の問題から解
放し且つ同様に潜在的な経済的節約を提供すると
いうことで重要である。この再生の可能性は、
PEI−GA法によつて固定化された酵素を有する
粒状炭を乾燥し、次のように再生する実験によつ
て例示される： １ 50mlの乾燥した活性体複合体をDI水でスラ
リーとし、DI水の数倍容量で洗浄する。 ２ 水を傾斜し、0.5NのNaOH250mlを添加し、
数分間混合し、１時間放置する。 ３ アルカリ溶液を傾斜し、活性炭を多量の水で
洗浄する。 ４ 水の傾斜後、0.5NのHCl250mlを添加し、数
分間混合し、次いで１時間放置する。 ５ 酸を傾斜し、洗浄水のPHが3.6になるまで多
量の水で洗浄する。 この方法で再生成した活性炭を、続いてPEI−
GA法によるグルコアミラーゼの固定化に使用し
た。この活性炭で110単位／mlの活性が得られた。
これは固定化のために新しい粒状炭を用いた時に
得られる130単位／mlと非常に良く一致した。 本固定化法は酵素及び粒状炭に吸着した重合体
間に、非常に安定な結合を生成させる。ここに液
化したトウモロコシの殿粉の粗溶液を固定化酵素
の床中を通過させた時、活性炭粒子は蛋白質又は
他の物質が覆つたり、それによつて汚れたりしな
いということが発見された。 次の実施例は本発明を更に例示する。実施例
中、すべての寸法は米国標準ふるい系に基づくも
のである。 実施例 １ アミノグルコシダーゼの、PEI誘導体化粒状炭
への固定 固定化に使用する前に粒状炭を次のように酸洗
浄した： １ −20〜40メツシユの粒状活性炭（Darco）
100mlを濃塩酸と混合し、室温で数時間放置し
た。この時活性炭を完全に浸すのに十分な酸を
使用した。 ２ 次いで多量の脱イオン水を活性炭スラリーに
添加し、活性炭が沈降した後に傾斜した。 ３ 工程２の水洗浄を数回繰返した。 ４ 活性炭をガラスのカラム（2.6×70cm）に移
し、流出物がPH3.5に達するまで水を床中に流
した。 ５ 次いで活性炭をカラムから取り出し、室温で
水中に貯えた。 次の方法によりグルコアミラーゼを室温で固定
化した： １ 250mlの丸底フラスコ中において、PEI−600
（Dow製、分子量範囲40000〜60000のポリエチ
レンイミン）の４％溶液100mlを酸洗浄した粒
状炭10mlに添加し、ゆつくりと数時間撹拌し
た。 ２ 次いでポリアミンを傾斜し、活性炭を多量の
水で洗浄した。 ３ 活性炭上に吸着された固定化アミノ基を、PH
9.0に調節した１％グルタルアルデヒド溶液200
mlによりグルタルアルデヒドで誘導体化した。
PHを9.0に維持しながら反応を18時間継続した。 ４ グルタルアルデヒド溶液を傾斜し、活性炭を
水洗して未反応のグルタルアルデヒドを除去し
た。 ５ 希NaOH（2N）でPH7.0に調節したグルコア
ミラーゼ（AG、Diazyme Ｌ−100 2.5ml、
Miles Laboratories、Inc.）溶液を誘導体化炭
に添加した。穏やかに数時間撹拌しながら、反
応混合物のPHを7.0に保つた。 ６ この酵素溶液を傾斜し、固定化酵素を水洗し
た。 固定化酵素の活性及び安定性を、Fordら、
Enzyme Engineering、Wingard、Jr.、L.B.編、
267頁、John Willey ＆ Sons、New York
（1972）に記述されているように、循環式微分型
反応器において数回評価することによつて決定し
た。評価は基質としてMaltrin−15〔Grain
Processing Co.、Muscatine、Iowa、から入手
した低DE（15〜18）のトウモロコシ殿粉〕をPH
4.2の0.02M酢酸塩緩衝液中で用いることにより
50℃下に行なつた。評価を行なうために、物質を
受器中に入れ、生成するグルコースの量を
Glucostrate法（一般的な方法）で評価し、回帰
分析からグルコースの分当りに生成する初期速度
を決定した。活性の単位は実験条件下において１
分間にグルコース1μモルを生成する酵素の量を
表わす。 新しい基質を用い且つ活性の安定値を決定する
ために各評価間に緩衝液（0.02M酢酸塩、PH4.2）
で洗浄することにより酵素を連続的に３回評価し
た。次の結果は、AG誘導体化炭上に固定化され
且つ活性のあることを示す。
【表】
実施例
バクテリヤのα−アミラーゼの、PEI誘導体化
炭への固定化 実施例における如くPEI−グルタルアルデヒ
ドで誘導体化した粒状炭５ml量を、バクテリヤの
α−アミラーゼ（Taka−Therm、Miles
Laboratories、Inc.）を固定化するために使用し
た。誘導体化炭を処理するために用いる酵素溶液
は水で50mlに稀釈した１mlのTaka−Thermか
らなつた。固定化を実施例に記述したように行
なつた。得られた固定化調製物を、緩衝液（10ｍ
ＭのCaCl2を含有する0.02M酢酸塩、PH6.0）で洗
浄後、10ｍＭ CaCl2を含有するPH6.0の0.02M酢
酸塩緩衝液中４％可溶性殿粉を基質として用い、
微分型反応器で評価した。殿粉の加水分解の程度
を、Ghuysenら、Methods in Enzymology、第
巻、685頁、Academic Press、New York、
1966年に記述されているフエリシアニド法により
生成する還元基の量を測定することによつて決定
した。この場合グルコースを参照物質として使用
した。固定したα−アミラーゼの活性は連続評価
において、固定化酵素１ml当りそれぞれ11.7及び
9.5単位であつた。 実施例 菌のα−アミラーゼの、PEI誘導体化粒状炭へ
の固定化 実施例に記述したように、菌のα−アミラー
ゼを誘導体化炭上に固定化した。PH7.0に調節し
たSumizyme LP−８の菌のα−アミラーゼ
（908MMU／mg）0.1ｇを含有する酵素溶液を用
いてPEI−グルタルアルデヒドで誘導体化した活
性炭５mlを処理した。固定化調製物の活性を、１
％Martrin−10を基質として用いる以外実施例
に記述したように測定した。連続評価において固
定化酵素１ml当り5.2及び5.5単位の活性が得られ
た。活性の単位は、フエリシアニド法によりグル
コースμモル／分として測定される如き還元基の
生成量を表わす。 実施例 ダイズのβ−アミラーゼの、PEI−グルタルア
ルデヒド誘導体化粒状炭への固定化 実施例に記述した方法を用いてダイズのβ−
アミラーゼを固定化した。PH7.0に調節した50ml
の酵素溶液（凍結乾燥した試料0.1ｇ、182単位／
ｇ）を用いてPEI誘導体化炭５mlを処理した。こ
の固定化酵素調製物を、実施例の評価条件を用
いて微分型反応器で評価した。固定化酵素１ml当
り2.6及び2.4の連続評価結果が得られた。 実施例 モルト・アミラーゼの、PEI−グルタルアルデ
ヒド誘導体化粒状炭への固定化 PH7.0のモルト・アミラーゼ（0.2ｇ、Mylase−
Wauerstoin Lab）の100mlの溶液を用いて、実
施例に記述した方法により、PEI誘導体化粒状
炭10mlを処理した。この固定化酵素調製物を、実
施例に記述したように、４％可溶性殿粉を基質
として用いることにより、微分型反応器で評価し
た。固定化酵素１ml当り1.8単位の活性が得られ
た。粒状炭を用いる評価の多くでは、Choら、
Biotechnol.Bioeng.、20、1651（1978）に記述さ
れるように基質及び生成物の吸着が実際の速度に
影響しうることを記述しなければならない。 実施例 コムギのβ−アミラーゼの、PEI−グルタルア
ルデヒド誘導体化粒状炭への固定化 DI水（PH7.0）100ml中のコムギのβ−アミラー
ゼ（凍結乾燥した粉末140MMU／mg）0.2mg量を
用い、実施例に記述した方法に従つてPEI−グ
ルタルアルデヒド誘導体化炭10mlを処理した。こ
の調製物の活性は、微分型反応器中においてPH
6.0の４％可溶性殿粉を基質として用いることに
より、固定化酵素１ml当り1.6単位として評価で
きた。 実施例 プルラナーゼの、PEI−グルタルアルデヒド誘
導体化粒状炭への固定化 実施例に記述した方法と同様に、誘導体化炭
10mlを、プルラナーゼ（A.B.M.Chemical Ltd.、
試料K1000）0.2ｇをDI水100mlに溶解することに
よつて調製したプルラナーゼのPH7.0の溶液100ml
で処理することによりプルラナーゼを固定した。
この酵素調製物の活性を、循環式微分型反応器中
において、PH5.5の0.02M酢酸塩緩衝液中0.2％プ
ルランを基質を用いて50℃下に評価した。プルラ
ンの消化の程度を、還元基の出現によつて決定し
た。還元基を、フエリシアニド法により、グルコ
ースを参照物として評価した。還元基の生成を時
間の関数としてプロツトし、このプロツトから、
反応15分においてプルランの15％が消化されたこ
とが評価された。 実施例 グルコース・イソメラーゼの、PEI−グルタル
アルデヒド誘導体化粒状炭への固定化 ストレプトマイシン・オリバセウム（Strepto
−myces olivaceus）の洗浄した細胞を稀釈洗剤
（0.1％Lubrol WX）で処理し及び遠心分離して
細胞かすを除去することによつて可溶性のグルコ
ース・イソメラーゼ（GI）を得た。活性２単
位／ml（単位＝フルクトースμモル／分）を有す
るPH7.0の可溶性GIの100ml量を用いて、実施例
に記述したように誘導体化粒状炭10mlを処理し
た。活性は微分型反応器中において、2Mグルコ
ース、4.1ｍＭ MgSO4・7H2O、2.4ｍＭ
NaHSO3及び20ｍＭトリス−マレエート緩衝液
PH8.0を含む基質を用いることにより、50℃で固
定化酵素１ml当り2.2単位と評価された。フルク
トースの生成量をシステイン−H2SO4法で決定
した。 実施例 菌のラクターゼの、PEI−グルタルアルデヒド
誘導体化粒状炭への固定化 １％グルタルアルデヒド溶液を0.05Mホウ酸塩
でPH9.0に緩衝させ且つ酵素溶液を0.05M燐酸ナ
トリウムでPH7.0に緩衝させる以外実施例に記
述した方法により、菌のラクターゼを誘導体化粒
状炭に固定化した。ラクターゼ溶液（0.1ｇの50
ml、Miles Laboratories、Inc.、菌のラクター
ゼ、14280FCCLU／ｇ）を用いてPEI誘導体化炭
10mlを処理した。この酵素調製物の活性を、微分
型反応器において、0.05μ酢酸塩緩衝液PH4.5中
0.15Mラクトースを基質として用いることにより
55℃で測定した。ラクトースの分解を、
Glucostrate法により決定される如きグルコース
の生成量によつて監視した。活性は固定化酵素１
ml当り38単位として評価された。 実施例 PEIの分子の大きさの、アミログルコシダーゼ
の固定化に及ぼす影響 先の実施例においては、１種類だけのポリアミ
ン（Dow PEI−600、分子量範囲40000〜60000）
を粒状炭に誘導体化させた。本実施例では、他の
分子量のPEIを用いて酵素の結合に及ぼす影響を
決定した。この実験のために、１％PEI−18
（MW1800）、２％PEI−200（MW20000〜30000）、
及び１％PEI−600（MW40000〜60000）の溶液50
mlを用いて酸洗浄した粒状炭10mlを処理した。活
性炭の誘導体化法は、グルタルアルデヒド溶液を
0.05Mホウ酸塩でPH9.0に緩衝させる以外実施例
に記述したものと同様であつた。またAG溶液
（50mlに希釈したMiles Diazyme Ｌ−100の２
ml）も0.05M燐酸塩でPH7.0に緩衝させた。 この調製物の酵素活性を、実施例に記述した
ように循環式微分型反応器で決定した。次の表は
活性を要約する。 活 性 誘導体化炭 （Gμmol／分／固定化酵素ml） PEI−18 252 PEI−200 232 PEI−600 179 これらの結果は、広い分子量範囲のPEIが固定
化酵素に使用できるが、ポリアミン分子の大きさ
が固定化された酵素の量に影響するということを
示す。酵素が結合するPEI分子の大きさは、立体
障害又は物質移動の現象により、液化殿粉の消化
から得られる生成物の様子にも影響する。 実施例 XI AGの、Betz1180−グルタルアルデヒド誘導体
化粒状炭への固定化 本実施例では、AGを固定化するために他の種
類のポリアミンをポリエチレンイミンの代りに用
いた。この実験に対してはBetz1180をポリアミ
ンとして使用した。このBetz Laboratories、
Inc.、Trevose、Pennsyl−vania、から商品名
Betz1180として市販されている重合体は、エピ
ハロヒドリンのアルキレンポリアミンとの重合に
よつて得られる水溶性のカチオン重合体である。
これは100万以下の分子量を有し、溶液１ｇ当り
約0.288ミリモルのアミノ基（ニンヒドリン分析
による）を含み、全溶液重量に基づいて30重量％
の固体を含有する溶液として市販されている。こ
の重合体及びその製造に関する更に詳細な記述は
米国特許第3915904号及び第3953330号に見出すこ
とができる。ポリアミンの吸着、アミノ基の活性
化及び酵素の固定化の工程は実施例に記述した
ものと同様であつた。調製物の活性は実施例に
おける如く236単位／固定化酵素mlとして評価さ
れた。本実施例は、ペンダントのアミン基を有す
るポリエチレンイミン以外のポリアミンも本発明
で使用するのに適当であることを示す。 実施例 XII グルコース・イソメラーゼの、２重にPEI誘導
体化された粒状炭への固定化 固定化された酵素及び担体間の距離及び担体に
関する固定化酵素の柔軟性は、酵素の代りにポリ
アミンを、吸着された誘導体化ポリアミンに反応
させ、次いでこの新規なポリアミンを酵素の固定
化のためにグルタルアルデヒドで誘導体化するこ
とによつて変えることができる。この技術は、第
１にポリアミン（PEI又はBetz1180）を酸洗浄し
た粒状炭に吸着させ；第２にアミノ基をグルタル
アルデヒドと反応させ；第３にポリアミンをグル
タルアルデヒドのアルデヒド基に共有的に結合さ
せ；第４にアミノ基をグルタルアルデヒドで活性
化させ、最後に酵素を固定化するということによ
つて試みられた。 実験条件は、ポリアミンをPH9.0の0.05Mホウ
酸塩緩衝液中で作るという第２のポリアミンでの
処理を除き、ポリアミン及びグルタルアルデヒド
工程に関しては実施例XIに記述したものと同様で
あつた。PEI−600及びBetz1180の組合せにより
４つの試料を調製した。固定化に用いた酵素は実
施例に記述したGIであつた。製造した試料の
活性を、実施例に記述した評価法を用いて下表
に示す。
炭への固定化 実施例における如くPEI−グルタルアルデヒ
ドで誘導体化した粒状炭５ml量を、バクテリヤの
α−アミラーゼ（Taka−Therm、Miles
Laboratories、Inc.）を固定化するために使用し
た。誘導体化炭を処理するために用いる酵素溶液
は水で50mlに稀釈した１mlのTaka−Thermか
らなつた。固定化を実施例に記述したように行
なつた。得られた固定化調製物を、緩衝液（10ｍ
ＭのCaCl2を含有する0.02M酢酸塩、PH6.0）で洗
浄後、10ｍＭ CaCl2を含有するPH6.0の0.02M酢
酸塩緩衝液中４％可溶性殿粉を基質として用い、
微分型反応器で評価した。殿粉の加水分解の程度
を、Ghuysenら、Methods in Enzymology、第
巻、685頁、Academic Press、New York、
1966年に記述されているフエリシアニド法により
生成する還元基の量を測定することによつて決定
した。この場合グルコースを参照物質として使用
した。固定したα−アミラーゼの活性は連続評価
において、固定化酵素１ml当りそれぞれ11.7及び
9.5単位であつた。 実施例 菌のα−アミラーゼの、PEI誘導体化粒状炭へ
の固定化 実施例に記述したように、菌のα−アミラー
ゼを誘導体化炭上に固定化した。PH7.0に調節し
たSumizyme LP−８の菌のα−アミラーゼ
（908MMU／mg）0.1ｇを含有する酵素溶液を用
いてPEI−グルタルアルデヒドで誘導体化した活
性炭５mlを処理した。固定化調製物の活性を、１
％Martrin−10を基質として用いる以外実施例
に記述したように測定した。連続評価において固
定化酵素１ml当り5.2及び5.5単位の活性が得られ
た。活性の単位は、フエリシアニド法によりグル
コースμモル／分として測定される如き還元基の
生成量を表わす。 実施例 ダイズのβ−アミラーゼの、PEI−グルタルア
ルデヒド誘導体化粒状炭への固定化 実施例に記述した方法を用いてダイズのβ−
アミラーゼを固定化した。PH7.0に調節した50ml
の酵素溶液（凍結乾燥した試料0.1ｇ、182単位／
ｇ）を用いてPEI誘導体化炭５mlを処理した。こ
の固定化酵素調製物を、実施例の評価条件を用
いて微分型反応器で評価した。固定化酵素１ml当
り2.6及び2.4の連続評価結果が得られた。 実施例 モルト・アミラーゼの、PEI−グルタルアルデ
ヒド誘導体化粒状炭への固定化 PH7.0のモルト・アミラーゼ（0.2ｇ、Mylase−
Wauerstoin Lab）の100mlの溶液を用いて、実
施例に記述した方法により、PEI誘導体化粒状
炭10mlを処理した。この固定化酵素調製物を、実
施例に記述したように、４％可溶性殿粉を基質
として用いることにより、微分型反応器で評価し
た。固定化酵素１ml当り1.8単位の活性が得られ
た。粒状炭を用いる評価の多くでは、Choら、
Biotechnol.Bioeng.、20、1651（1978）に記述さ
れるように基質及び生成物の吸着が実際の速度に
影響しうることを記述しなければならない。 実施例 コムギのβ−アミラーゼの、PEI−グルタルア
ルデヒド誘導体化粒状炭への固定化 DI水（PH7.0）100ml中のコムギのβ−アミラー
ゼ（凍結乾燥した粉末140MMU／mg）0.2mg量を
用い、実施例に記述した方法に従つてPEI−グ
ルタルアルデヒド誘導体化炭10mlを処理した。こ
の調製物の活性は、微分型反応器中においてPH
6.0の４％可溶性殿粉を基質として用いることに
より、固定化酵素１ml当り1.6単位として評価で
きた。 実施例 プルラナーゼの、PEI−グルタルアルデヒド誘
導体化粒状炭への固定化 実施例に記述した方法と同様に、誘導体化炭
10mlを、プルラナーゼ（A.B.M.Chemical Ltd.、
試料K1000）0.2ｇをDI水100mlに溶解することに
よつて調製したプルラナーゼのPH7.0の溶液100ml
で処理することによりプルラナーゼを固定した。
この酵素調製物の活性を、循環式微分型反応器中
において、PH5.5の0.02M酢酸塩緩衝液中0.2％プ
ルランを基質を用いて50℃下に評価した。プルラ
ンの消化の程度を、還元基の出現によつて決定し
た。還元基を、フエリシアニド法により、グルコ
ースを参照物として評価した。還元基の生成を時
間の関数としてプロツトし、このプロツトから、
反応15分においてプルランの15％が消化されたこ
とが評価された。 実施例 グルコース・イソメラーゼの、PEI−グルタル
アルデヒド誘導体化粒状炭への固定化 ストレプトマイシン・オリバセウム（Strepto
−myces olivaceus）の洗浄した細胞を稀釈洗剤
（0.1％Lubrol WX）で処理し及び遠心分離して
細胞かすを除去することによつて可溶性のグルコ
ース・イソメラーゼ（GI）を得た。活性２単
位／ml（単位＝フルクトースμモル／分）を有す
るPH7.0の可溶性GIの100ml量を用いて、実施例
に記述したように誘導体化粒状炭10mlを処理し
た。活性は微分型反応器中において、2Mグルコ
ース、4.1ｍＭ MgSO4・7H2O、2.4ｍＭ
NaHSO3及び20ｍＭトリス−マレエート緩衝液
PH8.0を含む基質を用いることにより、50℃で固
定化酵素１ml当り2.2単位と評価された。フルク
トースの生成量をシステイン−H2SO4法で決定
した。 実施例 菌のラクターゼの、PEI−グルタルアルデヒド
誘導体化粒状炭への固定化 １％グルタルアルデヒド溶液を0.05Mホウ酸塩
でPH9.0に緩衝させ且つ酵素溶液を0.05M燐酸ナ
トリウムでPH7.0に緩衝させる以外実施例に記
述した方法により、菌のラクターゼを誘導体化粒
状炭に固定化した。ラクターゼ溶液（0.1ｇの50
ml、Miles Laboratories、Inc.、菌のラクター
ゼ、14280FCCLU／ｇ）を用いてPEI誘導体化炭
10mlを処理した。この酵素調製物の活性を、微分
型反応器において、0.05μ酢酸塩緩衝液PH4.5中
0.15Mラクトースを基質として用いることにより
55℃で測定した。ラクトースの分解を、
Glucostrate法により決定される如きグルコース
の生成量によつて監視した。活性は固定化酵素１
ml当り38単位として評価された。 実施例 PEIの分子の大きさの、アミログルコシダーゼ
の固定化に及ぼす影響 先の実施例においては、１種類だけのポリアミ
ン（Dow PEI−600、分子量範囲40000〜60000）
を粒状炭に誘導体化させた。本実施例では、他の
分子量のPEIを用いて酵素の結合に及ぼす影響を
決定した。この実験のために、１％PEI−18
（MW1800）、２％PEI−200（MW20000〜30000）、
及び１％PEI−600（MW40000〜60000）の溶液50
mlを用いて酸洗浄した粒状炭10mlを処理した。活
性炭の誘導体化法は、グルタルアルデヒド溶液を
0.05Mホウ酸塩でPH9.0に緩衝させる以外実施例
に記述したものと同様であつた。またAG溶液
（50mlに希釈したMiles Diazyme Ｌ−100の２
ml）も0.05M燐酸塩でPH7.0に緩衝させた。 この調製物の酵素活性を、実施例に記述した
ように循環式微分型反応器で決定した。次の表は
活性を要約する。 活 性 誘導体化炭 （Gμmol／分／固定化酵素ml） PEI−18 252 PEI−200 232 PEI−600 179 これらの結果は、広い分子量範囲のPEIが固定
化酵素に使用できるが、ポリアミン分子の大きさ
が固定化された酵素の量に影響するということを
示す。酵素が結合するPEI分子の大きさは、立体
障害又は物質移動の現象により、液化殿粉の消化
から得られる生成物の様子にも影響する。 実施例 XI AGの、Betz1180−グルタルアルデヒド誘導体
化粒状炭への固定化 本実施例では、AGを固定化するために他の種
類のポリアミンをポリエチレンイミンの代りに用
いた。この実験に対してはBetz1180をポリアミ
ンとして使用した。このBetz Laboratories、
Inc.、Trevose、Pennsyl−vania、から商品名
Betz1180として市販されている重合体は、エピ
ハロヒドリンのアルキレンポリアミンとの重合に
よつて得られる水溶性のカチオン重合体である。
これは100万以下の分子量を有し、溶液１ｇ当り
約0.288ミリモルのアミノ基（ニンヒドリン分析
による）を含み、全溶液重量に基づいて30重量％
の固体を含有する溶液として市販されている。こ
の重合体及びその製造に関する更に詳細な記述は
米国特許第3915904号及び第3953330号に見出すこ
とができる。ポリアミンの吸着、アミノ基の活性
化及び酵素の固定化の工程は実施例に記述した
ものと同様であつた。調製物の活性は実施例に
おける如く236単位／固定化酵素mlとして評価さ
れた。本実施例は、ペンダントのアミン基を有す
るポリエチレンイミン以外のポリアミンも本発明
で使用するのに適当であることを示す。 実施例 XII グルコース・イソメラーゼの、２重にPEI誘導
体化された粒状炭への固定化 固定化された酵素及び担体間の距離及び担体に
関する固定化酵素の柔軟性は、酵素の代りにポリ
アミンを、吸着された誘導体化ポリアミンに反応
させ、次いでこの新規なポリアミンを酵素の固定
化のためにグルタルアルデヒドで誘導体化するこ
とによつて変えることができる。この技術は、第
１にポリアミン（PEI又はBetz1180）を酸洗浄し
た粒状炭に吸着させ；第２にアミノ基をグルタル
アルデヒドと反応させ；第３にポリアミンをグル
タルアルデヒドのアルデヒド基に共有的に結合さ
せ；第４にアミノ基をグルタルアルデヒドで活性
化させ、最後に酵素を固定化するということによ
つて試みられた。 実験条件は、ポリアミンをPH9.0の0.05Mホウ
酸塩緩衝液中で作るという第２のポリアミンでの
処理を除き、ポリアミン及びグルタルアルデヒド
工程に関しては実施例XIに記述したものと同様で
あつた。PEI−600及びBetz1180の組合せにより
４つの試料を調製した。固定化に用いた酵素は実
施例に記述したGIであつた。製造した試料の
活性を、実施例に記述した評価法を用いて下表
に示す。
【表】
すべての調製物の活性は実施例で固定化した
GIよりも活性があつた。この固定化法は、実施
例で用いたPEI誘導体化炭素に対する固定化酵
素の2.2単位／mlと比較して、炭素粒子への酵素
負荷量を増加させうる。 実施例 AGの、Betz1180誘導体化炭素への固定化の製
造技術 酵素固定化に関するすべての上述の実施例はバ
ツチ式で行なつたものであつた。本実施例はカラ
ム法を用いるAGの担体300mlへの固定化に関す
る結果を示す。 方法（すべての工程は室温） １ Darcoの20/40メツシユ粒状活性炭300mlを濃
HClに数時間浸した。 ２ 過剰のHClを傾斜し、活性炭を多量のDI水
で洗浄した。 ３ 活性炭を2.6×70cmのガラス製カラムに移し、
流出物のPHが3.9に達するまで水を床に通じる
ことにより洗浄し続けた。 ４ 次いでポリアミンの溶液２（Betz1180の
40ｇをDI水で希釈）を床に通じた。すべての
溶液を床へ通した後、溶液を４時間に亘り上方
流として床へ循環した。 ５ 次いで水４（上方流）で洗浄することによ
り過剰のポリアミンを活性炭から洗浄した。 ６ 0.02Mホウ酸塩緩衝液（PH9.0）中１％グル
タルアルデヒド1.5を床へ通じ、次いで約16
時間上方流で循環した。 ７ 次いで過剰のグルタルアルデヒドを工程５と
同様の方法により活性炭から水で洗浄した。 ８ 0.02M燐酸塩緩衝液（PH7.0）中酵素溶液
（Diazyme 60ml）1.5を床へ通じ、次いで約
５時間に亘つて上方流で循環させた。 ９ 次いで過剰の酵素を工程５に記述したように
洗浄した。 10 0.02Mクエン酸塩緩衝液（PH4.2）約７を
約18時間に亘つて床へ通じた。この時流出物の
PHは4.2であつた。 11 固定化酵素の調製物をカラムから取り出し、
0.02Mクエン酸塩緩衝液中にPH4.2で貯蔵した。 実施例に記述したように微分型反応器で評価
した固定化AG調製物の活性は、固定化酵素１ml
当り236単位であつた。この実験で示されるよう
に、多量へのスケールアツプは固定化に対し何ら
固有の問題を呈さなかつた。 実施例 この比較例では、アルミナと活性炭を酵素の固
定化に対する担体として比較する更なる実験を記
述する。担体の物理性を下表に要約する。いく
つかの異なる因子を比較した。 １つの実験において、同一の条件下にPEI／グ
ルタルアルデヒドを用いることにより、アミログ
ルコシダーゼ（AG）を２つの担体物質（アルミ
ナ及び活性炭）へ固定した。活性炭の重要な性質
の１つは塩基−酸洗浄で再生できるということで
あるから、両担体を、酵素の固定化に先立つて穏
やかな酸−塩基処理に供した。これらの実験に対
し、担体物質を約２時間に亘り振とう機で酸又は
塩基と混合し、次いで夜通し放置した。次いで試
剤を傾斜し、担体を固定化工程で処理する前に多
量の水で洗浄した。これらの実験の結果を表1a
に要約する。
GIよりも活性があつた。この固定化法は、実施
例で用いたPEI誘導体化炭素に対する固定化酵
素の2.2単位／mlと比較して、炭素粒子への酵素
負荷量を増加させうる。 実施例 AGの、Betz1180誘導体化炭素への固定化の製
造技術 酵素固定化に関するすべての上述の実施例はバ
ツチ式で行なつたものであつた。本実施例はカラ
ム法を用いるAGの担体300mlへの固定化に関す
る結果を示す。 方法（すべての工程は室温） １ Darcoの20/40メツシユ粒状活性炭300mlを濃
HClに数時間浸した。 ２ 過剰のHClを傾斜し、活性炭を多量のDI水
で洗浄した。 ３ 活性炭を2.6×70cmのガラス製カラムに移し、
流出物のPHが3.9に達するまで水を床に通じる
ことにより洗浄し続けた。 ４ 次いでポリアミンの溶液２（Betz1180の
40ｇをDI水で希釈）を床に通じた。すべての
溶液を床へ通した後、溶液を４時間に亘り上方
流として床へ循環した。 ５ 次いで水４（上方流）で洗浄することによ
り過剰のポリアミンを活性炭から洗浄した。 ６ 0.02Mホウ酸塩緩衝液（PH9.0）中１％グル
タルアルデヒド1.5を床へ通じ、次いで約16
時間上方流で循環した。 ７ 次いで過剰のグルタルアルデヒドを工程５と
同様の方法により活性炭から水で洗浄した。 ８ 0.02M燐酸塩緩衝液（PH7.0）中酵素溶液
（Diazyme 60ml）1.5を床へ通じ、次いで約
５時間に亘つて上方流で循環させた。 ９ 次いで過剰の酵素を工程５に記述したように
洗浄した。 10 0.02Mクエン酸塩緩衝液（PH4.2）約７を
約18時間に亘つて床へ通じた。この時流出物の
PHは4.2であつた。 11 固定化酵素の調製物をカラムから取り出し、
0.02Mクエン酸塩緩衝液中にPH4.2で貯蔵した。 実施例に記述したように微分型反応器で評価
した固定化AG調製物の活性は、固定化酵素１ml
当り236単位であつた。この実験で示されるよう
に、多量へのスケールアツプは固定化に対し何ら
固有の問題を呈さなかつた。 実施例 この比較例では、アルミナと活性炭を酵素の固
定化に対する担体として比較する更なる実験を記
述する。担体の物理性を下表に要約する。いく
つかの異なる因子を比較した。 １つの実験において、同一の条件下にPEI／グ
ルタルアルデヒドを用いることにより、アミログ
ルコシダーゼ（AG）を２つの担体物質（アルミ
ナ及び活性炭）へ固定した。活性炭の重要な性質
の１つは塩基−酸洗浄で再生できるということで
あるから、両担体を、酵素の固定化に先立つて穏
やかな酸−塩基処理に供した。これらの実験に対
し、担体物質を約２時間に亘り振とう機で酸又は
塩基と混合し、次いで夜通し放置した。次いで試
剤を傾斜し、担体を固定化工程で処理する前に多
量の水で洗浄した。これらの実験の結果を表1a
に要約する。
【表】
【表】
【表】
第1a表に要約した結果は、担体の予備処理で、
活性炭がすべての酵素を結合するのにより効果的
であることを示す。アルミナは酵素の約50％を結
合していないで残こすという結合に関し、見かけ
上より特異的である。アルミナの酸処理は、この
担体の結合能力が結合しないまゝ残る多量の活性
により且つ低い固定化活性（単位／ml）により示
されるように減少するという具合にアルミナの構
造を見かけ上変えてしまう。しかしながらアルミ
ナの塩基での処理は殆んど影響を示さない。活性
炭の酸又は塩基の処理は、活性炭の結合特性に本
質的に全然影響しないように見ることができる。
これらの結果は穏やかな酸又は塩基処理に対する
相対結合性及び担体の不活性に関し、基本的な差
異を示している。 固定化AG作用特性及びその両担体上での安定
性を液化したトウモロコシ殿粉の消化について評
価するために、他の一連の実験を行なつた。AG
は酸又は塩基の予備処理を行なわずに両担体上へ
固定化した。
活性炭がすべての酵素を結合するのにより効果的
であることを示す。アルミナは酵素の約50％を結
合していないで残こすという結合に関し、見かけ
上より特異的である。アルミナの酸処理は、この
担体の結合能力が結合しないまゝ残る多量の活性
により且つ低い固定化活性（単位／ml）により示
されるように減少するという具合にアルミナの構
造を見かけ上変えてしまう。しかしながらアルミ
ナの塩基での処理は殆んど影響を示さない。活性
炭の酸又は塩基の処理は、活性炭の結合特性に本
質的に全然影響しないように見ることができる。
これらの結果は穏やかな酸又は塩基処理に対する
相対結合性及び担体の不活性に関し、基本的な差
異を示している。 固定化AG作用特性及びその両担体上での安定
性を液化したトウモロコシ殿粉の消化について評
価するために、他の一連の実験を行なつた。AG
は酸又は塩基の予備処理を行なわずに両担体上へ
固定化した。
【表】
第２表は固定化工程における酵素の分布を要約
する。カラム反応器（100×1.5cmのガラス製のジ
ヤケツトつきカラム）を用いて、各固定化酵素を
同量で含有するカラムを準備した。この実験に対
して、カラムは活性炭に結合したAG床10ml及び
アルミナに結合したAG床30mlからなつた。両カ
ラムに、23％DSに調節され且つ５ｍＭクエン酸
塩でPH4.2に調節された25DE（デキストロース同
等）の未精製のα−アミラーゼで液化したトウモ
ロコシ粉を供給した。基質を約10ml／時の一定流
速で床に通じた。カラムのジケツトに50℃の水を
循環してカラムを一定温度に維持した。消化の程
度を決定するために、カラム流出物をHPLC分離
へ周期的に供して炭水化物特性を決定した。アル
ミナ及び活性炭に結合するAGによる消化物の炭
水化物特性をそれぞれ第３及び第４に要約する。
またこれらの表には、公称の反応時間及びDE値
も示す。この公称の反応時間はその大きい床容量
が故にアルミナに結合したAGに対して長かつ
た。炭化水素特性は例え両酵素が同一の活性単位
（初期活性に基づいて）を有したとしても著しく
異なつた。
する。カラム反応器（100×1.5cmのガラス製のジ
ヤケツトつきカラム）を用いて、各固定化酵素を
同量で含有するカラムを準備した。この実験に対
して、カラムは活性炭に結合したAG床10ml及び
アルミナに結合したAG床30mlからなつた。両カ
ラムに、23％DSに調節され且つ５ｍＭクエン酸
塩でPH4.2に調節された25DE（デキストロース同
等）の未精製のα−アミラーゼで液化したトウモ
ロコシ粉を供給した。基質を約10ml／時の一定流
速で床に通じた。カラムのジケツトに50℃の水を
循環してカラムを一定温度に維持した。消化の程
度を決定するために、カラム流出物をHPLC分離
へ周期的に供して炭水化物特性を決定した。アル
ミナ及び活性炭に結合するAGによる消化物の炭
水化物特性をそれぞれ第３及び第４に要約する。
またこれらの表には、公称の反応時間及びDE値
も示す。この公称の反応時間はその大きい床容量
が故にアルミナに結合したAGに対して長かつ
た。炭化水素特性は例え両酵素が同一の活性単位
（初期活性に基づいて）を有したとしても著しく
異なつた。
【表】
【表】
【表】
第３及び４表からは、活性炭に固定化したAG
がDP1、低DP2及びDP3オリゴサツカライドの高
割合及びDP4、DP5及びDP6オリゴサツカライド
の完全な消化によつて示されるように液化殿粉を
より完全に消化したことが決定できる。また＞
DP6画分はアルミナに固定化したAGに比べて活
性炭に固定化したAGに対して実質的に低かつ
た。AG−アルミナカラムからの流出物中の、ジ
サツカライド（DP2）及び中間オリゴサツカライ
ド（DP3〜DP6）の高量及びグルコースの低量
は、活性の見かけの損失或いは酵素活性の見かけ
の損失を引き起こすある種の物質移動現象の存在
を示す。 アルミナに結合したAGの、活性の見かけの損
失或いは活性炭に結合したAGと同程度に効果的
に殿粉を消化しえないことを定量化するために、
活性は第３及び４表に示す結果から計算した、生
成グルコースのμモル／分／酵素mlとして表わす
ことができる。この時、カラム消化物から観察さ
れる活性を、Maltrin15を基質として用いる振と
う浴中で固定化酵素を評価することによつて得ら
れる初期速度活性で割ることにより、活性の結果
を無名数に規格化もした。活性炭に結合したAG
の無名数での活性は、アルミナ結合したAGの無
名数での活性の殆んど２倍である。
がDP1、低DP2及びDP3オリゴサツカライドの高
割合及びDP4、DP5及びDP6オリゴサツカライド
の完全な消化によつて示されるように液化殿粉を
より完全に消化したことが決定できる。また＞
DP6画分はアルミナに固定化したAGに比べて活
性炭に固定化したAGに対して実質的に低かつ
た。AG−アルミナカラムからの流出物中の、ジ
サツカライド（DP2）及び中間オリゴサツカライ
ド（DP3〜DP6）の高量及びグルコースの低量
は、活性の見かけの損失或いは酵素活性の見かけ
の損失を引き起こすある種の物質移動現象の存在
を示す。 アルミナに結合したAGの、活性の見かけの損
失或いは活性炭に結合したAGと同程度に効果的
に殿粉を消化しえないことを定量化するために、
活性は第３及び４表に示す結果から計算した、生
成グルコースのμモル／分／酵素mlとして表わす
ことができる。この時、カラム消化物から観察さ
れる活性を、Maltrin15を基質として用いる振と
う浴中で固定化酵素を評価することによつて得ら
れる初期速度活性で割ることにより、活性の結果
を無名数に規格化もした。活性炭に結合したAG
の無名数での活性は、アルミナ結合したAGの無
名数での活性の殆んど２倍である。
【表】
【表】
両方のAGの固定化形の結果から得られる無名
数での活性の比較は、両カラムの転化率が同様で
ないから、比較的荒い評価となる。しかしなが
ら、無数名での活性の広い変化は、Maltrin15
（15DE）を消化する際の及び液化トウモロコシ殿
粉（25DE）を転化する時のAGの固定化形の基
本的な差異を示している。これらの結果から引き
出すことのできる結論は、活性炭に結合したAG
がアルミナに結合したAGよりも短鎖のオリゴサ
ツカライドをグルコースへ迅速に消化することが
できるということである。これは炭素に結合した
AGがアルミナに結合したAGよりも比較的拘束
されていないことを示す。 固定化AGの両形は第１表に示すように全く安
定であるかに見える。最初、炭素に結合したAG
は運転の約50時間までいくらか見かけの活性を失
い、次いで運転400時間を経て定常状態に達する
ということは興味深く記述できる。アルミナに結
合したAGは運転の初期の50時間に亘つて見かけ
の活性の増大をもたらすが、ある種の物質移動の
抵抗を示唆している。第１表のデータは、見かけ
の定常状態後に、アルミナに結合したAGは炭素
に結合したAGで表現したものの約20％であるこ
とを示す。 これらの実験から、同一の条件において活性炭
はアルミナ（25.7単位／ml）よりもAGを結合す
る（77.3単位／ml）ことが示される。活性炭に結
合したAGは、アルミナに結合したAGよりも液
化トウモロコシ殿粉を完全に消化するから、アル
ミナに結合したAGよりも物質移動抵抗の影響を
受けにくいようである。活性炭が酸及び塩基の処
理に対して安定であり、一方アルミナは塩基の処
理に安定であるが、酸の処理に不安定であるとい
うことも示される。担体の酸及び塩基の双方に対
する安定性は、酵素固定化に再使用するために担
体を再生する際に必要である。総合してこれらの
結果は、PEI−グルタルアルデヒド法による酵素
の固定化における担体として用いたとき、活性炭
及びアルミナが全く異なることを明白に示してい
る。
数での活性の比較は、両カラムの転化率が同様で
ないから、比較的荒い評価となる。しかしなが
ら、無数名での活性の広い変化は、Maltrin15
（15DE）を消化する際の及び液化トウモロコシ殿
粉（25DE）を転化する時のAGの固定化形の基
本的な差異を示している。これらの結果から引き
出すことのできる結論は、活性炭に結合したAG
がアルミナに結合したAGよりも短鎖のオリゴサ
ツカライドをグルコースへ迅速に消化することが
できるということである。これは炭素に結合した
AGがアルミナに結合したAGよりも比較的拘束
されていないことを示す。 固定化AGの両形は第１表に示すように全く安
定であるかに見える。最初、炭素に結合したAG
は運転の約50時間までいくらか見かけの活性を失
い、次いで運転400時間を経て定常状態に達する
ということは興味深く記述できる。アルミナに結
合したAGは運転の初期の50時間に亘つて見かけ
の活性の増大をもたらすが、ある種の物質移動の
抵抗を示唆している。第１表のデータは、見かけ
の定常状態後に、アルミナに結合したAGは炭素
に結合したAGで表現したものの約20％であるこ
とを示す。 これらの実験から、同一の条件において活性炭
はアルミナ（25.7単位／ml）よりもAGを結合す
る（77.3単位／ml）ことが示される。活性炭に結
合したAGは、アルミナに結合したAGよりも液
化トウモロコシ殿粉を完全に消化するから、アル
ミナに結合したAGよりも物質移動抵抗の影響を
受けにくいようである。活性炭が酸及び塩基の処
理に対して安定であり、一方アルミナは塩基の処
理に安定であるが、酸の処理に不安定であるとい
うことも示される。担体の酸及び塩基の双方に対
する安定性は、酵素固定化に再使用するために担
体を再生する際に必要である。総合してこれらの
結果は、PEI−グルタルアルデヒド法による酵素
の固定化における担体として用いたとき、活性炭
及びアルミナが全く異なることを明白に示してい
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 有孔性の粒状活性炭を担体として有し、これ
にペンダントのアミン基を有するポリアミン化合
物と、多官能性アルデヒドとの反応生成物が付着
し、この反応生成物の未反応のアミン反応性基が
それに結合させるべき酵素の遊離のアミン基と反
応している固定化酵素配合体。 ２ 活性炭が米国ふるい系で12〜40メツシユの粒
径、直径35〜1000Åの細孔寸法及び200〜600m2／
ｇの表面積を有する特許請求の範囲第１項記載の
配合体。 ３ ポリアミンがポリエチレンジアミン、ポリエ
チレンイミン、ポリヘキサメチレン−ジアミン、
ポリメチレンジシクロヘキシルアミン、ポリメチ
レンジアニリン、ポリテトラエチレンペンタミ
ン、及びポリフエニレンジアミンの群から選択さ
れる特許請求の範囲第１項記載の配合体。 ４ ポリエチレンイミンがポリジエチレントリア
ミン、ポリトリエチレンテトラミン、ポリペンタ
エチレンヘキサミン又はポリヘキサメチレンジア
ミンである特許請求の範囲第３項記載の配合物。 ５ ポリアミンがエピハロヒドリン及びアルキレ
ンポリアミンの共重合体である特許請求の範囲第
１項記載の配合体。 ６ ポリアミンが500〜100000の分子量範囲を有
する特許請求の範囲第１項記載の配合体。 ７ アミン反応性物質がグルタルアルデヒドであ
る特許請求の範囲第１又は２項記載の配合体。 ８ 酵素がグルコアミラーゼである特許請求の範
囲第１項記載の配合体。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US425942 | 1982-09-28 | ||
| US06/425,942 US4438196A (en) | 1982-09-28 | 1982-09-28 | Immobilization of biocatalysts on granular carbon |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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| JPS5978687A JPS5978687A (ja) | 1984-05-07 |
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