DK164819B - Fremgangsmaade til fremstilling af et immobiliseret enzymkonjugat samt ved fremgangsmaaden fremstillet immobiliseret enzymkonjugat - Google Patents

Description

DK 164819 B

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af et hidtil ukendt immobiliseret enzymkonjugat samt det ved fremgangsmåden fremstillede enzymkonjugat.

Det er kendt, at enzymer, der har proteinnatur, og 5 som almindeligvis er vandopløselige, virker som biokatalysatorer, der tjener til regulering af mange og forskelligartede kemiske reaktioner, der finder sted i levende organismer. Enzymerne kan også isoleres og anvendes til analytiske, medicinske og industrielle formål. Eksempelvis finder de 10 anvendelse til industrielle formål ved fremstillingen af næringsmidler, f.eks. ost eller brød, og de anvendes også ved fremstillingen af alkoholiske drikke. Enzymet glucose-isomerase anvendes i udstrakt grad til omdannelse af glucose til fructose ved fremstillingen af majssirup med højt fruc-15 toseindhold.

Eftersom enzymer almindeligvis er vandopløselige og generelt er instabile og derfor udsat for desaktivering, er de vanskelige at fjerne til genanvendelse fra opløsninger, hvori de anvendes, og de vil ofte ikke bibeholde deres kata-20 lytiske aktivitet over udstrakte tidsrum. Disse-vanskeligheder fører til forøgede omkostninger ved anvendelsen af enzymer ved operationer i kommerciel målestok på grund af nødvendigheden af hyppig fornyelse af enzymet.

Til formindskelse af de høje omkostninger ved enzym-25 fornyelse er der blevet udviklet forskellige metoder til immobilisering eller insolubilisering af enzymer forud for deres anvendelse. Denne immobilisering af enzymet tillader dets genanvendelse, idet det ellers kan undergå desaktivering eller gå tabt i det reaktionsmedium, hvori det anvendes.

30 Disse immobiliserede enzymsystemer kan anvendes i forskellige reaktionsbeholdersystemer, f.eks. i pakkede kolonner og omrørte tankreaktionsbeholdere, afhængigt af naturen af det substrat, der omsættes biokemisk.

Der er blevet beskrevet mange generelle metoder og 35 mange modifikationer deraf, ved hjælp af hvilke der kan gennemføres en immobilisering af enzymer.

O

DK 164819 B

2 I OS patentskrift nr. 3.796.634 er der beskrevet en iiranobiliseringsmetode, der involverer absorption af en poly-amin på overfladen af partikler af kolloidal størrelse, tværbinding af polyaminen med et konventionelt amin-reaktivt 5 tværbindingsmiddel, f.eks. glutaraldehyd, behandling af det resulterende reaktionsprodukt med NaBH^ til reduktion af aldehydgrupperne og dermed hindring af enhver kovalent binding mellem aldehydgrupperne og enzymets aminogruppe, og absorption af enzymet på den behandlede overflade af partik-10 len ved en sådan pH-værdi, at den kolloidale absorbant bærer en elektrisk nettoladning, der er modsat ladningen af enzymmolekylerne således, at ionisk binding støtter andre ikke--kovalente bindingskræfter. Det nævnte patentskrift beskriver absorbantpartiklerne med en størrelse varierende fra ca.

15 50 til ca. 20.000 Ångstrøm (Å) , fortrinsvis fra ca. 100 til ca. 200 Ångstrøm i diameter, idet absorbantmaterialet er aktiveret trækul, hydroxylapatit, aluminiumoxid C-gamma og bentonit. Dette system er afhængigt af ladnings-interaktio-ner for binding af enzymet til de behandlede partikler. Den-20 ne type binding er mindre ønskelig end dannelsen af kovalente bindinger, fordi ioniske interaktioner er udsat for omgivelsernes betingelser i forhold til denne type binding, f.eks. pH-værdi, ionstyrke og temperatur.

I Biotechnol. Bioeng. 17, 1695-1696 (1975) beskrives 25 der en immobiliseringsmetode for lactase på granulært carbon, hvilken metode involverer absorption af p-aminophen-ol eller l-phenol-2-amino-4-sulfonsyre på carbonet. Disse absorberede forbindelser tilvejebringer de aminogrupper, hvormed glutaraldehyd reagerer og derpå binder enzymet. De 30 nævnte aminogruppeholdige forbindelser er monomere, der har andre kemiske og fysiske egenskaber end en polyamin såsom polyethylenimin.

En gruppe forskere (Cho et al., Immobilization of Enzymes on Activated Carbon: Properties of Immobili-35 zed Glycoamylase, Glucose Oxidase and Gluconolactonase, Biotechnol. Bioeng. 2J), 1651-1665 (1978)) har også immobiliseret

DK 164819 B

3 enzymer på granulært carbon ved kovalent binding. Ved denne metode aktiveres carbon med et carbodiimid, som derpå sætter enzymet i stand til at erstatte carbodiimidet og danne et enzym-carbon-kompleks.

5 I US patentskrift nr. 4.141.857 er der beskrevet en metode til enzym-immobilisering, der involverer behandling af et uorganisk, porøst bærermateriale, f.eks. gamma-alu-miniumoxid med porediametre på fra ca. 100 til ca. 55.000 Ångstrøm og et overfladeareal på fra ca. 100 til ca. 500 m2 10 pr. gram, med en opløsning af en vandopløselig polyamin og tilvejebringelse af kontakt mellem det behandlede bærermateriale og en opløsning af et bifunktionelt, monomert materiale, f.eks. glutaraldehyd. Ved denne behandling efterlades det behandlede bærermateriale egnet til reaktion med 15 enzymet således, at der dannes kovalente bindinger mellem enzymet og de tilstedeværende aldehydgrupper. I eksempel II i det nævnte patentskrift er der beskrevet fremstillingen af et immobiliseret enzymkonjugat ved behandling af porøse aluminiumoxidkugler sekventielt med opløsninger af poly-20 ethylenimin, glutaraldehyd og glucoamylase.

Anvendelsen af aktiveret granulært carbon har opnået ringe opmærksomhed som en bærer for immobiliserede enzymer til trods for dette materiales mange attraktive egenskaber og rimelige pris. Granulært carbon anvendes industrielt til 25 rensning af sirupper og andre næringsmiddelprodukter, farmaceutiske produkter, organiske syrer og forskellige andre kemikalier under anvendelse af kontinuerlige kolonne-per-kolationsprocesser.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde 30 til fremstilling af et immobiliseret enzymkonjugat, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man a) bringer porøst, granulært, aktiveret carbon i kontakt med en opløsning af en polyaminforbindelse med vedhængende aminogrupper, 35 b) fjerner vand og enhver ubundet polyamin dispergeret deri fra kontakt med carbonet og bringer det i kontakt med en

DK 164819B

4 vandig dispersionsopløsning af et amin-reaktivt materiale, der er et multifunktionelt aldehyd, et multifunktionelt organisk halogenid, et multifunktionelt anhydrid, en multifunktionel azoforbindelse, et multifunktionelt iso-5 thiocyanat eller et multifunktionelt isocyanat, c) fjerner vand og ethvert uomsat amin-reaktivt materiale dispergeret deri fra kontakt med carbonet og bringer carbonet i kontakt med en vandig opløsning af det enzym, der skal immobiliseres.

10 Det granulære carbon, der er egnet til anvendelse i forbindelse med den foreliggende opfindelse,' vil typisk have en partikelstørrelse fra 12 til 40 mesh i U.S. Sieve Series.

Poredimensionerne vil fortrinsvis ligge i radieområder fra 35 Å til 1000 Å, idet det granulære carbonbærermateriale har 2 15 et overfladeareal fra 200 til 600 m pr. gram.

Specifikke eksempler på polyaminer, der er egnede til den her omhandlede anvendelse, omfatter polyethylendia-min, en polyethylenimin såsom polydiethylentriamin, polytr iethylentetramin, polypentaethylen-hexamin eller poly-20 hexamethylendiamin. Andre egnede polyaminer er- polymethylen-dicyclohexylamin, polymethylendianilin, polytetraethylen-pentamin og polyphenylendiamin. En copolymer af en epihalo-hydrin og en alkylenpolyamin har også vist sig at være egnet. Selv om polyaminens molekylvægt ikke antages at være kritisk, 25 foretrækkes polymere med en molekylvægt i området fra 500 til 100.000. De polyaminer, der er vandopløselige, tilsættes carbonet fra deres vandige opløsninger, medens ikke-vand-opløselige polymere tilsættes fra organiske opløsningsmidler, f.eks. methylalkohol, ethylalkohol, propylalkohol, isopropyl-3° alkohol, tert.butylalkohol, acetone, methylether, ethylether, propylether, isopropylether, toluen, benzen, xylen, hexan, cyclopentan og cyclohexan. Kontakt mellem carbonet og poly-aminopløsningen, der normalt vil have en koncentration på fra 1 til 100 gram polymer pr. liter opløsningsmiddel, be-35 virker, at polymeren bliver bundet til overfladen af carbon-partiklerne. Medens en del af den polymere vil forventes at

DK 164819 B

O

5 blive absorberet til overfladen af carbonpartiklerne, vil en hovedmængde blive trukket ind i porerne af den porøse bærer således, at makromolekylet rager ud fra porerne og efterlader de funktionelle grupper (aminogrupper) tilgængelige for 5 yderligere reaktion. Dette er i kontrast til den metode, der er beskrevet i det ovennævnte US patentskrift nr. 3.796.634, hvor carbonpulver behandles med en opløsning af polyethylen-imin til ændring af dets overfladeladning og dermed tillade absorption af enzymet på den modificerede bærer. Denne me-10 tode beror på ladnings-interaktion, der er meget mindre ønskelig end de kovalente bindinger, der dannes ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse. Det behandlede carbon fjernes fra kontakt med polyaminopløsningen, f.eks. ved filtrering, og vaskes fortrinsvis med afioniseret vand (DI) 15 til fjernelse af enhver ikke-adhærerende polymer.

Det polymerbehandlede carbon behandles dernæst med en opløsning af et* multifunktionelt amin-reaktivt materiale , f.eks. glutaraldehyd, bis-diazobenzidin-2,2'-disulfonsyre, 4,4'-difluor-3,3'-dinitro-diphenylsulfon, diphenyl-4,41-di-20 thiocyanat-2,2'-disulfonsyre, 3-methoxy-diphenylmethan-4,4'- -diisocyanat, toluen-2-isocyanat-4-isothiocyanat, toluen--2,4-diisothiocyanat, diazobenzidin, diazobenzidin-3,3'-di-anisidin, N,Ν'-hexamethylen-bisiodoacetamid, hexamethylen--diisocyanat, cyanursyrechlorid eller l,5-difluor-2,4-di-25 nitrobenzen, ved at bringe det i kontakt med en vandig opløsning af midlet, fortrinsvis indeholdende fra ca. 1 til ca. 100 gram pr. liter af det amin-reaktive middel. Efter at reaktionen har fået lov at forløbe i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til at tillade, at aldehydet derivatiserer de frie 30 aminogrupper, fjernes det behandlede carbon fra aldehydopløsningen og vaskes fortrinsvis flere gange med afioniseret vand. Det her anvendte udtryk "derivatisere" skal betegne dannelsen af et reaktionsprodukt mellem den funktionelle aminogruppe i det polymermolekyle, der er bundet til carbo-35 net, og den amin-reaktive del af de amin-reaktive midler.

DK 164819 B

6 O ' ~

Ethvert enzym indeholdende en aminogruppe, der er i stand til at reagere med den amin-reaktive del, som er bundet til det polymermateriale, der er indesluttet og absorberet i porerne af det granulære carbon, kan immobiliseres ved 5 hjælp af denne metode. Enzymerne kan f.eks. omfatte trypsin, papain, hexokinase, ficin, bromelin, mælkesyredehydrogenase, lactase, glucoseisomerase, glucoamylase, chymotrypsin, prona-se, acylase, invertase, amylase, glucoseoxidase, pepsin, rennin og svampe-protease. Det derivatiserede carbon blan-10 des med en vandig opløsning af enzymet. Dette kan udføres i en batchreaktionsbeholder eller i en kolonnereaktionsbeholder. Fjernelse af carbonet fra enzymopløsningen med påfølgende vaskning med vand tilvejebringer det carbon-immobili-serede enzym egnet til anvendelse ved biokatalytiske omdan-15 neiser.

En af de uventede iagttagelser i forbindelse med den her omhandlede immobiliseringsmetode er, at det granulære carbon bliver sejere i den forstand, at der frembringes faarre fine partikler ud fra de behandlede partikler end ud fra 20 de, der er ubehandlede. Denne egenskab, der er meget betydningsfuld i forbindelse med en heterogen biokatalysator, illustreres ved hjælp af det følgende forsøg:

Fem prøver af granulært carbon behandles med varierende koncentrationer af polyethylenimin (PEI) på fra 0 til 25 0,5% (vægt/rumfang i vand). Efter PEI-behandlingen vaskes carbonprøverne og behandles derpå med 1%' s glutaraldehyd ’ (GA) (vægt/rumfang i vand), ved en pH-værdi på 9,0 i 0,02 M boratpuffer. Prøverne i glutaraldehydopløsningen anbringes på et -roterende rysteapparat og omrystes i 4 timer. Væsken 30 dekanteres derefter fra carbonet, og graden af fine carbon-partikler i suspension bedømmes efter en relativ skala fra 0 til 5. En værdi på 0 svarer til ingen iagttagne fine car-bonpartikler, medens en værdi på 5 repræsenterer en suspension af fine carbonpartikler, der er fuldstændig opak. Den 35 følgende tabel indeholder en sammenstilling af de grader af fine carbonpartikler, der dannes under omrystningen.

O

DK 164819B

7

Fine carbonpartikler dannet ved omrøring af PEI-behandlet granulært carbon i 1%'s GA-opløsning_ PEI-Behandling Suspenderede fine partikler

Kontrol, ingen PEI 5 5 0,015% PEI 3 0,05% PEI 2 0,15% PEI 1 0. 5. PEI 0,5 10 Det beskyttende overtræk eller lag, der øjensynligt dannes på de granulære carbonpartikler, ses at være afhængigt af den tilstedeværende mængde PEI. Ikke blot bevirker denne proces fiksering af enzymer til carbonpartiklerne, men den bevirker også forstærkning af carbonpartiklerne til for-15 mindskelse af deres nedbrydning.

Et andet enestående træk ved den her omhandlede immobiliseringsproces består i, at tidligere anvendt granulært carbon kan genanvendes til immobilisering efter regenerering ved hjælp af en simpel proces, der omfatter en base-syre-vask. 2o Dette træk ved processen er signifikant, fordi det eliminerer ethvert bortskaffelsesproblem for brugeren og ligeledes giver en potentiel økonomisk besparelse. Dette regenereringspotential eksemplificeres ved et forsøg, hvor granulært carbon, der har enzym immobiliseret dertil ved PEI-GA-proces-25 sen, tørres og regenereres som følger: 1. 50 ml tørt carbonkompleks opslæmmes i DI-vand og vaskes med flere rumfang DI-vand.

2. Vandet dekanteres fra, og der tilsættes 250 ml 0,5 N NaOH, der blandes i flere minutter, og der henstilles i 1 time.

30 3. Den alkaliske opløsning dekanteres, og carbonet vaskes med en rigelig mængde vand.

4. Efter dekantering af vandet tilsættes der 250 ml 0,5 N HC1, der blandes i flere minutter, og blandingen henstilles i 1 time.

35 5. Syren dekanteres, og der vaskes med en rigelig mængde vand, indtil pH-værdien af vaskevandet er 3,6.

O

DK 164819 B

8

Det carbon, der regenereres på denne måde, anvendes derpå til immobilisering af glucoamylase ved PEI-GA-metoden. Der fås en aktivitet på 110 enheder pr. ml carbon, hvilket stemmer meget godt med de 130 enheder pr. ml, der opnås ved 5 anvendelse af en frisk mængde granulært carbon til immobilisering.

Ved immobiliseringsproceduren dannes der en binding mellem enzymet og den polymere, som er absorberet til det granulære carbon, der er usædvanlig stabil, og det har vist 10 sig, at carbonpartiklerne ikke bliver overtrukket eller forurenet med proteiner eller andre stoffer, når en rå opløsning af flydendegjort majsstivelse ledes gennem et lag af det immobil iser ede enzym.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres nærmere 15 i de følgende eksempler, i hvilke alle sigtestørrelser er baseret på U.S. Standard Sieve Series.

Eksempel 1

Immobilisering af amyloglucosidase på PEI-derivatiseret 20 granulært carbon. t —

Inden anvendelsen til immobilisering syrevaskes car-bonet på følgende måde: 1. 100 ml -20+40 mesh-aktiveret granulært carbon (Darco) blandes med koncentreret saltsyre og får lov at henstå 25 ved stuetemperatur i flere timer. Der anvendes tilstræk kelig syre til fuldstændig nedsænkning af carbonet.

2. En stor mængde afioniseret vand sættes derpå til carbon-opslæmningen, og der dekanteres, efter at carbonet er afsat.

30 3. Vaskningen med vand fra trin 2 gentages flere gange.

4. Carbonet overføres til en glaskolonne (2,6 cm x 70 cm), og vand perkoleres gennem laget, indtil den gennemstrømmede mængde når en pH-værdi på 3,5.

5. Carbonet fjernes derefter fra kolonnen og opbevares i vand 35 ved stuetemperatur.

DK 164819 B

9

Glucoamylase immobiliseres ved stuetemperatur ved anvendelse af følgende procedure: 1. 100 ml af en 4%'s opløsning af PEI-600 (Dow, polyethylen-imin med molekylvægtsområde 40.000-60.000) sættes til 5 10 ml syrevasket granulært carbon i en 250 ml rundbundet kolbe, og der omrøres forsigtigt i flere timer.

2. Polyaminen dekanteres derpå, og carbonet vaskes med rigelige mængder vand.

3. De immobiliserede aminogrupper absorberet på carbonet 10 derivatiseres med glutaraldehyd ved hjælp af 200 ml af en 1%'s glutaraldehydopløsning, hvis pH-værdi er indstillet på 9,0. Reaktionen får lov at fortsætte i 18 timer, idet pH-værdien holdes ved 9,0.

4. Glutaraldehydopløsningen dekanteres, og carbonet vaskes 15 med vand til fjernelse af uomsat glutaraldehyd.

5. 100 ml glucoamylase (AG, 2,5 ml Diazyme L-100, Miles Laboratories, Inc.)-opløsning, der er indstillet på en pH-værdi på 7,0 med fortyndet NaOH (2 N), sættes til det derivatiserede carbon. Under forsigtig omrøring i flere 20 timer holdes reaktionsblandingens pH-værdi-på 7,0.

6. Enzymopløsningen dekanteres, og det immobiliserede enzym vaskes med vand.

Aktiviteten og stabiliteten af det immobiliserede enzym bestemmes ved flere ganges analyse deraf i en recirku-25 lations-differentialreaktionsbeholder som beskrevet af Ford et al. i Enzyme Engineering, Ed.Wingard, Jr., L.B., pp. 267,

John Wiley & Sons, New York (1972). Bestemmelsen udføres ved 150°C, idet der som substrat anvendes Maltrin-15, der er en majsstivelse med lavt DE (dextrose-ækvivalent) (15-18) fra 30 Grain Processing Co., Muscatine, Iowa, i 0,02 M acetatpuffer ved en pH-værdi på 4,2. Til udførelse af bestemmelsen anbringes substratet i et reservoir, og den dannede mængde glucose anslås ved Glucostrate-metoden (General Diagnostics), idet begyndelseshastigheden for glucose dannet pr. minut bestemmes 35 ud fra en regressionsanalyse. Én enhed for aktivitet repræsenterer den mængde enzym, der danner 1 μιηοΐ glucose pr. minut under forsøgsbetingelserne.

DK 164819 B

10 o

Enzymet bestemmes tre på hinanden følgende gange med frisk substrat og med en puffer (0,02 M acetat, pH=4,2) -vask mellem hver bestemmelse til bestemmelse af stabiliteten af aktiviteten. De følgende resultater viser, at AG immo-5 biliseres på det derivatiserede carbon og bibeholder aktiviteten.

Aktivitet af AG immobiliseret på carbon ,u mol G ,u mol G ^ 10 Bestemmelse jmin./ml/enz.) lmin./g/enz.) 1 148 344 2 145 338 3 138 322 15 Eksempel 2

Immobilisering af bakterie alfa-amylase på PEI-derivatiseret carbon.

En 5 ml-mængde af PEI-glutaraldehyd-derivatiseret granulært carbon som i eksempel 1 anvendes til immobilisering 20 af bakterie alfa-amylase (Taka-Therm ®, Miles Laboratories, Inc.). Den enzymopløsning, der anvendes til behandling af det derivatiserede carbon, består af 1 ml Taka-Therm ®fortyndet til 50 ml med vand. Immobiliseringen udføres som beskrevet i eksempel 1. Efter at være blevet vasket med puffer (0,02 M 25 acetat indeholdende 10 mM CaCl2, pH=6,0), analyseres det resulterende immobiliserede præparat i differentialreaktions-• beholderen, idet der som substrat anvendes 4%'s opløselig stivelse i 0,02 M acetatpuffer ved. pH=6,0 indeholdende 10 mM CaCl2· Graden af stivelseshydrolyse bestemmes ved måling af 30 den mængde reducerende grupper, der dannes ved ferricyanid-metoden som beskrevet af Ghuysen et al. i Methods in Enzymo-logy, Vol. VIII, pp. 685, Academic Press, New York, 1966, hvor glucose anvendes som reference. Den immobiliserede alfa--amylase-aktivitet bedømmes at være 11,7 hhv. 9,5 enheder pr. 35 ml immobiliseret enzym ved på hinanden følgende bestemmelser.

DK 164819 B

11 o

Eksempel 3

Svampe-alfa-amylase immobiliseret på PEl-derivatiseret granu-lart carbon.

Svampe-alfa-amylase immobiliseres på derivatiseret 5 carbon som beskrevet i eksempel 2. En 50 ml enzymopløsning indeholdende 0,1 g Sumizyme LP-8 svampe-alfa-amylase (908 MMU/mg) indstilles på en pH-værdi på 7,0 og anvendes til behandling af 5 ml PEI-glutaraldehyd-derivatiseret carbon. Aktiviteten af det immobiliserede præparat måles som beskrevet 10 i eksempel 2, men med den undtagelse, at der som substratet anvendes 1% Martrin-10. Der fås en aktivitet på 5,2 og 5,5 enheder pr. ml immobiliseret enzym ved på hinanden følgende bestemmelser. Én aktivitetsenhed repræsenterer den mængde reducerende grupper, der dannes som målt ved ferricyanid-me-15 toden sonyumol glucose pr. minut.

Eksempel 4

Soja-beta-amylase immobiliseret på PEI-glutaraldehyd-deri-vatiseret granulært carbon.

20 Den i eksempel 2 anvendte procedure-benyttes til immobilisering af soja-beta-amylase. En 50 ml enzymopløsning (0,1 g af en lyofiliseret prøve med 182 enheder pr. g) indstillet på en pH-værdi på 7,0 anvendes til behandling af 5 ml af det PEI-derivatiserede carbon. Det immobiliserede enzym-25 præparat analyseres i differentialreaktionsbeholderen under anvendelse af de analysebetingelser, der er angivet i eksempel 2. Der fås på hinanden følgende bestemmelser på 2,6 og 2,4 enheder pr. ml immobiliseret enzym.

30 Eksempel 5

Malt-amylase immobiliseret på PEI-glutaraldehyd-derivatise-ret granulært carbon.

En 100 ml opløsning af malt-amylase med en pH-værdi på 7,0 (0,2 g. Mylase-Wallerstein Lab.) anvendes til behand-35 ling af 10 ml PEI-derivatiseret granulært carbon ved den metode, der er beskrevet i eksempel 2. Det immobiliserede en-

DK 164819 B

O

12 zympræparat analyseres i en differentialreaktionsbehoIder som beskrevet i eksempel 2 under anvendelse af 4%'s opløselig stivelse som substrat. Der fås en aktivitet på 1,8 enheder pr. ml immobiliseret enzym. Det skal bemærkes, at ved 5 mange af bestemmelserne med granulært carbon kan substrat og produktabsorption øve indflydelse på de faktiske hastigheder som beskrevet af Cho et al. i Biotechnol. Bioeng.

20, 1651 (1978).

10 Eksempel 6

Hvede-beta-amylase immobiliseret på PEI-glutaraldehyd-deri-vatiseret granulært carbon.

En mængde på 0,2 g hvede-beta-amylase (lyofiliseret pulver med 140 MMU/mg) i 100 ml DI-vand (pH=7,0) anvendes 15 til behandling af 10 ml PEI-glutaraldehyd-derivatiseret carbon under anvendelse af den fremgangsmåde, der er beskrevet i eksempel 2. Aktiviteten af dette præparat findes at være 1,6 enheder pr. ml immobiliseret enzym under anvendelse af 4%’s opløselig stivelse ved en pH-værdi på 6,0 som substrat 20 i en differentialreaktionsbeholder. -

Eksempel 7

Pullulanase immobiliseret på PEI-glutaraldehyd-derivatiseret granulært carbon.

25 Pullulanase immobiliseres på en måde svarende til den procedure, der er beskrevet i eksempel 7, ved behandling af 10 ml derivatiseret carbon med 100 ml af en opløsning med en pH-værdi på 7,0 af pullulanase fremstillet ved opløsning af 0,2 g pullulanase (A.B.M. Chemicals Ltd., Sample K 1000) 30 i 100 ml DI-vand. Enzympræparatets aktivitet bestemmes i en recirkulations-differentialreaktionsbeholder ved 50°C, idet der som substrat anvendes 0,2% pullulan i 0,02 M acetatpuffer ved en pH-værdi på 5,5. Graden af nedbrydning af pullulan bestemmes ved hjælp af forekomsten af reducerende grup-35 per. De reducerende grupper bestemmes ved ferricyanid-meto-den under anvendelse af glucose som reference. Produktionen

DK 164819 B

O

13 af reducerende grupper afsættes som en funktion af tiden, og ud fra det frembragte diagram bestemmes det, at der ved 15 minutters reaktion er nedbrudt eller fordøjet 15% af pul-lulanen.

5

Eksempel 8

Glucoseisomerase immobiliseret på PEI-glutaraldehyd-derivati-seret granulært carbon.

Opløselig glucoseisomerase (GI) fås ved behandling 10 af vaskede celler af Streptomyces olivaceus med fortyndet detergent (0,1% Lubrol WX) og centrifugering til fjernelse af cellerester. En mængde på 100 ml opløselig GI ved en pH--værdi på 7,0 indeholdende 2 aktivitetsenheder pr. ml (enhed =yurool fructose pr. min.) anvendes til behandling af 10 ml 15 derivatiseret granulært carbon som beskrevet i eksempel 2.

Aktiviteten findes at være 2,2 enheder pr. ml immobiliseret enzym i differentialreaktionsbeholderen ved 60°C under anvendelse af et substrat indeholdende 2 M glucose, 4,1 mM MgS0^*7 H2O, 2,4 mM NaHSO^ og 20 mM tris-maleinatpuffer med 20 en pH-værdi på 8,0. Den dannede mængde fructose bestemmes ved cystein-H^SO^-metoden.

Eksempel 9

Svampe-lactase immobiliseret på PEI-glutaraldehyd-derivati-25 seret granulært carbon.

Svampe-lactase immobiliseres på derivatiseret granulært carbon ved den metode, der er beskrevet i eksempel 2, men med den undtagelse, at den 1%'s glutaraldehydopløsning puf res med 0,05 M borat ved en pH-værdi på 9,0, og enzymop-30 løsningen pufres med 0,05 M natriumphosphat ved en pH-værdi på 7,0. Lactaseopløsning (50 ml 0,1 g Miles laboratories,

Inc. svampe-lactase, 14.280 FCCLU/g) anvendes til behandling af 10 ml PEI-derivatiseret carbon. Aktiviteten af enzympræparatet måles ved 55°C i differentialreaktiosbehoIderen, i-35 det der som substrat anvendes 0,15 M lactose i 0,02 M acetatpuffer med en pH-værdi på 4,5. Nedbrydningen af lactose sty-

DK 164819 B

O

14 res ved den mængde glucose, der dannes som bestemt ved Glu-costrate-metoden. Aktiviteten findes at være 38 enheder pr. ml immobiliseret enzym.

5 Eksempel 10

Indflydelse af molekylstørrelse af PEI på immobilisering af amyloglucosidase.

I de foregående eksempler derivatiseres der kun én type polyamin (Dow PEI-600, molekylvægtsområde 40.000-60.000) 10 På granulært carbon. I dette eksempel anvendes der PEI'er med andre molekylvægte til bestemmelse af indflydelsen på enzymbindingen. Til dette forsøg anvendes der 50 ml opløsninger af 1%'s PEI-18 (molekylvægt 1.800), 2%'s PEI-200 (molekylvægt 20.000-30.000) og 1%‘s PEI-600 (molekylvægt 40.000-15 -60.000) til behandling af 10 ml syrevasket granulært carbon.

Metoden til derivatisering af carbonet svarer til den, der er beskrevet i eksempel 1, men med den undtagelse, at glutar-aldehydopløsningen pufres med 0,05 M borat ved en pH-værdi på 9,0. Også AG-opløsningen (2 ml Miles1 Diazyme L-100 for-20 tyndet til 50 ml) pufres med 0,05 M phosphat -ved en pH-vær-di på 7,0.

Enzymaktiviteten af præparaterne bestemmes i en re-cirkulations-differentialreaktionsbeholder som beskrevet i eksempel 1. Aktiviteterne fremgår af den følgende tabel.

25

Derivatiseret carbon Aktivitet j(umol G/min./ml iromob. enz.) PEI-18 252 PEI-200 232 PEI-600 179 30 Disse resultater viser, at der kan anvendes et bredt område af PEI-molekylvægte til immobilisering af enzymet, men størrelsen af polyaminmolekylet har indflydelse på den mængde enzym, der immobiliseres. Størrelsen af det PEI--molekyle, til hvilket enzymet er bundet, kan også påvirke 35 den produktprofil, der fås ved digestion af flydendegjort stivelse gennem et sterisk fænomen eller et massetransport-fænomen.

DK 164819B

O

15

Eksempel 11

Immobilisering af AG på Betz 1180-glutaraldehyd-derivatiseret granulært carbon.

I dette eksempel anvendes der en anden type poly-5 amin i stedet for polyethylenimin til immobilisering af AG.

Til dette forsøg anvendes der som polyamin Betz 1180, der markedsføres under handelsnavnet Betz 1180 af Betz Laboratories, Inc., Trevose, Pennsylvania, og er en vandopløselig, kationisk polymer, der fås ved polymerisation af en epihalo-10 hydrin med en alkylenpolyamin. Den har en molekylvægt på mindre end 1 million, indeholder ca. 0,288 millimol aminogrup-per pr. gram opløsning (baseret på ninhydrin-bestemmelse) og markedsføres som en opløsning indeholdende 30 vægtprocent faste stoffer, beregnet på den totale opløsningsvægt. En 15 mere detaljeret beskrivelse af denne polymer og dens fremstilling kan findes i US patentskrifterne nr. 3.915.904 og nr. 3.953.330. Trinene omfattende polyaminabsorption, amino-gruppeaktivering og enzymimmobilisering svarer til de i eksempel 1 beskrevne. Aktiviteten af præparatet bestemmes som i 20 eksempel 1 og fås som 236 enheder pr. ml immobiliseret enzym. Dette eksempel viser, at andre polyaminer end polyethylenimin med vedhængende aminogrupper er egnede til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

25 Eksempel 12

Immobilisering af glucoseisomerase på dobbelt PEI-derivatise-ret granulært carbon.

Afstanden mellem det immobiliserede enzym og bæreren, og fleksibiliteten af det immobiliserede enzym med hen-3Q syn til bæreren kan ændres ved at omsætte en polyamin i stedet for enzymet med den absorberede derivatiserede polyamin, efterfulgt af derivatisering af den nye polyamin med glutar-aldehyd til enzymimmobilisering. Denne teknik blev forsøgt ved først at absorbere en polyamin (PEI eller Betz 1180) på 35 syrevasket granulært carbon, derpå at omsætte aminogrupperne med glutaraldehyd, derefter at binde en polyamin kovalent

DK 164819 B

O

16 til aldehydgruppen i glutaraldehyd og dernæst at aktivere arainogruppen med glutaraldehyd og endelig at foretage immobilisering af enzymet.

Forsøgsbetingelserne svarer til de, der er beskre-5 vet i eksempel 11 for polyamin- og glutaraldehyd-trinene, men med undtagelse af den anden polyaminbehandling, ved hvilken polyaminen anvendes i 0,05 M boratpuffer ved en pH-vær-di på 9,0. Der fremstilles fire prøver under anvendelse af kombinationer af PEI-600 og Betz 1180. Det enzym, der anven-10 des til immobilisering, er GI som beskrevet i eksempel 8. Aktiviteterne af de fremstillede prøver er angivet i den følgende tabel under anvendelse af den bestemmelsesmetode, der er beskrevet i eksempel 8.

15 Aktivitet Cumol/fructose/

Prøve min./ml immob. enz.)_ 1. PEI-GA-PEI 4,4 2. PEI-GA-Betz 4,3 3. Betz-GA-PEI 4,8 20 4. Betz-GA-Betz 4,5 -

Aktiviteten af alle præparaterne er højere end for den immobiliserede GI ifølge eksempel 8. Det er muligt, at denne metode til immobilisering kan have forøget enzymbelast-25 ningen eller -ladningen på carbonpårtiklerne, sammenlignet med de 2,2 enheder pr. ml af immobiliseret enzym for det PEI-derivatiserede carbon, der anvendes ifølge eksempel 8.

Eksempel 13 30 Præparativ teknik til immobilisering af AG på Betz 1180--derivatiseret carbon.

I alle de foranstående eksempler udføres der enzym--immobilisering batchvis. Dette eksempel giver resultaterne af en immobilisering af AG på et bærerrumfang på 300 ml un-35 der anvendelse af kolonneteknik.

O

DK 164819 B

17

Procedure (alle trin udført ved stuetemperatur): 1. 300 ml Darco 20/40-mesh aktiveret granulært carbon gen-nemfugtes med koncentreret HC1 i flere timer.

2. Overskud af HC1 dekanteres, og carbonet vaskes med rige- 5 lige mængder DI-vand.

3. Carbonet overføres til en 2,6 cm x 70 cm glaskolonne, og vaskningen fortsættes ved perkolering af vand gennem laget, indtil den udstrømmende væskes pH-værdi når 3,9.

4. En 2 liters opløsning af polyamin (40 g Betz 1180 for- 10 tyndet med DI-vand) perkoleres derpå gennem laget. Efter at hele opløsningen er passeret gennem laget, recirkuleres opløsningen i opadgående strømning gennem laget i 4 timer.

5. Overskud af polyamin vaskes derefter fra carbonet ved vask- 15 ning med 4 liter vand (i opadgående strøm).

6. 1,5 liter 1%'s glutaraldehyd i 0,02 M boratpuffer med pH=9,0 perkoleres derpå gennem laget og recirkuleres derefter i opadgående strømning i ca. 16 timer.

7. Overskud af glutaraldehyd vaskes derpå fra carbonet med 20 vand på lignende måde som i trin 5.

8. 1,5 liter enzymopløsning (60 ral Diazyme) i 0,02 M phos-phatpuffer med pH=7,0 perkoleres gennem laget og recirkuleres dernæst i opadgående strømning i ca. 5 timer.

9. Overskudet af enzym vaskes derpå fra laget som beskrevet 25 i trin 5.

10. Der perkoleres derefter ca. 7 liter 0,02 M citratpuffer med pH 4,2 gennem laget over et tidsrum på ca. 18 timer, og pH-værdien af den udstrømmende væske er derefter 4,2.

30 11· Det immobiliserede enzympræparat fjernes fra kolonnen og opbevares i 0,02 M citratpuffer ved en pH-værdi på 4,2.

Aktiviteten af det immobiliserede AG-præparat målt i differentialreaktionsbeholderen som beskrevet i eksempel 35 1 er 236 enheder pr. ml immobiliseret enzym. Som det frem-

O

18

DK 164819 B

går af dette forsøg, frembyder upscaling til store mængder ikke nogen iboende problemer ved immobilisering.

Eksempel 14 5 I dette sammenligningseksempel beskrives der yder ligere forsøg, ved hvilke aluminiumoxid og carbon sammenlignes som bærere ved immobiliseringen af enzymer. Bærernes fysiske egenskaber er opregnet i den følgende tabel I, og adskillige forskellige parametre er sammenlignet.

10 I ét forsøg immobiliseres amyloglucosidase (AG) til 2 bærermaterialer (aluminiumoxid og carbon) under anvendelse af PEI/glutaraldehyd under identiske betingelser. Eftersom en af de betydningsfulde egenskaber af carbon er, at det kan regenereres ved' en base-syre-vask, underkastes begge 15 bærere en mild syre-base-behandling inden immobilisering af enzymet. Ved disse forsøg blandes bærermaterialet med syren eller basen i et rysteapparat i ca. 2 timer og får derpå lov at henstå natten over. Reagenset dekanteres derpå, og bæreren vaskes med store mængder vand inden dens behandling 20 ved immobiliseringsprocessen. Resultaterne af_disse forsøg er sammenstillet i tabel la.

25 30 35 19 o

Tabel I

Egenskaber af aluminiumoxid og granulært carbon.

1 2 Aluminiumoxid Carbon 5 Partikelstørrelse (mesh size) 24/48 20/40

Porevolumen (ml/g) 0,30 0,95

O

Gennemsn. porediameter (A) 45 200

Overfladeareal (m^/g) 210 600

"*0 '*'Aktiveret aluminiumoxid kvalitet F1 fra Alcoa, Pittsburgh, PA

2

Aktiveret granulært carbon fra Darco, Wilmington, DE

Tabel la

Virkning af syre- og alkali-forbehandling af aluminiumoxid 15 og carbon ved binding af glucoamylase ved PEI-GA-metoden.

Enzym tilsat til Ubundet Bundet enzym*5 bærera enzym -—

Behandling_(enheder) (ml bærer) (%)_(%) (enheder) (ml barer)

Aluminiumoxid 20 Ingen behandling 110 46 29 ~ 33,9 HC1 (0,6 N) 110 71 10 11,9

NaOH (0,25 N) 110 55 26 29,5

Carbon

Ingen behandling 110 0 70 81,0 25 HC1 (0,6 N) 110 0 79 91,1

NaOH (0,25 N) 110 0 76 87,0 aaktivitet bestemt ved inkubering ved 50°C i 60 min. under anvendelse som substrat af 10% Maltrin-15 puf ret ved pH 4,2 med 20 mM citrat.

1 aktivitetsenhed repræsenterer den mængde enzym, som danner 1 .umol glucose pr. minut.

00 ^aktivitet af immobiliseret enzym bestemmes under lignende betingelser som ovenfor ved inkubering af enzymet i en kolbe anbragt i et omrystet vandbad. 1 aktivitetsenhed har samme definition som ovenfor (a).

35 20

DK 164819 B

o

De resultater, der er sainmenstillet i tabel la, viser, at med ingen forudgående behandling af bæreren er car-bonet mere effektivt til binding af alt enzym. Aluminiumoxid er øjensynligt mere specifikt ved dets binding, idet det ef-5 terlader ca. 50% af enzymet ubundet. Syrebehandling af aluminiumoxid ændrer øjensynligt strukturen af aluminiumoxid på en sådan måde, at bindingskapaciteten af denne bærer formindskes, hvilket fremgår af den større mængde aktivitet, der forbliver ubundet, og af den lavere immobiliserede aktivi-10 tet (enheder pr. ml). Behandling af aluminiumoxid med en base har imidlertid kun lille virkning. Syre- eller base-behandling af carbon kan ses at have i det væsentlige ingen indflydelse på carbonets bindingskarakteristika. Disse resultater viser, at der er en fundamental forskel med hensyn til 15 de relative bindingsegenskaber og de indifferente egenskaber af bæreren overfor en mild syre- eller base-behandling.

En anden forsøgsrække udføres til bedømmelse af virkningsprofilen for immobiliseret AG og dens stabilitet på begge bærere ved nedbrydning af flydendegjort majsstivelse. Amy-20 loglucosidasen immobiliseres på begge bærere "uden forudgående syre- eller base-behandling.

Tabel II

Sammendrag af immobilisering af amyloglucosidase til aluminium-25 oxid og carbon for integralt kolonnestudium.

Ubundet Bundet enzym

Enzym tilsat bærer enzym - Bærer_(enheder) (ml bærer)-1 (%)_(%) (enheder) (ml bærer)

Aluminiumoxid 106 45 . 24 25,7 30 Carbon 106 2 73 77,3 *"100 ml aluminiumoxid (28/48 mesh) og carbon (20/40 mesh) anvendes til at immobilisere amyloglucosidase (Diazyme L-100) under anvendelse af PEI-GA-processen.

35 21 -

Tabel II indeholder en sammenstilling af enzymfordelingen under immobiliseringsprocessen. Der anvendes kolonnereaktionsbeholdere (100 cm x 1,5 cm glaskappekolonher) til fremstilling af kolonner indeholdende ækvivalente mængder 5 af hvert immobiliseret enzym. Til dette forsøg anvendes der kolonner, der består af et 10 ml lag af AG bundet til carbon og et 30 ml lag af AG bundet til aluminiumoxid. Begge kolonner fødes med 25 DE (dextrose-ækvivalent) uraffineret alfa-amylase-flydendegjort majsmel indstillet til 23% DS 10 ("dry solids") og indeholdende 250 dpm (dele pr. million) S02 puf ret med 5 mM citrat ved pH = 4,2. Substratet perkoleres gennem lagene ved en konstakt strømningshastighed på ca. 10 ml pr. time. Kolonnerne holdes ved en konstant temperatur ved cirkulation af vand af 50"G gennem kolonnekappen. 15 Til bestemmelse af graden af nedbrydning opnås carbonhydrat-profilen ved at underkaste den fra kolonnen udstrømmende væske en periodisk HPLC-adskillelse. Carbonhydratprofilerne af nedbrydningsprodukterne med AG bundet til aluminiumoxid og carbon er sammenstillet i tabellerne III og IV. I disse 20 tabeller er der også angivet den nominelle reaktionstid og DE-værdierne. De nominelle reaktionstider er længere for den AG, der er bundet til aluminiumoxid, på grund af dens større lagrumfang. Carbonhydratprofilerne er slående forskellige, omend begge enzymlag har identiske enheder for ak-25 tivitet (baseret på indledende aktivitet).

30 35

DK 164819 B

22 u

+3 I

tj ^ (TiCM'S'Or'-t'^CDCDCOCri··^ ri ΙΛ M CO H Æ tf CM

Z? ft ^No^cocoi^r^oi—i cm o m cm cm η Γ' i +1 LJHUH Q CMCMCMHrlrlHHCMNCM CM CM CM CM CM CM CM X 0)

m ΉΟ u Λ ft H

® +1 ° " jrj x g m 2 cor'-iomr'-mmcoocno oo o o m oo in cm -p

,ϊ 0)*Ο S <#> ft CJrlrlrlHrlHrlHOH OHHHOO·^ φ TJ

r, Ό 0) 2 — Cl ft G 3

J? c > g to -H

p^ ^ W rH g g ^ .Q Φ Ti -H o-3’ftco''3,rorocMCT>iO['' Μ^σίποπΗ rtj φ C j"j M—i m >.>.>.^^^k.>.^k.·. <k ».···>·»%. v p ™ Φ G ir o ft μήηηγιηηηοοο o o o r-ι h o p· *3 Di * ω o " P Ω ΓΜ (0 o ^ cd H qm o, ftp

Ujfl o g 4J I di

Λ,,-I^U φ OtffflHOCMCMTOCOO CO Η Η H ri lil O

" CO Q) 5-4 ^ < < v s k ^ < .(-] _{ i π O ft -!7 *& ft ^ HOrl HH HrIHOH ΟΗΗΗΗΟΐΠ PQ φ S o a 3 >t q α 3 d λ g m •n ft 34 b G 0) φ “' tji ω ^ O ooLoor'-^cwrorW cmcovooio nco N 0 yj Λ ro k.v^K^.k.svk.Ki.k w «. v s K s *. m φ

jj. pH »H ~ M ft lOOOnCNHHHHHrHH i—1 Η Η ΓΊ (N H LD (tf CO

„< >i^ £ Cd Q pH pH pH

* S e g u 0) Q) » «! £ .2 · m *3 ~ ϋ ^ Lnr'-vDCMCT^oo'tfomor^ o co o cm ^ σι οι h c “j H-l rr CM ^ ^ k. *. φ φ *T; Φ m 11 ft otfr'tf^coHtfinrM/i m m id ro Γ" r~ σι *3 >

ft -- Ω CMCMCMCMCMNCMHHHH HrlrlHrlrl G G

£ ΪΓΗ ft <D r0 (tf Q > P Η X r^^ooor^oorHOooo cn cnj cm oo Γ" £ nd ij H •»•‘“»‘k.k.SSSSS K k, ^ tk V v k. (¾ φ H |H H g ^ (¾ COCOinCOOCMtfHOM"1 ri f'ΓΜ» CM lil CO > H go, Ω Ncn’M'Ti'inimncovDinin co m m m m m p

H " φ G

P o o 5 *3 <u

η 0 co o +< cMininooconvDcD'i'auo cm 10 m o in co Η G H

φ IH ri U Λ rj .,.) Λ +> 2 ft cMHiDcocnocM’M'cnPri t ri Η h ojo in m

(ti ft 0) G S Ω ιηνονουονοΓ^Γ^Γ'Γ^Ρ'Γ' r^· r^· r^. ιο cm o O

Eh -h φ “ ft p iPO O ft ft p ffl -H S ffi +>

Pgy min inmin mmin mm Φ ft *3 ff P r^r^-mmcMCNojor^r^r' ommcMino *3 p +> Φ ft '1 η φ s k k k k k φ ιφ (ti οι X *"* id g hrimromhcM tf oomm tf comtf ajni > >, P H o JT +1¾ -ri HM* tf ODHCOtf coomm OCMCOinhO Xi

Ό dl g H O-rl+l ri r| ri ri CM CM CM (O (O CO Cl CO O1 +1 G

>, > 3 Em +> "" 0)0 ft Ή -ri Γ? Olti ft) g ft d £ g p ·

0 W ft f ft (ti P

-Q w ε P I O O (D

p -π 3 ζ* ω i—i (ti (ti H |o G rH(03

U ε (0 ^ H O r-k -HP-H

ΤΦ-Η p cn^cMcTir^r^rocN^-OrH σ m σ in σ tf (p mp gG+J φ (ΜσοσσσΜΗοοσσ oo γμ cm ro σι O Φ 'm -H +4 ε s ^ k k v 5^ Ό + V3 ε (ti T3 Ή (OCMCOCMCMCMCOnCMCMm CN ro CO ΓΟ ΓΜ CM ft p(ti ί, o φ -η +i +j ε ® 'z, P +J ^ (ti ω S P Φ Φ P *3*3+1 jj >1Φ tn*d

HG +i ft G Φ C

S O (ti G G P Φ

,¾ *H P O O Φ M

V +> +i ft*H jQ

JL JS4 in P O *3 S (ti rlCMCOM,mtfr'COWOHCMCOM'mtfM3!)rQ ΗΦ . , p i—li—li—li—li—li—li—li—li—I 3 o I Ω ε ft CO (ti Λ

DK 164819 B

23 KD ΠΗΟίηΟΓ^ΓΟΓ^ΓΟ^Π^ΟΙΗ^ΐΛ^ΟίΤι^ d) Q <riCTN<TiCr\ocri<T>aDCN'>3’'x>LnLnr'Vooon'3*i~'

Ό Λ H HrlHrlrldHrlHrltN

I c <U 0 · ΌΛΟ o cd C 0 ft οοοοοοοοοοοοοοοοοο» (U (U O Ω ^

Ό to in H

ϊ>ι (0 ·—·

I-H Ό 'O UP

Ή -ri Q) W in rH H

to > (ti ft ΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟ » H

ch O i-η Q rr H

- o 0) tH CN

'S' 0 C 4H rH

Ή f! O <D

æ tj> o p λ fil O rH fil ft οοοοοοοοοοοοοοοοοο·^ id

rH o +J Q - -P

H >1,* (0 tn

Q g φ P H

ni CL, Ό

in Pj >, ro HoooiomotnwcofflhcooiMOhMX) -P

rdmitj Æ ft »»»».»»»»»»»»»»»»»»» tj) id m c Ω i—ii—ii—i o H o i—iooooooooooolo >

Ή tn O rH -,H

id ty> (ti Xi D1 td rH Μ d dj ι-H tP (d Cd 'sJ'OinCTlCNrHOrHC'r'r'rHrHlOlO'a'lDrHfn (d tn u ft »»»»»»»»»»»»»»»*»*» rlH g Q MtSHHNfNHrHNnmnn'i'fsfHHn p <U g O 0) •o tn

Som (sounhOMrinNtDmoo^Tn<NfSh rH

ϋ H - rH »»»»»»»»»»»»»»»»»»» Q) · > p rH ft ΡΜθΡ\οΜ»σι·ίθο\οοΜΏ'ΰ^Γηη t? h

H O 4-> Q COOOQOOOOOOOOOOOOOæC'OOOOC't^r^OOOO S H

m Φ X iH H

rH 4J

0) fiO g HieorHoHnoo®onNHnocoO'#'iH (UH

Q O ti) O ϋ 'Q 0) td m g M ooHooooHcoui'TininnnNMDin ,β Én O Q OOOOOOOCPiOOOOCOCOOOCOOOCOCOCOtN » (ti

H tu O U -P

H tn H PI

m H ft -<H

O <U C r-, m in m m m m m in in min ffi

p > 0) ρ r-r'inmodcNCNor^r^r'CMOincNCNino -P

PjH H Q) Ό (U

+j 4J -H id g r'rHinffifor'NtotMnmootoonntocotN tu > id tn -p Ό ·Η H^ioooHrniocoornmoooodfntnC'O >·Η p tn £ O Η -Ρ ΗΗΗΗΝΜΝΝΠΙΊΐΊηη^ cn

Ot-iOEh-P"-' -PC

>1 id Λ (U (d X2 G P °<d a ns d <u O -P O CU H3t

X3 f-i I O O

Ρ O H tn -P

nj-n-ri ø H tu o Cn-P h o — Hg <U -H ρ iHnocotDMnr'r'tDonNcotNffiOh ή C 4-i tu oooiom'jmoooowJ'cnoMOcoHn O Ό H x g p 4) g idd-H oohooohhhooohohoho ii >

O <U H -P -P

2 p +J (ti -P

P (U

τι £5 >, tr c -p x; tu o ns d p h p o tu -P 4J X) Λ

Αί HNM^irnDMnoiOHNoi'jimoMxiin P

<d ηηηηηηηηη,ο tdW

p 0 U Q

ft co (d Xi

O

DK 164819 B

24

Det ses af tabellerne III oq IV, at AG immobilise-ret til carbon nedbryder den flydendegjorte stivelse mere fuldstændigt, hvilket fremgår af den større andel af DP^-, den lave andel af DP2 og DP-j-oligosaccharider, og den fuld-5 stændige nedbrydning af DP^-, DP^- og DPg-oligosacchariderne. Også >DPg-fraktionen er betydeligt mindre for AG immobiliseret på carbon, sammenlignet med AG immobiliseret til aluminiumoxid. De højere niveauer af disaccharider (DP2) og de inter-mediære oligosaccharider (DP^ til DPg) og det lave niveau 10 af glucose i den udstrømmende væske fra AG-aluminiumoxid- -kolonnen indicerer et tilsyneladende tab af aktivitet eller en eller anden art af massetransportfænomen, der forårsager det tilsyneladende tab af enzymaktivitet.

Til kvantitativ angivelse af det tilsyneladende tab 15 af aktivitet eller grad af manglende evne for AG bundet til aluminiumoxid til nedbrydning af stivelse lige så effektivt som AG bundet til carbon, kan aktiviteten udtrykkes soityumol glucose dannet pr. minut pr. ml enzym, beregnet ud fra de i tabellerne III og IV angivne resultater. Aktiviteterne er 20 sammenstillet i tabellerne V og VI for begge "immobiliserede enzymer. Aktivitetsresultaterne er også normaliseret til dimensionsløs aktivitet ved division af den iagttagne aktivitet fra det i kolonnen nedbrudte materiale med aktiviteten ved den indledende hastighed opnået ved bestemmelse af det 25 immobiliserede enzym i omrystningsbadet under anvendelse af Maltrin 15 som substrat. Den dimensionsløse aktivitet af AG bundet til carbon er næsten to gange så stor som den dimensionsløse aktivitet for AG bundet til aluminiumoxid.

30 35

DK 164819 B

25 H _ ft γ^η’Οοογ-'ΟΟΗομοοο m h- oj cn σι od r- coo5incooN'i>HO>> I h r- oa cm in m <#> cNm^f^ininmi-oioinin iDi/unmimn cd . *-* Φ %

“} 03 4-> Ή I

Ti 03 03 Π3 T3 g H -P d

in η Η σσ'ϊ^πι^σ^τΗοοο nnmomm d H

g ’Π id > loocMoi'T'iM'iininco σ> <x> H1 in m in o J3rn g; H OrlrlHrlHiHHrlHO I rlrlrlHrlrl H d

H m P 4-) *»*·*···»·»*«*»·» *·»*·*··- - CO CJ

d II 0Λ OOOOOOOOOOO OOOOOO -ΗΌ g« 12 * > 6 c; -Η Ό

2 = ,— Ό <U

(0 V, - Ό y ajc Η ° N > 03

H d -P

-p ST <d -p a) r: +j οοοοοο^Γ'Γ^Γ^σιοοιηιη μπ ’j φ n co Φ-Ρ

4-> ii <U H M^H'flDMniOCOOO σ H 00 CO (N O £ H

o> g -p o ε .......— ' ' i...... ε >

p ri ή -- i—icMmmnmnmm^cN O H

oV > Η ~ Μ V

m 7 -H o d ε x Η Γ\ -P ε H a; m η ^ λ; p. ε p h <c ~ m tj 0 Q -pi

Is 3*

Η ™ I -H O

u. ω > -P

<d μ d η λ: 03 10 Η 0 --- -P id nj a) h ρ σίΜΓΗσίΓ'Γ'ΠΜΓΌΗ σ m σ m σ φ ,34 03

Hr d-P 0) ΝσοΛσσΝΡοοσσ oo cn <n ro r- cn cfl p i> κΜ _j -H X g *«»*-^·»^****·»| **»»».*« 03 εΤι g id Ό ή mcMmcMCMCMcnrocMMin ιμ ro ro m cm cm t n &) H cd il 0 03 H 4-> «id

0) O £? Z P -P - HH

Λ oS 03 d ns Ρ Ή d ε η η g i o ©.

tP ^ 0) Η P ·

CnO — to -M -—» η Ό d 0) a) d 03 h (0 03 -Η χ: ε ιΗΟΟΟ'ίσίΟΟΜίΠΜ'ΕΟ τ η ιο id οι Ο) 03 ε > d tJi-H ΗοισοοΗΠΦ^ηο ro cn η -3- r- η Ε tn\ +3 g -Η -Ρ Η d Ρ <ϋ^ «. -Ρ \ σοσοοοσσοοιη οσσοοοο Ό η 03 +) Η Ρ 03 Η rΗ Η Η ι—I Η Η Η Η Η d •HH 43 Id g d Ό 03 > Η 03 .d ^ OHd •H >1 d -PH d) x a) — a) cd X3 p ld in inwin imnuiifi in m d r— id h a) r—r-~inLncNCNCNor—t—r'-CMOLncNCNino 4-) 0) * 4J4-> id ε m in X'-' 4-) nd η ΓΉίησΗΓΌΐΦσηιηοοΦσιηΦοοίΝ +) ιβοι >i 0 Η -Ρ Η^ΦΟΟΗΐηΦΟΟΟΠΡΚΟΟΙΠίηΓΌ Η p -

Pd Em -P'—' HHHHNoiNNnnmdn'j > H

-pH Η Ό X I -P 4-3 <13 D O 03 X 0) Λ d (d<«d tn o — d h

Hp m m in m in m m +1 ftp -P a) r-ot-'Or'-oor'-r^ooinr-ininocNin a) o 03 ε - p 2 idOH [— Ί'Π'ΤΙΜ'ίΙ/ΙΓΟιΟΜ'ΟΙΙΜΙ^ΜίΠΗΟΙίΟ 0) 4-> X! Ρ H 4-) HOKMtMOlPICMOKNCMOimHfM CN CN CM 0303 ft 4J >- H 4-> 03 Η Η Ό <d > d d -p ε h a) 0 id p+Jfl h p ο λ: <u

4·* 4-> 25 <d H

,i4 Hoim^iruDMumoHojnM'iniohco m (d HHHHHHHHi—l-Q I

P P

ft CO fO

DK 164819B

26

»H

Pj CNjcninr^cPiCNirHroMvoro^'^'g'mncNjmr' t^-i^-oor'^r^cotTi^ocnor-'r^oD'xi^ogoo ch> oooooocooocococooocor~cor^r~r^r^-ooco id

-P

0) μ d . φ -μ

O φ 03 φ vo^oMvo^cMnoio^iorOooNHVD

,Q ω -Η +) ο^^ονονο'Ρ^τ-ί^'ϊΤ'ΦΐηηνοίΝΐ^ηΐΓ) μ Η Η-Η rnoj<NJOJCMCMr>JoiHrMoorMtN3(MMCN<Noa id φ id £> ' 0 > S-Η οοσοοοοοοοοοοοοοοο •μ Μ -μ

Η .μ Ο X

•μ ra 3 id μ ω •η ^ -μ id ~ <υ ε μ ν 0) 4J d

to μ QJ

•μ Ο 4J cT>'a,omcTin-icoo<T><^'d,cSrHoo^iHinw3 g Η·η 0) Η ipmHHmt^mmfomoooomoior'-cor·'- φ

•μ tjl +-* C3 6 _J

,Q Φ ·μ ^ Γη,μοοσσω'ώιοοοοοσιοοοΓ^οοΓ'σι 0¾ >Η—. ΜΝΝΝΝΝμμμμμμμοιμμμμ rrt 1 d -Η Ο d φ ε φ -μ ε ·μ > •Hd >ι ^ g ®Η Ο *Ή Λ (ο U * 'Ο Η φ r-j q ' ο ε 03 03 \ Ο m d η μ Ο (Ν μ Ο ·μ φ d Φ -μ μ ΗΡ">οοονοι^ιηΓ'·Γ"νοΐ£5οοοΐοοο3σ\οο +>^3 Η iw d+J Φ οοσ\οσ>σ>σ>οοοσ>σισϊθοοοοθιΗσι φ tn (τ5 -μ ^ ε 4J .d Ο Ε id Ό ·μ -iOHOOOHHHOOOHOrlOrlO φ β η Η φ Ο Φ ·μ -μ τ3 Φ > >ι U3 S μ +J"" — d ε η dm μ ιί φ λ - Φ ·γί I Γ~- Λ 'H'Si 03 φΓ-~ (d Φ Γφ d> Ό 03 Εη μ d Φ Φ φ μ *μ ο -Η Λ ε r'OiHior'OotDt^nr^csooiHinvDOvo η m (!) μ d &>·μ rjt'OHnninnn^'jr'M^coNHtM >ι

4-3 5 ·μ 4-1 •-'•------^VVVVV-4«. £w Γζ-J

•μΌ -0. .μ \ tMOOoooffimmooomrimHOio id φ > Φ μ m Η μ ι—it—ι Γμ ι—itH cHtHr-i ι—ι ιΗ r-ι O-d •μ > 4J td ε ϋ &> -μ co -d ' d -μ x~ η 4-) <d > tn t n Η — (d 4-> μ mm mmmminmm mm *H4d Μ H rH Φ r't'mmt'lNt'10t't>'tM'IOirNNlflO id >, φ Φ ε φ μ Λ 4i d μ r'r-immfnt^CNj'^cTicomooiocnmiooonj 4J*d 4-iid O ·μ 4-3 H'rioajHnioooonmiooNniiitO Od Τ3 44 £-4 4-3 HHHHOJCMNOK’inWMM'i 4J φ D -μ Ό > Φ I -μ i—i 03 4-3 Ό d x c O id -μ -μ μ mmm mm mmm -μ φ r'or-'or'-oor-'t-'oomr'-mr-ocsm Q — — — — — — — — — — — · tdO-μ h'in'jn'fmnn'i'NNNnmr-iojn > μ -μ 4-1 μοίΜΙΊΝΝΙΜΙΜΙΜΙΊΙΊΠμΝ C4 C4 C4

&ι 4-1 ' rH

φ Λ id d +3 4-3 O <d •μ μ φ 4J -μ μ X μο3Γη,'3'ΐη'43Γ-οοσΐομ{\]ΐ·η·>3*ιη'43Γ~·οοϋ3

id μ μ μ μ μ μ μ t—it—i,Q I

μ d Ρ4 cn id

O

DK 164819B

27

En sammenligning af den dimensionsløse aktivitet ud fra resultaterne af begge de immobiliserede former for AG er en forholdsvis grov bedømmelse, eftersom omdannelsen i de to kolonner ikke er ens. Den brede variation i den di-5 mensionsløse aktivitet indicerer imidlertid en fundamental forskel i forbindelse med den immobiliserede form for AG ved nedbrydning af Maltrin 15 (15 DE) og ved omdannelse af en flydendegjort majsstivelse (25 DE). Den konklusion, man kan drage ud fra disse resultater, er, at AG bundet til carbon 10 kan nedbryde oligosaccharid med små kæder til glucose lettere end AG bundet til aluminiumoxid. Dette tyder på, at AG bundet til carbon er forholdsvis mere fri end AG bundet til aluminiumoxid.

Begge former for immobiliseret AG synes at være 15 ganske stabile, jfr. tabel I. Det er interessant at bemærke, at den AG, der er bundet til carbon, i begyndelsen mister nogen tilsyneladende aktivitet ved op til ca. 50 timeres drift, hvorpå der nås en vedvarende tilstand over 400 timers drift. AG bundet til aluminiumoxid resulterer i en tilsyne-20 ladende forøgelse i aktivitet i løbet af de første 50 timers drift, hvilket tyder på en eller anden form for massetrans-portmodstand. De i tabel I angivne data viser, at efter en tilsyneladende vedvarende tilstand er AG bundet til aluminiumoxid ca. 20% af udtrykket for AG bundet til carbon.

25 Ud fra disse forsøg er det blevet påvist, at under identiske betingelser binder carbon mere AG (77,3 enheder pr. ml) end aluminiumoxid (25,7 enheder pr. ml). AG bundet til carbon synes at være mindre påvirket af indflydelsen af masseoverføringsmodstand end AG bundet til aluminiumoxid, 30 eftersom AG bundet til carbon nedbryder flydendegjort majsstivelse mere fuldstændigt end AG bundet til aluminiumoxid.

Det er også blevet påvist, at carbon er stabilt over for såvel syre- som basebehandling, medens aluminiumoxid er stabilt over for basebehandling, men følsomt over for syrebe-35 handling. Stabiliteten af en bærer mod såvel syre som base er nødvendig for regenereringen af bæreren således, at den- 28

O

DK 164819B

ne kan genanvendes til enzym-immobilisering. Tilsammen viser disse resultater klart, at carbon og aluminiumoxid, når disse materialer anvendes som bærere til immobilisering af enzymer ved anvendelse af PEI-glutaraldehyd-metoden, er 5 helt forskellige.

10 15 20 25 30 35

Claims (10)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et immobilise-ret enzymkonjugat, kendetegnet ved, at man a) bringer porøst, granulært, aktiveret carbon i kontakt med 5 en opløsning af en polyaminforbindelse med vedhængende aminogrupper, b) fjerner vand og enhver ubundet polyamin dispergeret deri fra kontakt med carbonet og bringer det i kontakt med en vandig dispersionsopløsning af et amin-reaktivt materiale, 10 der er et multifunktionelt aldehyd, et multifunktionelt organisk halogenid, et multifunktionelt anhydrid, en multifunktionel azoforbindelse, et multifunktionelt isothio-cyanat eller et multifunktionelt isocyanat, c) fjerner vand og ethvert uomsat amin-reaktivt materiale dis- 15 pergeret deri fra kontakt med carbonet og bringer carbonet i kontakt med en vandig opløsning af det enzym, der skal immobiliseres.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegne t ved, at der anvendes carbon med en partikelstørrelse fra 12 20 til 40 mesh ifølge U.S. Sieve Series, poredimensioner på fra 35 til 1000 Å i radius og et overfladeareal fra 200 til 2 600. pr. gram.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at polyaminen er udvalgt fra gruppen bestående af poly- 25 ethylendiamin, en polyethylenimin, polyhexamethylen-diamin, polymethylen-dicyclohexylamin, polymethylen-dianilin, poly-tetraethylen-pentamin og polyphenylen-diamin.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at polyethyleniminen er polydiethylen-triamin, polytri- 30 ethylen-tetramin, polypentaethylen-hexamin eller polyhexa methylen-diamin .

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at polyaminen er en copolymer af en epihalohydrin og en alkylenpolyamin. 35 O DK 164819 B 30

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at polyaminen har en molekylvægt i området fra 500 til 100.000.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 5 ved, at der som det amin-reaktive materiale anvendes bis-dia- zobenzidin-2,2,-disulfonsyre, 4,4'-difluor-3,3'-dinitrodi-phenylsulfon, diphenyl-4,41-dithiocyanat-2,21-disulfonsyre, 3-methoxydiphenylmethan-4,41-diisocyanat, toluen-2-isocyanat--4-isothiocyanat, toluen-2,4-diisothiocyanat, diazobenzidin, 10 diazobenzidin-3,31-dianisidin, N,N-hexamethylen-bisiodoacet- amid, hexamethylen-diisocyanat, cyanursyrechlorid eller 1,5--difluor-2,4-dinitrobenzen.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 3, kendetegnet ved, at der som det amin-reaktive materiale an- 15 vendes glutaraldehyd.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der som enzymet anvendes glucoamylase.

10. Immobiliseret enzymkonjngat, kendetegnet ved, at det er fremstillet ved fremgangsmåden ifølge 20 krav 1. _ 25 3° 35