DK172669B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af et immobiliseret enzymkonjugat samt ved fremgangsmåden fremstillet, immobiliseret enzymko - Google Patents

Description

i DK 172669 B1 * Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af et immobiliseret enzymkonjugat samt et ved fremgangsmåden fremstillet, hidtil ukendt immobiliseret enzymkonjugat.

Enzymer, der har proteinnatur og i almindelighed 5 er vandopløselige,opfører sig som biokatalysatorer, idet de regulerer mange af de kemiske reaktioner, der finder sted i levende organismer. Enzymer kan også isoleres og anvendes til analytiske, medicinske og industrielle formål. Eksempelvis anvendes de ved fremstillingen af næ-10 ringsmidler, f.eks. ost og brød, samt ved fremstillingen af alkoholiske drikkevarer.

Eftersom enzymer almindeligvis er vandopløselige samt generelt instabile, er de udsat for deaktivering og er vanskelige at fjerne til genanvendelse fra opløsninger, 15 hvori de er blevet anvendt. Disse vanskeligheder fører til forøgede omkostningerved anvendelsen af enzymer i processer i kommerciel målestok på grund af nødvendigheden af den hyppige erstatning af enzymerne. Til formindskelse af de høje omkostninger ved enzymerstatningen er der blevet ud-20 formet en række fremgangsmåder til immobilisering (til tider betegnet insolubilisering) af enzymer forud for deres anvendelse. Denne immobilisering af enzymerne tillader deres genanvendelse, hvorimod de ellers kunne undergå deaktivering eller gå tabt i det reaktionsmedium, hvori de 25 anvendes. Disse immobiliserede enzymsystemer kan anvendes i forskellige reaktionssystemer, f.eks. i pakkede kolonner og omrørte tankreaktionsbeholdere, afhængigt af naturen af det substrat, der omsættes biokatalytisk.

Adskillige generelle metoder samt mange modifikationer 20 deraf er blevet beskrevet, ved hjælp af hvilke der kan gennemføres immobilisering af enzymer. Eksempelvis er der i GB patentskrift nr. 1.444.539 beskrevet materialer, der kan anvendes til immobilisering af enzymer eller celler, der indeholder enzymer. Fortrinsvis behandles enzymerne el-25 ler cellerne med et med vand blandbart opløsningsmiddel, f.eks. acetone, tørres og behandles derpå med polyethy- 2 DK 172669 B1 lenimin og glutaraldehyd til dannelse af formede legemer med en i vand uopløselig struktur.

I særdeleshed er der i US patentskrift nr. 3.796.634 beskrevet en immobiliseringsmetode, der involverer absorp-5 tion af en polyamin på overfladen af partikler af kolloidal størrelse. Polyaminen tværbindes med et konventionelt, :i - amin-reaktivt tværbindingsmiddel, f.eks. glutaraldehyd, _ og det fremkomne reaktionsprodukt behandles med NaBH^ til reduktion af aldehydgrupperne og dermed hindring af ” 10 enhver covalent binding mellem aldehydgrupperne og enzymets 'Ί aminogruppe. Dernæst absorberes enzymet på den behandlede overflade af partiklen ved en sådan pH-værdi, at det kolloide absorptionsmiddel bærer en elektrisk netladning, der er modsat den, som enzymmolekylerne har, således at ionisk ™ 15 binding understøtter andre ikke-covalente bindingskræfter, jj Det nævnte patentskrift beskriver de absorberende partikler ] som havende en størrelse fra ca. 50 til ca. 20.000 Ångstrøm, * fortrinsvis fra ca. 100 til ca. 200 Ångstrøm i diameter, idet det absorberende materiale er aktiveret trækul, hy-' 20 droxylapatit, aluminiumoxid C-gamma og bentonit. Dette system er afhængigt af ladnings-interaktioner til binding af enzymet til behandlede partikler. Denne type binding er mindre ønske-" lig end dannelsen af covalente bindinger, eftesom ioniske interaktioner er udsat for omgivelsernes betingelser i for- - 25 hold til denne type binding, f.eks. pH-værdi, ionstyrke og 5 temperatur.

ji Liu et al. beskriver en immobiliseringsmetode for ~ lactase på granuleret carbon i Biotechnol. Bioeng. 17, = 1695-1696 (1975), der omfatter absorption af para-amino- ~ 30 phenol eller l-phenol-2-amino-4-sulfonsyre på carbonet.

Disse absorberede forbindelser tilvejebringer de amino-grupper, med hvilke glutaraldehyd reagerer, hvorpå en-zymet bindes. De aminogruppeholdige forbindelser, der er = nævnt, er monomere, der har kemiske og fysiske egenskaber, _ 35 som er forskellige fra de tilsvarende egenskaber af en - polyamin såsom polyethylenimin.

3 DK 172669 B1

En anden gruppe forskere (Cho et al., Immobilization of Enzymes on Activated Carbon: Properties of Immobilized Glucoamylase, Glucose Oxidase and Glucono-lactonase, Biotechnol. Bioeng. 20, 1651-1665 (1978)) 5 har også immobiliseret enzymer på granuleret carbon ved covalent tilknytning. Ved denne metode aktiveres carbonet ved hjælp af et carbodiimid, der kan erstattes med et enzym til dannelse af et enzym-carbon-kompleks.

I US patentskrift nr. 4.141.857 er der beskrevet en 10 fremgangsmåde til enzym-immobilisering, og denne metode omfatter behandling af en uorganisk, porøs bærer, f.eks. gamma-aluminiurnoxid, med porediameter fra ca. 100 til ca.

55.000 Ångstrøm og et overfladeareal på ca. 100 til ca.

2 500 m pr. gram med en opløsning af en vandopløselig poly-15 amin, hvorpå det behandlede bærermateriale bringes i kontakt med en opløsning af et bifunktionelt, monomert materiale, f.eks. glutaraldehyd. Ved denne behandling efterlades det behandlede bærermateriale egnet til reaktion med enzymet til dannelse af covalente bindinger mellem enzymet og de 20 udragende aldehydgrupper. I eksempel 2 i det nævnte patentskrift er der beskrevet fremstilling af et immobiliseret enzymkonjugat ved behandling af porøse aluminiumoxidkugler i rækkefølge med opløsninger af polyethylenimin, glutaraldehyd og glucoamylase.

25 I US patentskrift nr. 4.438.196 er der beskrevet en fremgangsmåde, ved hvilken enzymer immobiliseres på aktiveret granuleret carbon. Denne fremgangsmåde omfatter behandling af carbonet med en polyamin-forbindelse med udragende aminogrupper,hvilket bevirker, at polyaminen ad-30 hærerer til carbonet og efterlader udhængende aminogrupper, der er frie til yderligere reaktion. De frie aminogrupper derivatiseres ved behandling med en bifunktionel forbindelse med amin-reaktive dele, således at frie aminogrupper i enzymet covalent kan bindes til polyaminen via 35 den amin-reaktive forbindelse.

I US patentskrift nr. 4.186.053 er det beskrevet, at 4 DK 172669 B1 et væsentligt mere aktivt produkt med hensyn til fikseringen eller insolubiliseringen af proteiner kan opnås med de produkter, der dannes ved kondensation af 1,3-phenylendiamin med glutardialdehyd, og som derpå kan anvendes som bærere 5 for proteinet. I patentskriftet beskrives der en fremgangsmåde til fremstilling af sfæriske, homogene partikler, der er lette at filtrere, og som kan anvendes til fremstilling af immunobiliserede enzymer. Ifølge en af de beskrevne udfø-relsesformer kan reaktionen udfores i nærværelse af et indif-10 ferent, finkornet, fortrinsvis uorganisk,især silicat-holdigt tilsætningsstof. Eksempler på tilsætningsstoffet er silica-gel, pimpsten, diatoméjord (kiselgur), bentonit, wollastonit, porøst glas og tillige metaloxider såsom aluminiumoxid eller hydroxylapatit, idet silicagel eller pimpsten er angivet at 15 være de foretrukne tilsætningsstoffer. I patentskriftet antydes der intet om, at der ville være nogen særlig fordel ved at anvende diatoméjord, som end ikke er et af de foretrukne tilsætningsstoffer.

I us patentskrift nr. 4.292.199 er der beskrevet en 20 fremgangsmåde til fremstilling af en bærer- eller understøt-ningsmatrix. Det angives i dette patentskrift, at afsætningen af en polyamin, f.eks. polyethylenimin, på et porøst, ildfast uorganisk oxid under stærkt sure betingelser, efterfulgt af forøgelse af pH-værdien til en forholdsvis basisk 25 tilstand, giver en bærermatrix, der er i stand til at modtage en signifikant forøget belastning med et enzym efter dettes påfølgende immobilisering, hvorved der tilvejebringes et immobiliseret enzymsystem med signifikant forøget aktivitet.

Det porøse, ildfaste oxid imprægneret med polyamin tværbindes 30 derefter med overskud af et bifunktionelt reagens til tilvejebringelse af et stort antal udragende funktionelle grup per. Glutaraldehyd vælges ofte som det bifunktionelle reagens. Det angives i patentskriftet, at aktiviteten af et herefter fremstillet immobiliseret enzymsystem afhænger af j 35 den pH-værdi, ved hvilken polyaminen påføres eller påimpræg- neres, og af pH-værdien under den senere behandling. Der : fi " 11 5 DK 172669 B1 findes i dette patentskrift ingen antydninger, der kunne gere det nærliggende for en fagmand at anvende et af de tilsætningsmaterialer, der er omtalt i det ovenfor omtalte US patentskrift nr. 4.186.053, i stedet for de bærermateria-5 ler, der er angivet i US patentskrift nr. 4.292.199. Anvendelsen af porøs, granuleret diatoméjord er end ikke omtalt i US patentskrift nr. 4.186.053.

Det har ifølge opfindelsen overraskende vist sig, at anvendelsen af porøs, granuleret diatoméjord som bærermate-10 riale giver væsentlige og uforudsigelige fordele i forhold til andre bærere. Disse fordele omfatter længere levetid og bedre termostabilitet end opnået med carbon-immobil i serede enzymer fremstillet ifølge det ovennævnte US patentskrift nr. 4.438.196. En brugt GDE (porøs, granuleret diatoméjord)-15 bærer kan genanvendes til immobilisering efter regenerering ved en simpel proces, der omfatter syre-base-vask (hvilket eliminerer et bortskaffelsesproblem og giver en potentiel økonomisk besparelse). Enzymer kan co-immobiliseres på en sådan bærer, og den lmmob i liserede enzymaktivitet pr. ml 20 bærer kan varieres og tillige regulere? ved hjælp af partikelstørrelserne i bæreren og graden af belastning med enzym(er). Ved denne metode fås der en binding mellem enzymet og polymeren absorberet til GDE, der er usædvanligt stabil, og det har vist sig, at GDE-partiklerne ikke bliver overtruk-25 ket og forurenet med proteiner eller andre stoffer, når en rå opløsning af det materiale, der skal behandles, f.eks. flydendegjort majsstivelse, ledes gennem et lag af det iro-mobiliserede enzym, jfr. også nærmere herom i det følgende.

Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes der 30 således en fremgangsmåde til fremstilling af et immobiliseret enzymkonjugat, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man (a) bringer porøs, granuleret diatoméjord i kontakt med en opløsning af en polyaminforbindelse med udragende 35 aminogrupper, (b) fjerner opløsningsmidlet og eventuelt ikke-bundet 6 DK 172669 B1 polyamin dispergeret deri fra kontakt med diatoméjorden og bringer den således behandlede diatoméjord i kontakt med en oplosning af et amin-reaktivt materiale, der er et multi-funktionelt aldehyd, et multifunktionlet organisk halogenid, 5 et multifunktionelt anhydrid, en multifunktionel azoforbin-delse, et multifunktionelt isothiocyanat eller et multifunktionelt isocyanat, og (c) fjerner opløsningsmidlet og ethvert ikke-omsat amin-reaktivt materiale opløst deri fra kontakt med diato-10 mé jord-bæreren og bringer den i kontakt med en opløsning af i det mindst ét enzym.

Opfindelsen angår tillige et Immobiliseret enzymkonju-gat, der er fremstillet ved den her omhandlede fremgangsmåde.

Enhver GDE (porøs, granuleret diatoméjord) kan anven-15 des ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. En særdeles egnet GDE har fortrinsvis en partikelstørrelse fra ca. 0,32 til 1,118 mm. Poredimensionerne vil fortrinsvis varierere i radier fra ca. 35 til ca. 1000 Ångstrøm, og overfladearealet varierer fortrinsvis fra ca. 20 til ca. 60 m2/gram.

20 Den porøse, granulerede diatoméjord, der anvendes i de følgende eksempler (leveret af Eagle Pitcher Ind., Inc.) har god mekanisk styrke og stabilitet ved udsættelse for varme og for sure eller basiske opløsninger. Produktets fysiske og kemiske egenskaber er som følger: 25 30 35

O

7 DK 172669 B1

Fysiske egenskaber (typiske)

Partikelstørrelse 0,32 - 1,118 mm

Bulkmassefylde 575 kg/cm^

Form I det væsentlige sfærisk 5 2

Knusningsstyrke 17,6 - 18,6 kg/cm

Partikler pr. 0,454 kg (0,85/1,118 mm) 13 millioner

Partikler pr. 0,454 kg 10 (0,32/o,85 mm) 1 million

Farve Lys gulbrun 2

Gennemsn. overfladeareal 40 m /gram

Gennemsn. porerumfang 0,16 ml/gram

Gennemsn. porediameter 155 Ångstrøm 15

Kemiske egenskaber (omtrentlige)

Siliclumdioxid (Si02) 901

Aluminiumoxid (A^O^J 6,5%

Jernoxid (Fe202 2,3% 20 Kalk (CaO) 0,2%

Magnesiumoxid (MgO) 0,3%

Andre oxider 0,3%

Antændelsestab (udover fugtighed ved 105°C) 0,4% pH i opløsning 6,5-7,0 25

Fugtighedsindhold <1,0%

Struktur Overvejende amorf diatoméjord 30 35

O

8 DK 172669 B1 På grund af den kemiske stabilitet, den fysiske sejhed og de lave omkostninger er denne porøse GDE en fortrinlig bærer til anvendelse i kolonne- eller søjlereaktionsbeholdere.

5 Specifikke eksempler på polyaminer, der er egne de til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, omfatter polyethylendiamin, en polyethylenimin, f.eks. polydiethylentriamin, polytriethylentetramin, polypentaethylenhexamin eller polyhexamethylendiamin.

10 Der kan også anvendes Betz 118 Λ Dette er en vandopløselig copolymer af epihalogenhydrin og polyamin og markedsføres af Betz Laboratories, Inc., Trevose, Pennsylvania. Andre egnede polyaminer er polymethylendicyc-lohexylamin, polymethylendianilin, polytetraethylenpent-15 amin og polyphenylendiamin. Omend polyaminens molekylvægt ikke anses for at være kritisk, foretrækkes det dog at anvende polymere med en molekylvægt i området fra 500 til 100.000. De polyaminer, der er vandopløseligé, tilføres den anvendte GDE fra deres vandige opløsninger, 20 medens ikke-vandopløselige polymere tilføres fra organiske opløsningsmidler. Egnede opløsningsmidler omfatter, men er ikke begrænset til methylalkohol, ethylalkohol, propylalkohol, isopropylalkohol, tert.butylalkohol, acetone, me-thylether, ethylether, propylether, isopropylether, to-25 luen, benzen, xylen, hexan, cyclopentan og cyclohexan.

Omend den nøjagtige mekanisme ikke er kendt, antages det dog, at kontakt mellem den anvendte GDE og polyamin-opløsningen, der almindeligvis vil have en koncentration på fra ca. 1 til ca. 100 g polyamin pr. liter opløsnings-! 30 middel, bevirker, at polyaminen bliver bundet til over fladen og muligvis indesluttes i porerne i GDE-partikler-ne. Medens således en del af den polymere må forventes at blive adsorberet til overfladen af GDE-partiklen, vil en del også forventes at blive trukket ind i porerne af den 35 porøse bærer, således at makromolekylet rager ud fra poren ' I«

H

: : »«

O

9 DK 172669 B1 efterladende de funktionelle grupper (aminogrupper) tilgængelige til yderligere reaktion. Den foreliggende fremgangsmåde står i modsætning til den kendte fremgangsmåde, der er beskrevet i det tidligere nævnte US patentskrift 5 nr. 3.796.634, hvor carbonpulver behandles med en opløsning af polyethylenimin til ændring af dens overfladeladning og derved tilladelse af absorption af enzymet på den modificerede bærer. Denne kendte metode afhænger af lad-nings-interaktion, der er meget mindre ønskelig end de 10 covalente bindinger, der dannes ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse. Den behandlede GDE fjernes fra kontakt med polyaminopløsningen, f.eks. ved dekantering eller ved filtrering, og vaskes fortrinsvis med et opløsningsmiddel som nævnt i det foregående afsnit, f.eks.

15 med afioniseret (DI) vand, til fjernelse af enhver ikke--adhærerende polymer.

Den med polyamin behandlede GDE behandles derpå med en opløsning af et multifunktionelt amin-reaktivt materiale, f.eks.glutaraldehyd, bis-diazobenzidin-2,2'-disulfonsyre, 20 4,4'-difluor-3,3’-dinitrodiphenylsulfon, diphenyl-4,4'-di- thiocyanat-2,2'-disulfonsyre, 3-methoxydiphenylmethan--4,4'-diisocyanat, toluen-2-isocyanat-4-isothiocyanat, toluen-2,4-diisothiocyanat, diazobenzidin, diazobenzidin--3,3'-dianisidin, Ν,Ν'-hexamethylen-bisiodacetamid, hexa-25 methylendiisocyanat,cyanursyrechlorid eller 1,5-difluor-2,4--dinitrobenzen, ved kontakt deraf med en opløsning, der fortrinsvis indeholder fra ca. 1 til ca. 100 g pr. liter af det amin-reaktive materiale. De amin-reaktive materialer, der er vandopløselige, tilføres til den anvendte GDE fra 30 deres vandige opløsninger, medens ikke-vandopløselige polymere tilføres fra organiske opløsningsmidler. Egnede opløsningsmidler omfatter, men er ikke begrænset til methyl-alkohol, ethylalkohol, propylalkohol, isopropylalkohol, tert.butylalkohol, acetone, methylether, ethylether, pro-35 pylether, isopropylether, toluen, benzen, xylen, hexan, 10 DK 172669 B1 o cyclopentan og cyclohexan. Efter at man har tilladt reaktionen at foregå i tilstrækkelig lang tid til at tillade, at det amin-reaktive materiale derivatiserer de frie amino-grupper i polyaminen, fjernes den behandlede GDE fra op-5 løsningen af amin-reaktivt materiale og vaskes fortrinsvis flere gange med afioniseret vand. Det her anvendte udtryk "derivatiserer" skal repræsentere dannelsen af et reaktionsprodukt mellem den amino-funktionelle gruppe i polyaminmolekylet bundet til den anvendte GDE og den ud-10 ragende amin-reaktive del af det amin-reaktive materiale.

Ethvert enzym indeholdende en aminogruppe, der er i stand til at reagere med den udragende amin-reaktive del, kan immobiliseres ved anvendelse af denne fremgangsmåde.

To eller flere enzymer kan også co-immobiliseres. Disse 15 enzymer omfatter f.eks. trypsin, papain, hexokinase, ficin, bromelin, lactisk dehydrogenase, lactase, glucoseisomerase, glucoamylase, chymotrypsin, pronase, acylase, invertase, 3-amylase, a-amylase, pullulanase, transglucosidase, glucoseoxidase, pepsin, rennin og svampe-protease. Den de-20 rivatiserede GDE blandes med en opløsning af enzymet eller enzymerne til fuldstændiggørelse af enzymimmobiliseringen.

Enzymet kan være i en vandig opløsning og/eller et opløsningsmiddel, der er foreneligt med enzymet. Immobiliseringen kan være af batch-typen eller fcregå i industriel målestok, 25 og immobiliseringen kan udføres i en søjlereaktionsbeholder. Fjernelse af den anvendte GDE fra enzymopløsningen, fortrinsvis ved påfølgende vaskning med vand, tilvejebringer det GDE-immobiliserede enzym, der er egnet til anvendelse ved biokatalytiske omdannelser.

30 En af de uventede iagttagelser i forbindelse med den her omhandlede immobiliseringsfremgangsmåde består i, at GDE-immobiliserede enzymer i almindelighed er overlegne i den forstand, at de udviser længere levetid og bedre termostabilitet end de carbon-immobiliserede enzymer, der 35 11 DK 172669 B1 o fremstilles ifølge US patentskrift nr. 4.438.196. Denne egenskab, der er meget betydningsfuld, når man bedømmer en heterogen biokatalysator, er illustreret i de følgende eksempler.

5 Et andet ønskeligt træk ved denne immobiliserings- proces består i, at en tidligere anvendt GDE-bærer kan genanvendes til immobilisering efter regenerering ved en enkel proces, der omfatter en base-syre-vask. Typisk opslæmmes den anvendte bærer i (1) vand, (2) 0,5 N NaOH, 10 (3) vand, (4) 0,5 N HC1 og derpå (5) vand. Denne egen skab ved fremgangsmåden er signifikant, fordi den eliminerer ethvert affaldsproblem for brugeren og tillige tilvejebringer en potentiel økonomisk besparelse.

Et andet ønskeligt træk består i den udførelsesform, 15 der involverer co-immobilisering af mere end ét enzym, jfr. de følgende eksempler 5 og 6.

Ved den fortrinsvis udførte praktiske gennemførelse af den her omhandlede fremgangsmåde vaskes partiklerne af diatoméjord med vand, indtil vandet er klart, hvorefter der fjernes luft 20 ved sugning. Polyaminen, fortrinsvis polyethylenimin (molvægt 500-100.000) i en vandig opløsning, sættes dernæst til den vaskede GDE, fortrinsvis i et forhold på ca.

10 ml GDE til ca. 50 ml vandig opløsning af polyethylenimin (PEI). Koncentrationer mellem ca. 0,1 og ca. 0,5% 25 (vægt pr. rumfangsenhed) af vandig PEl-opløsning er blevet anvendt med et godt resultat, og fortrinsvis sættes der fra ca. 0,15 til ca. 0,20% (pH-værdi målt ved 9,0-9,9) PEI (molvægt 40.000-60.000) i vandig opløsning til den anvendte GDE. Den effektive reaktionstid kan variere mel-30 lem ca. 1/2 og 8 timer ved ca. 20 til ca. 30°C under forsigtig omrøring, idet en reaktionstid mellem ca. 2 og ca. 5 timer ved stuetemperatur foretrækkes. Overskuddet af PEl-opløsning kan fjernes ved dekantering og vaskning af den amin-behandlede GDE med vand. Når glutaraldehyd 35 anvendes som et tværbindingsmiddel, sættes dette typisk

O

12 DK 172669 B1 til den med PEI behandlede GDE i omtrentligt samme rumfangsforhold som den anvendte PEI. Glutaraldehyd-koncentrationer på fra ca. 0,1 til ca. 1,0% (vægt pr. rumfangsenhed) er effektive ved denne immobiliseringsproces.

5 Den foretrukne koncentration ligger fra ca. 0,25 til ca.

0,7% (vægt pr. rumfangsenhed) vandig glutaraldehydopløs-ning indeholdende 0,05 M natriumbicarbonat ved en ønsket pH-værdi på fra ca. 7,9 til 8,3. Typisk har glutaralde-hyd-bicarbonat-opløsningen en målt pH-vaerdi på 8,2.

10 Tværbindingsreaktionen udføres ved fra ca. 20 til ca.

30°C i fra ca. 1/2 til ca. 20 timer, fortrinsvis i ca.

2 timer ved stuetemperatur under forsigtig omrøring. Ethvert overskud af glutaraldehydopløsning kan fjernes ved dekantering og vaskning af den behandlede GDE med vand.

15 Enzym-immobilisering kan udføres ved en temperatur mellem ca. 4 og ca. 30°C ved en pH-værdi, der er egnet for det bestemte enzym, der immobiliseres, i fra ca. 1 til ca.

10 timer under forsigtig omrøring. De foretrukne betingelser omfatter 4 timers omrøring ved stuetemperatur. De 20 på denne måde opnåede immobiliserede enzymer kan opbevares i vand eller en egnet pufferopløsning, fortrinsvis i kulden i et køleskab, navnlig ved en temperatur fra 1 til 10°C, fortrinsvis omkring 4°C, indtil de skal anvendes.

Enzymkonjugatet ifølge den foreliggende opfindelse 25 har vist sig at være velegnet til immobilisering af enzymer i almindelighed. Enzymer, der er immobiliseret i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse, er væsentligt mere termisk stabile end solubiliserede enzymer eller enzymer immobiliseret ifølge US patentskrift nr.

I 30 4.438.196, og den foreliggende opfindelse er således, hvilket er væsentligt, navnlig egnet til udnyttelse i forbindelse med varmelabile enzymer.

Den immobil iserede enzymaktivitet pr. ml bærer kan varieres og reguleres ved hjælp af partikelstørrelserne af 35 bæreren og graden af belastning med enzymet eller enzymerne.

TI

' TI

’ 44 • Tf 13 DK 172669 B1

Ved immobiliseringen tilvejebringes der en binding mellem enzymet og den polymere, der er absorberet til den granulerede diatoméjord, som er usædvanlig stabil, og det har vist sig, at diatoméjord-partiklerne ikke bliver over-5 trukket og forurenet af proteiner eller andre stoffer, når en rå opløsning af f.eks. flydendegjort majsstivelse føres gennem et lag af det immobiliserede enzym.

Opfindelsen illustreres nærmere i de efterfølgende eksempler, der tjener til illustration af foretrukne udførel- 10 sesformer.

Medmindre andet er angivet i eksemplerne, bestemmes aktiviteten af enzymet eller enzymerne, hvad enten disse er immobiliserede eller solubiliserede, på følgende måde. Bestemmelsen udføres ved 50°C under anvendelse af et sub-15 strat af 50 ml 10% (vægt pr, rumfangsenhed) Maltrin-150 (dextroseækvivalent 10-12) majsstivelse fra Grain Processing Company (Muscatine, Iowa) i 0,05 M acetatbuffer ved en pH-værdi på 4,2. Til udførelse af bestemmelsen anbringes substratet og enzymet i en rystekolbe og inkuberes i 20 30 minutter. Den mængde glucose, der dannes, bedømmes ved hjælp af glucostrate-metoden (General Diagnostics), hvorved den oprindelige hastighed (også benævnt oprindelig omsætningsgrad) af glucose dannet pr. minut bestemmes ved .·* regressionsanalyse. En enhed af enzymaktivitet repræsen-25 terer den mængde enzym, der vil producere 1 mikromol glucose (eller glucoseækvivalent) i løbet af 1 minut under betingelserne for hver enzymbestemmelse, og angives i U/ml (enheder af aktivitet pr. ml bærer) .

I eksemplerne er den dannede mængde sukker bestemt 30 ved hjælp af ferricyanamid-metoden som beskrevet af

Ghuysen et al., Methods in Enzymology, vol. VIII, side 685, Academic Press, New York (1966), hvor glucose anvendes som reference.

35

O

14 DK 172669 B1

Eksempel 1

Immobilisering af glucoamylase på PEl-derivatlseret porøs, granuleret diatoméjord 5 Inden anvendelse til immobilisering vaskes den gra nulerede diatoméjord (GDE) på følgende måde: 1. 100 ml granuleret porøs diatoméjord med en partikelstørrelse på fra 0,74 til 0,85 mm (Eagle Pitcher Industry, Inc.) blandes med afioniseret vand. Der an- 10 vendes en tilstrækkelig mængde vand til fuldstændig nedsænkning af diatoméjorden.

2. Efter at diatoméjorden har afsat sig, dekanteres den ovenstående væske.

3. Diatoméjorden befries dernæst for luft ved sugning, 15 og resterende vand dekanteres.

Glucoamylase (AG = amyloglucosidase) immobiliseres ved stuetemperatur ved følgende fremgangsmåde: 1. 500 ml af en 0,2%'s (vægt rum’Fångsenhed) vandig opløsning af PEI-600 (Cordova Chemical Company, Muskegon, 20 Michigan ) polyethylenimin med molekylvægtsområde 40.000-60.000 med en pH-værdi målt ved 9,8 sættes til en 100 ml prøve af vasket diatoméjord i en 1 liter Erlenmeyerkolbe, og der omrystes forsigtigt i 4 timer.

2. Overskud af polyethylenimlnopløsning dekanteres der- 25 efter, og den behandlede diatoméjord vaskes med rige lige mængder vand.

3. De udragende aminogrupper af polymeren, der er bundet til diatoméjorden, derivatiseres med glutaraldehyd ved tilsætning af 500 ml af en 0,5%'s (vægt/rumfangsen-30 hed) glutaraldehydopløsning, der er fremstillet i 0,05 M natriumbicarbonat, hvilket resulterer i en pH--værdi på 8,2. Kolben omrystes forsigtigt i 2 timer ved stuetemperatur.

35 15 DK 172669 B1 4. Glutaraldehydopløsningen dekanteres, og den behandlede diatoméjord vaskes med afioniseret vand til fjernelse af uomsat glutaraldehyd. Resultatet er en bærer omfattende diatoméjord, polyethylenimin 5 og glutaraldehyd.

5. 500 ml af en opløsning indeholdende 12.000 enheder glucoamylase (Diazyme L-200, et i USA registreret varemærke tilhørende Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana), der er indstillet på en pH-værdi på 7,0 med 10 0,02 M phosphatpuffer, sættes til den derivatiserede bærer og omrystes forsigtigt i 4 timer ved stuetemperatur.

6. Væsken dekanteres, og det immobiliserede enzym vaskes med afioniseret vand.

15

Den immobiliserede glucoamylase viser sig åt indeholde 110 enheder aktivitet pr. ml bærer.

Anvendelse af med granuleret diatoméjord Immobiliseret glu-20 coamylase til fremstilling af sirupper med højt dextroseindhold

En prøve på 50 ml af den således fremstillede immobil iserede glucoamylase pakkes i en med kappe udstyret glaskolonne med en diameter på 2,5 cm og en højde på 100 cm.

25 30% med enzym flydendegjort stivelse (dextroseækvivalent (DE) = 40) (23,63% glucose, 10,99% maltose, 0% isomaltose; polymerisationsgrad: trisaccharid (DP3) 13,10%; tetrasac-charid (DP4) 7,10%; større end DP4 45,18%), hvor pH-værdien er 4,2, pufret med 5 πίΜ acetat, ledes kontinuerligt til 30 søjlen med forskellige strømningshastigheder. Søjlens temperatur holdes ved 50*C. Produkterne analyseres ved hjælp af HPLC (højtryksvæskechromatografi) og GC (gaschromatografi). Resultaterne fremgår af den følgende tabel.

35 16 DK 172669 B1

O

Tabel I

Carbonhydrat-sammensatnlng (%)

Strømningshastighed x Iso- (ml/tirae) Glucose Maltose maltose DP^ DP^ >DP^ 25,4 94,3 1,1 0,80,40 3,4 13,3 95,7 1,3 1,5 0,4 0 1,2 ; 11,0 96,6 1,1 1,8 0,3 0 0,2 " 10 9,1 94,1 1,4 3,8 0,7 0 spor * Ma1 to se-bestandde1 en indeholder små mængder af uidentificerede disaccharid iDP^}-sukkerarter.

,5 Der kan således opnås et maksimalt glucoseniveau s& højt som 96,6%, hvilket verificerer, at der kan opnås et dextroseniveau svarende til opløselig glucoamylase-sacchari-ficering. Dette høje niveau af dextrose ved 30% "dry solids" (DS) indikerer, at enzymet befinder sig ved eller megét nær ved 20 overfladen af partiklen således, at intern diffusion ikke er en hovedfaktor, der påvirker reaktionen. Den høje sukkerfraktion { > DPj) er også i stand til let at blive hydrolyseret af det immobiliserede enzym, hvilket yderligere indikerer en ringe grad af sterisk hindring eller den lette 25 adgang for substratet til enzymets aktive sted.

i Eksempel 2 I Med granuleret dlatoméjord immobiliseret glucoamylase sammenlignet med carbon-Immobillseret glucoaroylase_ 30

Termostabilitet:

Termostabilitetsforsøg med opløselig glucoamylase, carbon-immobiliseret glucoaroylase ifølge eksempel 1 i US patentskrift nr. 4.438.196 og GDE-immobiliseret gluco-35 amylase fremstillet som i det ovenstående eksempel 1, ud- h« ; 'rm I 9 . .£ia ffl ; t* 5 17 DK 172669 B1 føres ved 60°C og en pH-værdi på 1,2 (0,1 M acetatpuffer) 1 fraværelse af substrat.Resultaterne fremgår af den følgende tabel IIA.

Tabel IIA

Procent glucoamylase-aktivitet resterende efter inkube-rlnq 1 den angivne tid ved 60°C og pH 6,0_ 10 % Restaktivitet_

Tid (minutter) 30 60 120 180

Opløselig 82,6 73,2 66,4 54,7

Carbon-immobiliseret 87,0 72,4 54,7 51,4 15 GDE-immobiliseret 91,6 78,7 72,6 64,2

Som det fremgår af tabellen, resulterer immobiliseringen af glucoamylase på porøs, granuleret diatoméjord i en forbedring af enzym-termostabiliteten.

20

Stabilitet og produktivitet: 1 liter immobiliseret glucoamylase fremstillet som i det ovenstående eksempel 1 pakkes i en med kappe udstyret glassøjle (5 cm x 100 cm). Søjlen anvendes konti-25 nuerligt ved 50°C, idet der som substratet tilføres 30% DS ("dry solids" eller tørre faste stoffer) dobbelt enzym-flydendegjort majsstivelse (35 DE) ved pH = 4,2, pufret med 2,5 iH acetat og indeholdende 250 dele pr. million (dpm) S(>2· Substratet er endvidere blevet opbevaret koldt ved 5*C 30 og ledes dernæst gennem en lille 70*C varm søjle fyldt med almindelig granuleret diatoméjord, der skal virke som et kontrol fil ter, inden indgangen til enzymsøjlen. Glucosenive-auerne i produkterne ligger i området mellem 94 og 96%. Halveringstiden for denne søjle er ca. 125 dage med en pro-35 duktivitet på ca. 153 g DS pr. ml immobiliseret glucoamylase.

O

18 DK 172669 B1

Til sammenligning afprøves carbon-immobiliseret glucoamylase fremstillet i overensstemmelse med eksempel 1 i US patentskrift nr. 4.438.196 i en søjle på samme måde som beskrevet i det foranstående afsnit, dog 5 med den undtagelse, at DS er 25%. Skønt den lavere DS- -værdi favoriserer en mere fuldstændig omdannelse af den tilgængelige stivelse, og udbyttet således skulle være bedre, ligger glucoseniveauerne i produkterne i området mellem 92 og 931. Halveringstiden for denne kolonne er 10 ca. 67 dage med en produktivitet på ca. 107 g DS pr.

ml immobiliseret glucoamylase.

Resultaterne af carbonhydratprofilen ved forskellige strømningshastigheder gennem hver søjle er sammenfattet i den følgende tabel IIB.

15 20 25 30 35 i « 19 DK 172669 B1

«J ^ I

C „ ·Η

o ® U

•H J +J

p ^

U ™ A

O

rar^oco'P'i'ixi'T CL 'v .v n « ' ^ ' - > ' O -1-1 lo ft W’TrOrHiHOOO Cl “J *

Q ft Q

* P ^ M

c * M

— <» h ft

> 2 Q

<*> ^»rroror-ii^moo "r ft OOOOOOOO ΰ>α

Q Cl S -H

P 41 ” μ

O

H M n -S

<u g υ ft Ό c o ni O <D ' ” <n

t n p <*> ,H

KO 7 . U

P Ρ Η p ftp S .

ns > 'i .* H g ineooniaomvo tn ‘J-! © O - O n < in OOPPPlNlNfO O) P m H Λ £ (fl „ K tr 5* o CQ P £* 4j HQ P 2 _, W M i 14 5« « TJ g

P QJ J5 O

4) B in <n in p tn

Λ O 04 £ *H

rd 2 4JQ roinn^Tf^rin^o c g

£Η H

O idtT* HHHHHHHrl „SO IS'

ffl « “ CO

Li « i ti -

" 2 IN

< ^ (L

\c*£>*rfNjH<?>r-iV£) C^q

1-4 Q)W

Cu 0\(Μ«ΙΐΛΐΛΐΛΐΛ^ «2 O (ocr>a>a\o\as<TxC\ w ? ti O w p .

„, p o ® · (0 c C .c oo 0) Ή <D μ tT>

Og 4J Ό o • <U Ά -H £ _ μ λρ ,· +J S n O tn Ci in p cu

O P * ft G Ό Q

P U o zL

p in ft Dl ri λ Ρ KJ C P o Ό M JC tf nJ Λί υ p in C lp (0 rti u £ ££ * i 2 g % Ό ρ e mocoiom^miN ρ rj n g C 3 tr fl p o 3 g P PPOOOOOO UOnJrt •Q ® J Q g g w ρ ns

O Ρ P

< OT -- X

20 DK 172669 B1

(O I

C -H

: o ·>· P

p vo p

P

ξ P Ρ A

: ΓΊΓΜηΟΟΟΡΟΓ-'ιΤ o m ' ' « " - » ^ ^ Cl,''··«

cu MtNONLnLn^r<Nooo,-,rH

.-v Q P P h ^ '

- Γ 04 Q fN

= <#> A — --I

P

Li — Ό Ό — C -Η Π i-5 Ρ'νΟ'Ο'ΊΤίΜΗι-Ι'β'ίΟ J) Li η η οοοσσοοοο ε •c —

- a, O U

G O ^

p <0 P

- o <ϋ O) u O « « P c Λ 0) o υ p, -o ε u r, (1) <0 E-ι in v ·· w

o -Η ^ -H

Il < p 7 . il

:5 p r-t P P

Li 10 OJ m (Nfoinr'ovo'ff^oo tø

(1 tn E

4-> Q O ΟΟΟΟΡΡΓΊ'Τ'ί' ΐη·ΊΟ

.-s ρ tn Ό ‘P

= ^ o Jh H (1) O Q> — <p J3 P 2 æ iji o> o 1 -H p p

™ Z Ρ ® P

: Ξ CQ W P «5 - μ O Φ 2 'O g m w in Λ >n o η o & vomm^rnintDuiiT' to £ in ; — ,—) PQ ζρ G Ή

— 0) Dj ri ip ip ip P ip ip i—I *—I ri G O

*- Λ « tP j f '* ro <20 C P <* — E-r E Φ ' *= U S O *λ

C P I

o P p —

J3 I» li (N

” P P Λ

(0 ιΗ (ΝΙΟιΛιΛΓ^Γ'ίΛΓ'νΟ C P O

. _ U Di ' “ Q ττιηοοίΝΡΠΡΙΝΙΝ J3 ;_ P MtOiOtOffiDiiJ'Cno' p 3 t3

— m (|J W vH

p p o) (U * Ό PC) E C {· p T3 g P 0 l> — c φ -5 p Ό υ (0 JC2 P p ro p D> . p in ·» tx -H · p in -p « p p α C ·0 o p in a o 00 p ro & P O’

PjCtn G Ρ O Ό

in C nJ M -H

P ίτ> Ifl <P te ® P

o c p X EOtnio Ό ρ g in 9 p O J5

G C p OiOOCOiniONPO p P U

P EP ' ' ' ...... Dl 'll ij ϋ X) ©. tJi (NPHOOOOOO 10 Φ 2 «3 p m p e e »

O P P

< OT - X

m

O

21 DK 172669 B1

Det fremgår af tabel IIB, at glucoamylase, der er bundet til GDE, er i stand til at hydrolysere stivelse mere fuldstændigt end glucoamylase, der er bundet til granuleret carbon. Den maksimale dextrosemængde på 5 ca. 96% opnås med glucoamylase bundet til GDE og et niveau på ca. 95% med glucoamylase bundet til carbon.

Det forøgede dextroseudbytte kan indikere, at AG bundet til GDE er mindre sterisk hindret eller er bundet mere ved overfladen af partiklerne, således at substratet ud-10 sættes for mindre diffusionsmodstand. En anden indikation på en mindre diffusionsmodstand med glucoamylase bundet til GDE er det mindre niveau af isomaltose, der dannes ved det respektive dextroseniveau.

15 Eksempel 3 immobilisering af glucoamylase gentages på samme måde som l eksempel 1 med variation af partikelstørrelsen af den anvendte GDE og af de mængder glucoamylase, der im-mobiliseres, til sammenligning af aktiviteten af glucoamy-20 lasen og mængden af glucoamylasen.

De data, der er anført i den følgende tabel, viser virkningen af partikelstørrelse og enzymbelastningsmængde på aktiviteten af den sammensatte enzymbærer under anvendelse af glucoamylase som et modelsystem.

25 30 35 i 22 DK 172669 B1

Zk <u u-i « -i-1 0) CP u c<u —

•rllidfprlfiHh® Tf 00 ri NO ON O

rQ.,-|·—' τ τ τ v v v » »· » V ». *

1 GrinfOONONmif) ON NO O CO NO lO

•ri -r| OO 03 Tf CM r( ON ON <Xi Γ0 <N

> Λ 6 Ό O >

_ DEN

* * c

* H

c

1 +J

1 fti ø U-ι Q) tfl 0) <o w c h

fl QJ W

-0 ri g XI

H)>iE o oo oo m no ri o in n i/i n * 4J g W fc. «. V V T T T «· v T τ

i •Hf3tflgr-|VOOOVO<T'rH ON U"> Tf τ* in ON

> O ø \ νλ ri r- on oo o\ li η m ft o\ ffi

H O HID »H »-H r-H r—( fH Η N IN N N

-U 3 0 M π «

< CpXI

M

M 0 M Q) Ό - r-l tp 0) 0) C 01 c xj m « <u ^

<0 E ·—I M M

E-< W >1 <U <U

g* § iy id

•Η O Λ XI

c u o o o o o o o o o o o o

±1 Z3 4J I—|»Vk»V» VVV»VV

WritiEoooooo o o o o o o «3 cp & \ r- τ o o o o r-' tj· no o o o

r-l lu D ri (N Tf 00 <N ri N Ί (O N

Q) M-l rifl '— ri ri m <d G.

r«~s.

0) U) Ό H 00 CO 00 CO 00 00

4->ν-ι<1)ΐΛΐΠϋΊιΠιΛιΛ rH »H rH Η Ή |H

OOV^COCOCOCOCO 00 i-HrHfHfHHrH

·Π Vj *. v v k k v w « v w v «.

ΦΌ^ΟΟΟΟΟΟ rH 1—4 *Η »H «Η »H

rH g 4J

2 O w ι ι i i t i i i i i i i C *j rtHJI N N N N N N ιΛιΛιΛιΛι/ΝιΛ Μ-ΗΓΝΜηίΛίΟη CO CO 00 oo 00 00 (j |Q g ». v «. % v <» k V ^ k s s E o o o o o O O O O O o o

H

23 DK 172669 B1

O

Det fremgår af tabel III, at når belastningsmængden forøges, er det samme tilfældet med aktiviteten, indtil belastningsmængden når ca. 200 enheder pr. ml for partikelstørrelsen fra 0,32 til 0,85 mm og 300 enheder pr.

5 ml for partikelstørrelsen fra 0,85 til 1,118 ml, hvorefter aktiviteten flader ud.

Eksempel 4

En mængde på 100 ml af PEI-glutaraldehyd-derivati-10 seret GDE som i eksempel 1 (men fremstillet med -24 til +48 mesh GDE) anvendes til at Immobilisere soja-8-amy-lase (Hl-maltosin S, Hankyu Kyoei Bussan Co., Ltd., Osaka,

Japan). Den enzymopløsning, der anvendes til behandling den derivatiserede GDE, er 1 g (40.000 enheder pr. g) af 15 soja-8-amylasen i 500 ml 0,02 M phosphatpuffer ved pH = 7,0. Immobiliseringsproceduren gennemføres som beskrevet i eksempel 1. Den således opnåede, immobiliserede β-amylase bestemmes til at have en aktivitet (pH = 5,5) på 134 enheder pr. ml bærer.

20

Anvendelse af med granuleret diatoméjord immobiliseret g-amylase til fremstilling af sirupper med højt mal tose Indhold__________

Prøver på hver 50 ml af 30% DS Maltrin-150 ____ 25 (Grain Processing Corp.) i 0,05 M acetatopløsning med en pH-værdi på 5,0 fordøjes i rystekolber i 24 timer ved 50°C med forskellige mængder immobiliseret 8-amylase, der således er fremstillet til produktion af sirupper med højt maltoseindhold. Produkterne analyseres med hensyn 30 til carbonhydratsammensætning ved HPLC. Resultaterne frem går af den følgende tabel.

35

O

24 DK 172669 B1

Tabel IVA

Iromobillseret Carbonhydratsammensætning (%) β·"ϊ}"* »1 »2 »», 5 _ _ _ 0 1,2 3,5 2,8 92,5 0,2 1,2 37,0 11,2 50,6 0,4 1,2 42,4 12,7 43,7 0,9 1,1 47,2 12,8 38,9 10 1,8 1,1 51,8 12,7 34,3 3,5 1,2 53,8 12,7 32,4 7,0 1,1 55,2 12,4 31,3 15

Det fremgår af tabel IVA, at der kan opnås et maksimalt dextroseniveau på ca. 55%.

Termostabilitet af med granuleret diatoméjord immobi-liseret 3-amvlase 20 -1--

Termostabilitetsforsøg med opløselig β-amylase,

carbon-immobiliseret β-amylase fremstillet ifølge eksempel 4 i US patentskrift nr. 4.438.196 og den her i omhandlede β-amylase bundet til GDE udføres ved 60°C

25 i acetatpuffer (0,1M, pH = 5,5) i fraværelse af et substrat. Resultaterne fremgår af den følgende tabel i IVB.

30 35 25

O

DK 172669 B1

Tabel IVB

Procent aktivitet af β-amylase resterende efter In- o _kubering ved 60 C og pH = 6,0_ 5

Res takvi ti tet (%)_

Tid (minutter) 30 6 0 12 0 ISO

Opløselig (3-amylase 87,2 17,2 4,7 1,4

Carbon-immobi1 i seret 84,2 58,6 46,0 43,2 10 GDE-immobili seret 100 100 91,5 86,6

Den termiske stabilitet af β-amylasen, der er bundet til GDE, forøges drastisk. Efter 1 times forløb 15 iagttages der praktisk taget intet tab i aktivitet for det med GDE immobiliserede enzym, men mindre end 60% af den carbon-iimtobiliserede aktivitet og mindre end 20% af den opløselige enzymaktivitet resterer. Selv efter 3 timer ved 60°C er stadig mere end 85% af den GDE-im-2Q moboliserede β-amylase aktiv, sammenlignet med mindre end 45% af det carbon-immobiliserede enzym og mindre end 5% for det opløselige enzym.

Eksempel 5 25 Fremstilling af co-immobiliseret qlucoamylase/pullulanase

En mængde på 100 ml af det derivatiserede GDE som i eksempel 1 (men fremstillet med en partikelstørrelse på fra 0,85 til 1,118 mm) anvendes til immobiliseringen.

30 Den derivatiserede GDE behandles med 500 ml af en pufferopløsning med en pH-værdi på 6,0 (0,1 M acetat) indeholdende 12.000 enheder glucoamylase (Diazyme L-200, Miles Laboratories, Inc.) og 12.000 enheder pullulanase (Promo zyme^ 20OL, Novo Industri, Inc.), hvorved enzymerne 35 co-immobiliseres på den porøse GDE-bærer ved den fremgangs- DK 172669 B1

O

måde, der er beskrevet i eksempel 1. Det således opnåede co-immobiliserede glucoamylase-pullulanase-materiale bestemmes til at have en glucoamylaseaktivitet på 54,5 en-- heder pr. ml og en pullulanaseaktivitet på 12,3 enheder 5 pr. ml, idet der anvendes 1% (vægt pr. rumfangsenhed) : pullulan som substrat.

Π Anvendelse af co-immobiliseret glucoamylase/pullulanase- b -produkt til fremstilling af sirupper med højt dextroseind- Γ 10 hold_______

Sirupper med højt dextroseindhold fremstilles ved at fordøje 50 ml prøver af 30% DS-enzym-flydendegjort majs-r- stivelse (40 DE) i 0,05 M acetat ved pH = 4,2 i ryste- li kolber i 24 timer ved 50°C med varierende mængder co-im- « Ί5 mobiliseret glucoamylase-pullulanase-produkt, fremstillet ^ på denne måde. Carbonhydratprofilerne fremgår af den følgen de tabel.

H

20 o il I'· s 25

[ TO

30 35 ri 27 DK 172669 B1 p <a

P

p

(O

p - —> Q) r»

<#> M

IN in ip ip U") X IN

m 3 tp

(¾ OO O P 1-1 O W

* D i o) r~ A οι (η U di o m Q P *4* Z ip a> ισ .—.

Η m σι m id ιΛ rø g m CO » * *► % v <y

2 CU fN «Η »—( O O M ·* Q

Q Q) cn E-1 ϋ * Λ . -P 00 '—

fej IP i—I

Ή Ό

w 4J ^ -H

„ S Π rP P

z w o) o, nj ,, O XI Q Λ W P -P »-» u Ή 3 (j SI Ό id e P N tf Tf lil p -Η ΙΛ SO ».«...V«. dj p -p W O O O O O TI li p <C ip · tji x: p

U C O

w O W u A

. . ε <β > E-< tyi o) ·* O QJ o Ί· P <C p c * g _ * U Ό 0 m

Λ Oi * iP C g CN

id 0» r~~ m in m m pn -p E-1 O w κ E ·· ._.

O O N Η Η H øpro -p (Μ (DM O,

-P Ό « -P Q

Π3 (tf wtf ηό -w „s λ h ^ Z O ·ρ Ό

_ Ό Λ ip -P

o a> <u o p _ > Ό P id ” , C α λ

P ·Ρ p O

K ip r~ -P σι ID m E ra u di - ® C p te < q co in in ίο pooi/j I o ίι οι o οι η h >. ή

U 0) 0) Λ P

Λ Ό c P

Ό O

tx> c n p C id p o ® -P P id p C W u 4) ® I P 1) I 05 » ® « Λ P o •p ω flJ » ® Λ p •p <d m c to p Η Λ £ 3 I S π

0 g Id 1 P Λ O

g id ·Ρ - Id Id p 0) § O 3 p r-miNenr- M 2 οι ·ρ HOPE » * » * s 1 3 >P— ipmmiooo 0 >P 3 * * O tn O. *

O

28 DK 172669 B1

De således opnåede sirupper har højere glucoseind-hold og lavere isomaltoseindhold end de sirupper, der opnås ifølge eksempel 1, En kombination af glucoamylase og pullulanase har en anderledes hydrolyseprofil end gluco-5 amylase selv, og dette skyldes teoretisk den kombinerede virkning af glucoamylase og pullulanase.

Eksempel 6

Fremstilling af co-iimnobiliseret β-amylase/pullulanase 10

En mængde på 100 ml af derivatiseret porøs GDE som i eksempel 1 (men fremstillet med GDE med en partikelstørrelse fra 0,85 til 1,118 mm) anvendes til immobilisering. Der fremstilles en opløsning ved blanding 15 af 1 g β-amylase (Hi-Maltosin S) og 20 ml pullulanase (Pulluzym^ 750L, AMB Chemicals Limited, Woodley, Stock-port, Cheshire, England) i 0,005 M acetatpuffer ved pH = 5,5. β-Amylasen og pullulanasen co-immobiliseres dernæst på den porøse GDE ved den fremgangsmåde, der er 20 beskrevet i eksempel 1.

Anvendelse af med granuleret diatoméjord co-immobiliseret β-amylase/pullulanase til fremstilling af sirupper med højt maltoseindhold_ 25 Sirupper med højt maltoseindhold fremstilles ved hydrolyse af 50 ml prøver af 30% DS Maltrin-150 i 0,05 M acetat ved pH = 5,5 i rystekolber i 24 timer ved 50°C med forskellige mængder af således fremstillet co-immobiliseret β-amylase/pullulanase. HPLC-sukkerprofilerne for produkterne 30 er angivet i den følgende tabel.

35 1

Il Æ i m 29 DK 172669 B1

O

Tabel VI

colmmobiliseret HPLC-sukkerprofi 1 (%) 8-amylase/ —---- pullulanase (ml) DP^ DPj D^3 >bP^ 5 0 1,2 3,5 2,8 92,5 0,4 2,8 46,9 15,2 35,1 0,9 2,8 53,1 13,3 30,8 1,8 2,8 57,9 13,4 25,9 3,5 2,9 62,6 14,1 20,5 10 7,0 3,0 67,3 13,3 16,4

Resultaterne viser, at sammensætningerne af sirup med højt maltoseindhold fremstillet ved hjælp af co-15 immobiliseret 8-amylase/pullulanase er bedre end de, der fremstilles ved hjælp af immobiliseret 8-amylase alene (eksempel 4), dvs. med højere maltoseindhold og lavere indhold af højeremokekylære sukkerarter. Som i eksempel 5 må dette teoretisk tilskrives den kombine-20 rede virkning af β-amylase og pullulanase.

Eksempel 7

En mængde på 100 ml af PEI-glutaraldehyd-deriva-25 tiseret GDE som i eksempel 1 (men fremstillet ved hjælp af GDE med en partikelstørrelse fra 0,85 til 1,118 mm) anvendes til at immobilisere pullulanase (Pulluzyme 750L). 500 ml 0,05 M acetat ved en pH-værdi på 5,5 indeholdende 24 ml af enzymet anvendes til behandling af den 30 derivatiserede GDE. Immobiliseringsproceduren gennemføres som beskrevet i eksempel 1. Den således opnåede immobili-serede pullulanase bestemmes (pH = 6,0) til at indeholde 32 enheder pr. ml bærer.

35 0 30 DK 172669 B1

Termostabilitet af immobillseret pullulanase

Termostabilitetsforsøg med opløselig pullulanase og den således fremstillede pullulanase bundet til GDE 5 udføres ved 60°C og en pH-værdi på 6,0 (0,1 M acetat) i fraværelse af substrat. Resultaterne fremgår af den » følgende tabel VII.

’ Tabel Vil 10 Procent aktivitet af pullulanase resterende efter inkuber ing i det angivne tidsrum ved 60°C og pH - 6,0 4 _Restaktivitet (%)___ ' Tid (minutter) 30 60 120 180 15 Opløselig pullulanase 19,7 6,0 0 0 _ GDE-immobiliseret 51,4 42,2 42,2 38,4 1 i

Som det fremgår af tabel VII, er den lmmobiliserede pullulanase signifikant mere termisk stabil end det op-20 løselige enzym. Efter 1/2 times forløb bibeholder den GDE-lmmobiliserede pullulanase stadig mere end 50% af aktiviteten, medens den opløselige pullulanase allerede I1 har en aktivitet på mindre end 20%. Efter 2 timers forløb bibeholder den GDE-immobiliserede pullulanase stadig ca.

~ 25 42% af aktiviteten, medens den opløselige pullulanase al lerede er gået ned på 0% aktivitet.

Eksempel 8

Fremstilling af lmmobillseret lactase 30 En mængde på 100 ml af PEI-glutaraldehyd-derivati- seret GDE som beskrevet i eksempel 1 (men fremstillet med • en størrelse på fra -24 til +35 mesh) anvendes til immo-

bilisering af lactase. 1 g lactase (20.000 enheder) fra Aspergillus oryzae opløses i 500 ml 0,02 M natriumphos-35 phatpufferopløsning (pH = 7,0) og immobiliseres til GDE

ϋ 31 DK 172669 B1 o ved den samme metode som den i eksempel 1 beskrevne. Lac-taseaktlviteten bestemmes ved 50°C og pH = 4,5 under anvendelse af 5% (vægt pr. rumfangsenhed) lactose som substrat. Den frigjorte glucose bestemmes ved glucostrate-5 -metoden. En enhed af lactaseaktivitet er defineret som den mængde enzym, der producerer 1 micromol glucose pr. minut ved 50°C ved en pH-værdi på 4,5. Den således opnåede immobiliserede lactase bestemmes til at have 106,7 enheder pr. ml bærer.

10

Anvendelse af med granuleret diatoméjord immobiliseret lactase til hydrolyse af lactose___

Hydrolyse af en 50 ml prøve af 15% (vægt pr. rumfangsenhed) lactose (0,05 M natriumacetat, pH * 4,5) 15 med immobiliseret lactase bundet til GDE udføres i rystekolber i 24 timer ved 50°C. HPLC-sukkerprofilerne for de hydrolyserede produkter er angivet i den følgende tabel .

20 Tabel VIIIA

, .,j _ HPLC-sukkerprofi 1 (%)

Immobiliseret -K1—- lactase (ml) Glucose Galactose Lactose DP. DP. _ _ _ _ _3_ _4_ 0 -- -- 100,0 25 0,9 34,4 25,4 31,2 7,3 1,7 1,8 42,6 37,1 16,6 3,3 0,4 3,5 47,2 45,0 5,2 1,6 5,2 48,6 47,7 2,9 0,8 7.0 48,8 48,3 2,4 0,5 30 10,4 48,9 48,5 2,6 ---

Graden af lactose-hydrolyse er over 97%, hvilket viser, at den immobiliserede lactase bundet til GDE er forholdsvis aktiv.

35 (DP3 = trisaccharid; DP4 = tetrasaccharid).

O

32 DK 172669 B1

Termostabilitet af immobiliseret lactase

Termostabilitetsforsøg med opløselig lactase og den således fremstillede lactase bundet til porøs GDE udføres ved 60°C og en pH-værdi på 4,5 (0,1 M natriumacetat) i fra-5 værelse af substrat. Resultaterne fremgår af den følgende tabel VIIIB.

Tabel VIIIB

Procent aktivitet af lactase resterende efter inkubering 10 i det angivne tidsrum ved 60°C og pH = 4,5

Restaktivitet (%)_

Tid (minutter) 30 60 120 180

Opløselig lactase 52,4 32,4 16,8 10,0 15 GDE-immobiliseret 76,0 72,6 61,6 53,4

Eksempel 9

Fremstilling af Immobiliseret transglucosidase I 20

En mængde på 100 ml PEl-glutaraldehyd-derivatiseret GDE som i eksempel 1 (men fremstillet med en partikelstørrelse fra 0,85 til 1,118 mm) anvendes til immobilisering af transglucosidase. 500 ml af 0,05 M acetat ved en pH-vær-25 di på 5,5 og indeholdende 500 enheder af en renset, termisk stabil transglucosidase fra Talaromyces duponti anvendes, immobiliseringen udføres ved samme fremgangsmåde som beskrevet i eksempel 1. Den således opnåede immobiliserede transglucosidase bestemmes til at indeholde 2,6 enheder pr. ml 30 bærer. Transglucosidaseaktiviteten bestemmes ved en frem-_ gangsmåde, der er baseret på kvantitativ måling ved væske- - chromatografi af et transglucosylisk produkt, nemlig pa- nose i en inkuberingsblanding af enzym og maltose ved en pH-værdi på 4,5 og 60°C. Én enhed af transglucosidase-ak-35 tivitet er defineret som den mængde enzym, der producerer 33 DK 172669 B1 1 micromol panose pr. time fra en 20%'s maltoseopløsning ved en pH-værdi på 4,5 og 60°C.

Anvendelse af med granuleret diatoméjord immobiliseret trans-5 qlucosldase til produktion af ikke-fermenterbare sukkerarter Ikke-fermenterbare sukkerarter, dvs. ikke-fermenterbare med gær, (hovedsagelig panose og isomaltose) fremstilles ved fordøjelse af 50 ml 30%'s DS-roaltoseopløsning (pH = 4,5, 0,05 M acetat) i en rystekolbe med 10 ml immobiliseret trans-10 glucosidase, der er fremstillet på den angivne måde, i 5 dage ved 60*C. GC-analyse af produktet viser følgende sukkerprofil: 28,3% glucose, 34,8% maltose, 7,4% isomaltose, 22,1% panose og 7,5% højere sukkerarter. Den totale mængde af ikke-fermenterbare sukkerarter (α-Ι-6-binding) produceret 15 ifølge dette eksempel er ca. 37%.

Claims (9)

34 DK 172669 B1 O Pat entkrav.

1, Fremgangsmåde til fremstilling af et immobiliseret , enzymkonjugat, kendetegnet ved, at man 5 a) bringer porøs, granuleret diatoméjord i kontakt med en opløsning af en polyaminforbindelse med udragende ami-nogrupper, b) fjerner opløsningsmidlet og eventuelt ikke-bundet polyamin dispergeret deri fra kontakt med diatoméjorden I 10 og bringer den således behandlede diatoméjord i kontakt med en opløsning af et amin-reaktivt materiale, der er et multifunktionelt aldehyd, et multifunktionelt organisk I halogenid, et multifunktionelt anhydrid, en multifunk- tionel azoforbindelse, et multifunktionelt isothiocyanat 15 eller et multifunktionelt isocyanat, og i c) fjerner opløsningsmidlet og ethvert ikke-omsat amin-reaktivt materiale opløst deri fra kontakt med diatomé- I jord-bæreren og bringer den i kontakt med en opløs ning af i det mindste ét enzym. 20 _

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at polyaminen er valgt fra gruppen bestående af poly- 7 ethylendiamin, polyethylenimin, polyhexamethylendiamin, • polymethylendicyclohexylamin, polymethylendianilin, poly- tetraethylenpentamin, polyphenylendiamin, polydiethylentrl-amin, polytriethylentetramin, polypentaethylen-hexamin, polyhexamethylendiamin og en copolymer af epihalohydrin og polyamin, hvori polyaminen har en molekylvægt i området fra - 500 til 100.000.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kende teg - net ved, at det amin-reaktive materiale er bis-diazo-benzidin-2,2'-disulfonsyre, 4,4'-difluor-3,3'-dinitrodi- 7 phenylsulfon, diphenyl-4,4'-dithiocyanat-2,2'-disulfon- - syre, 3-methoxydiphenylmethan-4,4'-diisocyanat, toluen- 7 35 ~2 -isocyanat-4-isothiocyanat, toluen-2,4-diisothiocyanat, diazobenzidin, diazobenzidin-3,3'-dianisidin, Ν,Ν'-hexa- m i 35 DK 172669 B1 o methylen-bisiodacetamid, hexamethylen-diisocyanat, cya-nursyrechlorld, 1,5-difluor-2,4-dinitrobenzen eller glutaraldehyd.

4. Fremgangsmåde Ifølge krav 1, kendetegnet 5 ved, at enzymet er glucoamylase, Ø-amylase, pullulanase, transglucosidase, lactase, trypsin, papain, hexokinase, ficin, bromelin, lactisk dehydrogenase, glucoseisomerase, chymotrypsin, pronase, acylase, Invertase, a-amylase, glucoseoxidase, pepsin, rennin, svampeprotease eller en 10 blanding deraf.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at diatoméjorden har en partikelstørrelse fra ca. 0,32 til ca. 1,118 mm, poredimensioner fra ca. 35 Ångstrøm til 1000 Ångstrøm i radius og et overfladeareal fra ca. 15 20 til ca. 60 m^/g.

6. Immobiliseret enzymkonjugat, kendetegnet ved, at det er fremstillet ved fremgangsmåden ifølge krav 1.

7. Konjugat ifølge krav 6, kendetegnet ved, at diatoméjorden har en partikelstørrelse på fra 20 ca. 0,32 til ca. 1,118 mm, poredimensioner fra ca. 35 til ca. 1000 Ångstrøm i radius og et overfladeareal på fra ca. 20 til ca. 60 m /g, og at polyaminen er valgt fra gruppen bestående af polyethylendiamin, en poly-ethylenimin, polyhexamethylendiamin, polymethylendicyc-25 lohexylamin, polymethylendianilin, polytetraethylenpen- tamin, polyphenylendiamin, polydiethylentriamin, polytri-ethylentetramin, polypentaethylenhexamin, polyhexamethylendiamin og en copolymer af epihalohydrin og en po-lyamin, hvor polyaminen har en molekylvægt på fra 500 30 til 100.000.

8. Konjugat ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det amin-reaktive materiale er bis-diazobenzi-din-2,2'-disulfonsyre, 4,4'-difluor-3,3'-dinitrodiphenyl-sulfon, diphenyl-4,4'-dithiocyanat-2,2'-disulfonsyre, 35 3-methoxydiphenylmethan-4,4'-diisocyanat, toluen-2-iso- cyanat-4-isothiocyanat, toluen-2,4-diisothiocyanat, 36 DK 172669 B1 O diazobenzidin, diazobenzidin-3,3'-dianisidin, Ν,Ν'-hexa-methylen-bisiodacetamid, hexamethylen-diisocyanat, cyanur-syrechlorid, 1,5-difluor-2,4-dinitrobenzen eller glutar-aldehyd.

9. Konjugat ifølge krav 6, kendetegnet ved, at enzymet er glucoamylase, β-amylase, pullulanase, : transglucosidase, lactase, trypsin, papain, hexokinase, ficih, bromelin, lactisk dehydrogenase, glucoseisomerase, ; chymotrypsin, pronase, acylase, invertase, a-amylase, « io glucoseoxidase, pepsin, rennin, svampeprotease eller en »j blanding deraf. “ 15 ^ 20 25 : so 35