JPH07147981A - 固定化酵素複合体の製造法および該方法により調製した固定化酵素複合体 - Google Patents
固定化酵素複合体の製造法および該方法により調製した固定化酵素複合体Info
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- JPH07147981A JPH07147981A JP6208447A JP20844794A JPH07147981A JP H07147981 A JPH07147981 A JP H07147981A JP 6208447 A JP6208447 A JP 6208447A JP 20844794 A JP20844794 A JP 20844794A JP H07147981 A JPH07147981 A JP H07147981A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 固定化酵素複合体の調製法を提供することを
目的とし、該酵素は固定化酵素複合体内におよび／また
は該複合体に（安定に）堅固に維持されており、不活性
化されず、他の方法をで得たものを越える改良された半
減期を示し、結果として大幅なその生産性の改善を実現
し、該固定化酵素複合体は反応媒体中への該酵素の喪失
を低減する。 【構成】 (a) 多孔質粒状珪藻土と、少なくとも１個の
ペンダントアミノ基を有するポリアミン化合物の溶液と
を接触させて、担体を生成する工程と、(b) 酵素と、多
官能性アルデヒド、多官能性有機ハライド、多官能性無
水物、多官能性アゾ化合物、多官能性イソチオシアネー
ト、多官能性イソシアネートおよび２種以上のこれら物
質のブレンドからなる群から選ばれる少なくとも１種の
アミン反応性物質の溶液とを接触させて、処理酵素−含
有アダクトを生成する工程と、(c)該担体と、該処理ア
ダクトとが反応して固定化酵素複合体を形成するよう
に、該担体と、該処理アダクトとを接触させる工程とを
含む、固定化酵素複合体を調製する方法。
目的とし、該酵素は固定化酵素複合体内におよび／また
は該複合体に（安定に）堅固に維持されており、不活性
化されず、他の方法をで得たものを越える改良された半
減期を示し、結果として大幅なその生産性の改善を実現
し、該固定化酵素複合体は反応媒体中への該酵素の喪失
を低減する。 【構成】 (a) 多孔質粒状珪藻土と、少なくとも１個の
ペンダントアミノ基を有するポリアミン化合物の溶液と
を接触させて、担体を生成する工程と、(b) 酵素と、多
官能性アルデヒド、多官能性有機ハライド、多官能性無
水物、多官能性アゾ化合物、多官能性イソチオシアネー
ト、多官能性イソシアネートおよび２種以上のこれら物
質のブレンドからなる群から選ばれる少なくとも１種の
アミン反応性物質の溶液とを接触させて、処理酵素−含
有アダクトを生成する工程と、(c)該担体と、該処理ア
ダクトとが反応して固定化酵素複合体を形成するよう
に、該担体と、該処理アダクトとを接触させる工程とを
含む、固定化酵素複合体を調製する方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は固定化酵素複合体の調製
法、および該方法を利用することにより調製される安定
な固定化酵素複合体に関する。
法、および該方法を利用することにより調製される安定
な固定化酵素複合体に関する。
【０００２】
【従来技術】一般に、酵素は水溶性である。従って、支
持体上に固定化されない状態（遊離酵素）で使用された
場合には、再利用のために該酵素を水から分離すること
は困難である。かかる難点は、頻繁な取替えの必要性の
ために、該酵素の利用に関連するコストを増大してしま
う。更に、遊離（固定化されていない）酵素はバッチ式
の工程で効果的に使用できるが、これは該酵素の連続的
な、工業的規模の工程での利用を可能としない。この酵
素の取替えに係わる高いコストを減ずるために、酵素を
その使用前に固定化する種々の方法が工夫された。この
ような固定化は、後の再利用のために、反応媒体から該
酵素を有利に取り出すことを可能とする。これら固定化
された酵素は、生体触媒的に反応する該酵素の基質の特
性に応じて、種々の反応器系、例えば充填カラムおよび
攪拌されたタンク式反応器で使用することができる。酵
素の固定化のために提案された方法は、無機または有機
物質で作られた固体支持体としての担体の使用を含む。
このような物質は、例えばγ−アルミナ、チタニア、活
性化粒状炭素、粒状珪藻土、ガラスビーズ、多孔質ガラ
ス、パミス−ストーン、シリカゲル、金属酸化物および
酸化アルミニウムを包含する。化合物またはその混合物
が、該酵素をこの担体に付着させるのに使用され、その
例としては特にグルタルアルデヒドおよびポリエチレン
イミンを挙げることができる。しかしながら、このよう
な方法は、該酵素が該担体に堅固に維持（該担体に結合
されるかあるいはそこに封入されることにより）されて
いないという点で不利である。従って、該酵素は該担体
から「脱離」（未結合状態）して、反応媒体中で「遊
離」状態となる可能性がある。事実、該酵素と該担体と
の間に働く、これらを一緒に維持しようとする力は、し
ばしば極めて弱く、処理すべき基質の存在下において、
該酵素は迅速に該担体から脱離して、該反応媒体中に失
われる。
持体上に固定化されない状態（遊離酵素）で使用された
場合には、再利用のために該酵素を水から分離すること
は困難である。かかる難点は、頻繁な取替えの必要性の
ために、該酵素の利用に関連するコストを増大してしま
う。更に、遊離（固定化されていない）酵素はバッチ式
の工程で効果的に使用できるが、これは該酵素の連続的
な、工業的規模の工程での利用を可能としない。この酵
素の取替えに係わる高いコストを減ずるために、酵素を
その使用前に固定化する種々の方法が工夫された。この
ような固定化は、後の再利用のために、反応媒体から該
酵素を有利に取り出すことを可能とする。これら固定化
された酵素は、生体触媒的に反応する該酵素の基質の特
性に応じて、種々の反応器系、例えば充填カラムおよび
攪拌されたタンク式反応器で使用することができる。酵
素の固定化のために提案された方法は、無機または有機
物質で作られた固体支持体としての担体の使用を含む。
このような物質は、例えばγ−アルミナ、チタニア、活
性化粒状炭素、粒状珪藻土、ガラスビーズ、多孔質ガラ
ス、パミス−ストーン、シリカゲル、金属酸化物および
酸化アルミニウムを包含する。化合物またはその混合物
が、該酵素をこの担体に付着させるのに使用され、その
例としては特にグルタルアルデヒドおよびポリエチレン
イミンを挙げることができる。しかしながら、このよう
な方法は、該酵素が該担体に堅固に維持（該担体に結合
されるかあるいはそこに封入されることにより）されて
いないという点で不利である。従って、該酵素は該担体
から「脱離」（未結合状態）して、反応媒体中で「遊
離」状態となる可能性がある。事実、該酵素と該担体と
の間に働く、これらを一緒に維持しようとする力は、し
ばしば極めて弱く、処理すべき基質の存在下において、
該酵素は迅速に該担体から脱離して、該反応媒体中に失
われる。
【０００３】米国レターパテント第4,713,333 号は酵素
を粒状珪藻土上に固定化する方法を記載している。この
方法は、多孔質粒状珪藻土とポリエチレンイミン溶液と
を接触させる工程を含む。次いで、このポリエチレンイ
ミンを含有する珪藻土をグルタルアルデヒドと接触させ
る。最後に、これに酵素の水性溶液を添加し、かくして
該酵素をその上に固定化する。この方法は特に有用であ
るが、それにも拘らずこの方法で生成した固定化酵素複
合体は、依然としてその安定性並びに半減期に関して改
良の余地がある。かくして、酵素を酵素複合体として固
定化し、かくして生成された複合体中に該酵素を堅固に
保持（または維持）し、該固定化酵素が該複合体の残り
の部分から「脱離」せず、かつ反応媒体中に失われない
ようにする方法に対する需要が残されていることが理解
できる。更に、酵素が固定化酵素複合体に堅固に保持さ
れおよび／またはその内部に（安定に）保持され、該複
合体の使用中に、該複合体から反応媒体中に失われる該
酵素の量を減じ、結果として大幅に改良された該固定化
酵素の生産性を実現する、固定化酵素複合体に対する需
要が残されていることも理解できる。
を粒状珪藻土上に固定化する方法を記載している。この
方法は、多孔質粒状珪藻土とポリエチレンイミン溶液と
を接触させる工程を含む。次いで、このポリエチレンイ
ミンを含有する珪藻土をグルタルアルデヒドと接触させ
る。最後に、これに酵素の水性溶液を添加し、かくして
該酵素をその上に固定化する。この方法は特に有用であ
るが、それにも拘らずこの方法で生成した固定化酵素複
合体は、依然としてその安定性並びに半減期に関して改
良の余地がある。かくして、酵素を酵素複合体として固
定化し、かくして生成された複合体中に該酵素を堅固に
保持（または維持）し、該固定化酵素が該複合体の残り
の部分から「脱離」せず、かつ反応媒体中に失われない
ようにする方法に対する需要が残されていることが理解
できる。更に、酵素が固定化酵素複合体に堅固に保持さ
れおよび／またはその内部に（安定に）保持され、該複
合体の使用中に、該複合体から反応媒体中に失われる該
酵素の量を減じ、結果として大幅に改良された該固定化
酵素の生産性を実現する、固定化酵素複合体に対する需
要が残されていることも理解できる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の第一の目的
は、固定化酵素複合体の調製法を提供することにあり、
該方法において該酵素は、かくして調製された固定化酵
素複合体内におよび／または該複合体に（安定に）堅固
に維持されている。本発明の別の目的は、固定化酵素複
合体の調製法を提供することにあり、該方法により得ら
れる該固定化酵素複合体は不活化されず、かつ更にこの
方法により製造された該固定化酵素複合体は、他の方法
を利用して得たものを越える改良された半減期を示す。
更に別の本発明の目的は、他の方法を利用して得たもの
を越える改良された半減期を示し、結果として大幅なそ
の生産性の改善を実現する、固定化酵素複合体を提供す
ることにある。本発明の更に別の目的は、該複合体の該
酵素が該複合体に堅固に維持されているという意味で安
定であり、反応媒体中への酵素の喪失量を低減する固定
化酵素複合体を提供することにある。
は、固定化酵素複合体の調製法を提供することにあり、
該方法において該酵素は、かくして調製された固定化酵
素複合体内におよび／または該複合体に（安定に）堅固
に維持されている。本発明の別の目的は、固定化酵素複
合体の調製法を提供することにあり、該方法により得ら
れる該固定化酵素複合体は不活化されず、かつ更にこの
方法により製造された該固定化酵素複合体は、他の方法
を利用して得たものを越える改良された半減期を示す。
更に別の本発明の目的は、他の方法を利用して得たもの
を越える改良された半減期を示し、結果として大幅なそ
の生産性の改善を実現する、固定化酵素複合体を提供す
ることにある。本発明の更に別の目的は、該複合体の該
酵素が該複合体に堅固に維持されているという意味で安
定であり、反応媒体中への酵素の喪失量を低減する固定
化酵素複合体を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明の教示によれば、
固定化酵素複合体の製法が記載される。この方法は、多
孔質粒状珪藻土等の固体支持体と、少なくとも１つのペ
ンダントアミノ基をもつポリアミン化合物の溶液とを接
触させる工程を含む。このようにして担体が得られる。
酵素と、少なくとも１種のアミン反応性物質の溶液とを
接触させることにより、該酵素を処理する。このアミン
反応性物質は多官能性アルデヒド、多官能性有機ハライ
ド、多官能性無水物、多官能性アゾ化合物、多官能性イ
ソチオシアネート、多官能性イソシアネートおよびその
２種以上を含むブレンドからなる群から選ばれる。この
ようにして、処理酵素−含有アダクト（以下において
は、しばしば「処理アダクト」とも言う）を生成する。
最後に、該担体と該処理アダクトとを相互に接触させ
て、安定かつ高活性の固定化酵素複合体（以下におい
て、しばしば「固定化複合体」、「酵素複合体」、処理
酵素−含有複合体」、「処理複合体」および「複合体」
等とも言う）を生成する。この点に関連して、該担体と
該処理アダクトとを、該処理アダクトの該アミン反応性
物質が該担体の該ポリアミン化合物に結合するように反
応させる。該処理アダクトと接触させる前に、該担体を
洗浄して、過剰量の該ポリアミン化合物をそこから除去
することが好ましい。好ましくは、該ポリアミン化合物
はポリエチレンジアミン、ポリエチレンイミン（例え
ば、ポリジエチレントリアミン、ポリトリエチレンテト
ラミン、ポリペンタエチレンヘキサミンまたはポリヘキ
サメチレンジアミン）、ポリメチレンジシクロヘキシル
アミン、ポリメチレンジアニリン、ポリテトラエチレン
ペンタミン、ポリフェニレンジアミンおよび２種以上の
これらポリアミン化合物のブレンドからなる群から選ば
れる。更に、該ポリアミン化合物は、500-100,000 ダル
トンの分子量を有し、かつ水溶性の上記化合物から選ぶ
ことが好ましい。該ポリアミン化合物はポリエチレンイ
ミンであることが最も好ましい。
固定化酵素複合体の製法が記載される。この方法は、多
孔質粒状珪藻土等の固体支持体と、少なくとも１つのペ
ンダントアミノ基をもつポリアミン化合物の溶液とを接
触させる工程を含む。このようにして担体が得られる。
酵素と、少なくとも１種のアミン反応性物質の溶液とを
接触させることにより、該酵素を処理する。このアミン
反応性物質は多官能性アルデヒド、多官能性有機ハライ
ド、多官能性無水物、多官能性アゾ化合物、多官能性イ
ソチオシアネート、多官能性イソシアネートおよびその
２種以上を含むブレンドからなる群から選ばれる。この
ようにして、処理酵素−含有アダクト（以下において
は、しばしば「処理アダクト」とも言う）を生成する。
最後に、該担体と該処理アダクトとを相互に接触させ
て、安定かつ高活性の固定化酵素複合体（以下におい
て、しばしば「固定化複合体」、「酵素複合体」、処理
酵素−含有複合体」、「処理複合体」および「複合体」
等とも言う）を生成する。この点に関連して、該担体と
該処理アダクトとを、該処理アダクトの該アミン反応性
物質が該担体の該ポリアミン化合物に結合するように反
応させる。該処理アダクトと接触させる前に、該担体を
洗浄して、過剰量の該ポリアミン化合物をそこから除去
することが好ましい。好ましくは、該ポリアミン化合物
はポリエチレンジアミン、ポリエチレンイミン（例え
ば、ポリジエチレントリアミン、ポリトリエチレンテト
ラミン、ポリペンタエチレンヘキサミンまたはポリヘキ
サメチレンジアミン）、ポリメチレンジシクロヘキシル
アミン、ポリメチレンジアニリン、ポリテトラエチレン
ペンタミン、ポリフェニレンジアミンおよび２種以上の
これらポリアミン化合物のブレンドからなる群から選ば
れる。更に、該ポリアミン化合物は、500-100,000 ダル
トンの分子量を有し、かつ水溶性の上記化合物から選ぶ
ことが好ましい。該ポリアミン化合物はポリエチレンイ
ミンであることが最も好ましい。
【０００６】上記アミン反応性物質は多官能性アルデヒ
ド、多官能性有機ハライド、多官能性無水物、多官能性
アゾ化合物、多官能性イソチオシアネート、多官能性イ
ソシアネートおよびその２種以上を含むブレンドからな
る群から選ばれる。該アミン反応性物質は、グルタルア
ルデヒド、サクシンジアルデヒド、テレフタルアルデヒ
ド、ビス−ジアゾベンジジン-2,2'-ジスルホン酸、4,4'
- ジフルオロ-3,3'-ジニトロジフェニルスルホン、ジフ
ェニル-4,4'-ジチオシアネート-2,2'-ジスルホン酸、3-
メトキシ−ジフェニルメタン-4,4'-ジイソシアネート、
トルエン-2- イソシアネート-4- イソチオシアネート、
トルエン-2,4- ジイソチオシアネート、ジアゾベンジジ
ン、ジアゾベンジジン-3,3'-ジアニシジン、N,N'- ヘキ
サメチレンビスアイオド−アセタミド、ヘキサメチレン
ジイソシアネート、シアヌル酸クロリド、1,5-ジフルオ
ロ-2,4- ジニトロベンゼンおよび２種以上のこれらアミ
ン反応性物質のブレンドからなる群から選ばれることが
更に好ましい。更に一層好ましくは、該アミン反応性物
質は多官能性アルデヒドからなる群から選ばれる。より
好ましくは、該アミン反応性物質はグルタルアルデヒ
ド、サクシンジアルデヒド、テレフタルアルデヒドから
なる群から選ばれる。最良の結果は、グルタルアルデヒ
ドを使用することによって得られた。該処理酵素−含有
アダクトと該洗浄担体との間の比が、該担体1g当たり該
処理アダクト約0.05ml〜約0.6 mlの範囲内にあることが
更に好ましい。更に好ましくは、該アミン反応性物質と
該酵素との間の比は、該酵素１ml当たり該アミン反応性
物質約0.10ｇ〜約1.50ｇの範囲にある。好ましい態様に
おいては、該酵素を、攪拌を含む条件下でアミン反応性
物質の溶液と接触させる。もう一つの好ましい態様にお
いては、該固定化酵素複合体を、その生成後に水で洗浄
する。
ド、多官能性有機ハライド、多官能性無水物、多官能性
アゾ化合物、多官能性イソチオシアネート、多官能性イ
ソシアネートおよびその２種以上を含むブレンドからな
る群から選ばれる。該アミン反応性物質は、グルタルア
ルデヒド、サクシンジアルデヒド、テレフタルアルデヒ
ド、ビス−ジアゾベンジジン-2,2'-ジスルホン酸、4,4'
- ジフルオロ-3,3'-ジニトロジフェニルスルホン、ジフ
ェニル-4,4'-ジチオシアネート-2,2'-ジスルホン酸、3-
メトキシ−ジフェニルメタン-4,4'-ジイソシアネート、
トルエン-2- イソシアネート-4- イソチオシアネート、
トルエン-2,4- ジイソチオシアネート、ジアゾベンジジ
ン、ジアゾベンジジン-3,3'-ジアニシジン、N,N'- ヘキ
サメチレンビスアイオド−アセタミド、ヘキサメチレン
ジイソシアネート、シアヌル酸クロリド、1,5-ジフルオ
ロ-2,4- ジニトロベンゼンおよび２種以上のこれらアミ
ン反応性物質のブレンドからなる群から選ばれることが
更に好ましい。更に一層好ましくは、該アミン反応性物
質は多官能性アルデヒドからなる群から選ばれる。より
好ましくは、該アミン反応性物質はグルタルアルデヒ
ド、サクシンジアルデヒド、テレフタルアルデヒドから
なる群から選ばれる。最良の結果は、グルタルアルデヒ
ドを使用することによって得られた。該処理酵素−含有
アダクトと該洗浄担体との間の比が、該担体1g当たり該
処理アダクト約0.05ml〜約0.6 mlの範囲内にあることが
更に好ましい。更に好ましくは、該アミン反応性物質と
該酵素との間の比は、該酵素１ml当たり該アミン反応性
物質約0.10ｇ〜約1.50ｇの範囲にある。好ましい態様に
おいては、該酵素を、攪拌を含む条件下でアミン反応性
物質の溶液と接触させる。もう一つの好ましい態様にお
いては、該固定化酵素複合体を、その生成後に水で洗浄
する。
【０００７】本明細書に記載する方法は、該アミン反応
性物質と反応性のアミノ基を含有する任意の酵素の固定
化酵素複合体を調製するのに有用である。また、２種以
上の酵素を固定化することも可能である。これら酵素は
トリプシン、パパイン、ヘキソキナーゼ、フィシン、ブ
ロメライン、乳酸デヒドロゲナーゼ、ラクターゼ、グル
コースイソメラーゼ、グルコアミラーゼ、キモトリプシ
ン、プロナーゼ、アシラーゼ、インベルターゼ、アミラ
ーゼ、プルラナーゼ、トランスグルコシダーゼ、グルコ
ースオキシダーゼ、ペプシン、プロテアーゼ、カタラー
ゼ、ヒドロラーゼ、レニン、トランスフェラーゼおよび
その混合物を包含する。これら酵素の内で好ましいもの
はグルコースイソメラーゼ、グルコアミラーゼ、インベ
ルターゼ、β−アミラーゼ、バクテリアα−アミラー
ゼ、真菌α−アミラーゼ、トランスグルコシダーゼおよ
びその混合物を包含する。これら酵素は、更に好ましく
はグルコアミラーゼ、バクテリアα−アミラーゼ、真菌
α−アミラーゼ、β−アミラーゼおよびその混合物を包
含する。良好な結果は、ソルベーエンザイムズ社(SOLVA
Y ENZYMES, Inc.)（インジアナ州、エルカート）から、
商標名ジアジム(DIAZYME) L-200 の下で市販されている
グルコアミラーゼを使用することにより得られた。良好
な結果は、またソルベーエンザイムズ社により、商標名
クララーゼ(CLARASE) L-40,000の下で市販されている真
菌α−アミラーゼを使用することによっても得られた。
最後に、良好な結果はまた商標名スペジム(SPEZYME) BB
A 1500の下で市販されているβ−アミラーゼを使用して
得られた。
性物質と反応性のアミノ基を含有する任意の酵素の固定
化酵素複合体を調製するのに有用である。また、２種以
上の酵素を固定化することも可能である。これら酵素は
トリプシン、パパイン、ヘキソキナーゼ、フィシン、ブ
ロメライン、乳酸デヒドロゲナーゼ、ラクターゼ、グル
コースイソメラーゼ、グルコアミラーゼ、キモトリプシ
ン、プロナーゼ、アシラーゼ、インベルターゼ、アミラ
ーゼ、プルラナーゼ、トランスグルコシダーゼ、グルコ
ースオキシダーゼ、ペプシン、プロテアーゼ、カタラー
ゼ、ヒドロラーゼ、レニン、トランスフェラーゼおよび
その混合物を包含する。これら酵素の内で好ましいもの
はグルコースイソメラーゼ、グルコアミラーゼ、インベ
ルターゼ、β−アミラーゼ、バクテリアα−アミラー
ゼ、真菌α−アミラーゼ、トランスグルコシダーゼおよ
びその混合物を包含する。これら酵素は、更に好ましく
はグルコアミラーゼ、バクテリアα−アミラーゼ、真菌
α−アミラーゼ、β−アミラーゼおよびその混合物を包
含する。良好な結果は、ソルベーエンザイムズ社(SOLVA
Y ENZYMES, Inc.)（インジアナ州、エルカート）から、
商標名ジアジム(DIAZYME) L-200 の下で市販されている
グルコアミラーゼを使用することにより得られた。良好
な結果は、またソルベーエンザイムズ社により、商標名
クララーゼ(CLARASE) L-40,000の下で市販されている真
菌α−アミラーゼを使用することによっても得られた。
最後に、良好な結果はまた商標名スペジム(SPEZYME) BB
A 1500の下で市販されているβ−アミラーゼを使用して
得られた。
【０００８】本発明の教示によれば、固定化グルコアミ
ラーゼ複合体の調製法を記載する。この方法は固体支持
体とポリエチレンイミンの溶液とを接触させる工程を含
む。このようにして、担体を得る。このグルコアミラー
ゼをグルタルアルデヒドの溶液と接触させて処理する。
このようにして、処理グルコアミラーゼ−含有アダクト
を形成する。最後に、該担体と該処理グルコアミラーゼ
−含有アダクトとを相互に接触させて、これらを反応さ
せ、安定かつ高活性の固定化グルコアミラーゼ複合体を
形成する。好ましくは、該固体支持体は多孔質のもので
ある。最も好ましくは、該固体支持体は多孔質粒状珪藻
土である。更に、本発明の教示によれば、固定化真菌α
−アミラーゼ複合体の製法を記載する。この方法は、固
体支持体とポリエチレンイミンの溶液とを接触させる工
程を含む。このようにして、担体が得られる。該真菌α
−アミラーゼをグルタルアルデヒドの溶液と接触させ
て、該α−アミラーゼを処理する。このようにして、処
理α−アミラーゼ−含有アダクトを形成する。最後に、
該担体と該処理α−アミラーゼ−含有アダクトとを相互
に接触させて、これらを反応させ、安定かつ高活性の固
定化真菌α−アミラーゼ複合体を形成する。更に別の本
発明の教示によれば、固定化β−アミラーゼ複合体の製
法を記載する。この方法は、固体支持体とポリエチレン
イミンの溶液とを接触させる工程を含む。このようにし
て、担体が得られる。該β−アミラーゼをグルタルアル
デヒドの溶液と接触させて、該β−アミラーゼを処理す
る。このようにして、処理β−アミラーゼ−含有アダク
トを形成する。最後に、該担体と該処理β−アミラーゼ
−含有アダクトとを相互に接触させて、これらを反応さ
せ、安定かつ高活性の固定化β−アミラーゼ複合体を形
成する。
ラーゼ複合体の調製法を記載する。この方法は固体支持
体とポリエチレンイミンの溶液とを接触させる工程を含
む。このようにして、担体を得る。このグルコアミラー
ゼをグルタルアルデヒドの溶液と接触させて処理する。
このようにして、処理グルコアミラーゼ−含有アダクト
を形成する。最後に、該担体と該処理グルコアミラーゼ
−含有アダクトとを相互に接触させて、これらを反応さ
せ、安定かつ高活性の固定化グルコアミラーゼ複合体を
形成する。好ましくは、該固体支持体は多孔質のもので
ある。最も好ましくは、該固体支持体は多孔質粒状珪藻
土である。更に、本発明の教示によれば、固定化真菌α
−アミラーゼ複合体の製法を記載する。この方法は、固
体支持体とポリエチレンイミンの溶液とを接触させる工
程を含む。このようにして、担体が得られる。該真菌α
−アミラーゼをグルタルアルデヒドの溶液と接触させ
て、該α−アミラーゼを処理する。このようにして、処
理α−アミラーゼ−含有アダクトを形成する。最後に、
該担体と該処理α−アミラーゼ−含有アダクトとを相互
に接触させて、これらを反応させ、安定かつ高活性の固
定化真菌α−アミラーゼ複合体を形成する。更に別の本
発明の教示によれば、固定化β−アミラーゼ複合体の製
法を記載する。この方法は、固体支持体とポリエチレン
イミンの溶液とを接触させる工程を含む。このようにし
て、担体が得られる。該β−アミラーゼをグルタルアル
デヒドの溶液と接触させて、該β−アミラーゼを処理す
る。このようにして、処理β−アミラーゼ−含有アダク
トを形成する。最後に、該担体と該処理β−アミラーゼ
−含有アダクトとを相互に接触させて、これらを反応さ
せ、安定かつ高活性の固定化β−アミラーゼ複合体を形
成する。
【０００９】本発明のもう一つの局面によれば、他の方
法によって得た複合体を越える改良された半減期をも
つ、安定で高活性の固定化酵素複合体を開示し、これに
よりその生産性の大幅な改良が実現される。本発明の教
示によれば、固定化酵素複合体を開示する。これらの固
定化酵素複合体は担体と処理アダクトとを含む。該担体
は少なくとも１つのペンダントアミノ基をもつポリアミ
ン化合物を含む。固体支持体をこのポリアミン化合物に
結合して、該担体を形成する。該処理アダクトは少なく
とも１種のアミン反応性物質を含む。このアミン反応性
物質は多官能性アルデヒド、多官能性有機ハライド、多
官能性無水物、多官能性アゾ化合物、多官能性イソチオ
シアネート、多官能性イソシアネートおよび２種以上の
これら物質のブレンドからなる群から選ばれるものであ
る。少なくとも１種の酵素をこの（少なくとも１種の）
アミン反応性物質と結合することにより、該酵素を処理
し、該処理酵素−含有アダクトを形成する。最後に、該
処理酵素を含む該処理アダクトを該担体と結合して、安
定な高活性の固定化酵素複合体を形成する。好ましく
は、該固体支持体は多孔性のものである。該固体支持体
が多孔性の粒状珪藻土であることが特に好ましい。好ま
しくは、該ポリアミン化合物はポリエチレンジアミン、
ポリエチレンイミン（例えば、ポリジエチレントリアミ
ン、ポリトリエチレンテトラミン、ポリペンタエチレン
ヘキサミンまたはポリヘキサメチレンジアミン）、ポリ
メチレンジシクロヘキシルアミン、ポリメチレンジアニ
リン、ポリテトラエチレンペンタミン、ポリフェニレン
ジアミンおよび２種以上のこれらポリアミン化合物のブ
レンドからなる群から選ばれる。更に、該ポリアミン化
合物は、500-100,000 ダルトンの分子量を有し、かつ水
溶性の上記化合物から選ぶことが好ましい。該ポリアミ
ン化合物はポリエチレンイミンであることが最も好まし
い。
法によって得た複合体を越える改良された半減期をも
つ、安定で高活性の固定化酵素複合体を開示し、これに
よりその生産性の大幅な改良が実現される。本発明の教
示によれば、固定化酵素複合体を開示する。これらの固
定化酵素複合体は担体と処理アダクトとを含む。該担体
は少なくとも１つのペンダントアミノ基をもつポリアミ
ン化合物を含む。固体支持体をこのポリアミン化合物に
結合して、該担体を形成する。該処理アダクトは少なく
とも１種のアミン反応性物質を含む。このアミン反応性
物質は多官能性アルデヒド、多官能性有機ハライド、多
官能性無水物、多官能性アゾ化合物、多官能性イソチオ
シアネート、多官能性イソシアネートおよび２種以上の
これら物質のブレンドからなる群から選ばれるものであ
る。少なくとも１種の酵素をこの（少なくとも１種の）
アミン反応性物質と結合することにより、該酵素を処理
し、該処理酵素−含有アダクトを形成する。最後に、該
処理酵素を含む該処理アダクトを該担体と結合して、安
定な高活性の固定化酵素複合体を形成する。好ましく
は、該固体支持体は多孔性のものである。該固体支持体
が多孔性の粒状珪藻土であることが特に好ましい。好ま
しくは、該ポリアミン化合物はポリエチレンジアミン、
ポリエチレンイミン（例えば、ポリジエチレントリアミ
ン、ポリトリエチレンテトラミン、ポリペンタエチレン
ヘキサミンまたはポリヘキサメチレンジアミン）、ポリ
メチレンジシクロヘキシルアミン、ポリメチレンジアニ
リン、ポリテトラエチレンペンタミン、ポリフェニレン
ジアミンおよび２種以上のこれらポリアミン化合物のブ
レンドからなる群から選ばれる。更に、該ポリアミン化
合物は、500-100,000 ダルトンの分子量を有し、かつ水
溶性の上記化合物から選ぶことが好ましい。該ポリアミ
ン化合物はポリエチレンイミンであることが最も好まし
い。
【００１０】上記アミン反応性物質は多官能性アルデヒ
ド、多官能性有機ハライド、多官能性無水物、多官能性
アゾ化合物、多官能性イソチオシアネート、多官能性イ
ソシアネートおよびその２種以上を含むブレンドからな
る群から選ばれる。該アミン反応性物質は、グルタルア
ルデヒド、サクシンジアルデヒド、テレフタルアルデヒ
ド、ビス−ジアゾベンジジン-2,2'-ジスルホン酸、4,4'
- ジフルオロ-3,3'-ジニトロジフェニルスルホン、ジフ
ェニル-4,4'-ジチオシアネート-2,2'-ジスルホン酸、3-
メトキシ−ジフェニルメタン-4,4'-ジイソシアネート、
トルエン-2- イソシアネート-4- イソチオシアネート、
トルエン-2,4- ジイソチオシアネート、ジアゾベンジジ
ン、ジアゾベンジジン-3,3'-ジアニシジン、N,N'- ヘキ
サメチレンビスアイオド−アセタミド、ヘキサメチレン
ジイソシアネート、シアヌル酸クロリド、1,5-ジフルオ
ロ-2,4- ジニトロベンゼンおよび２種以上のこれらアミ
ン反応性物質のブレンドからなる群から選ばれることが
更に好ましい。更に一層好ましくは、該アミン反応性物
質は多官能性アルデヒドからなる群から選ばれる。より
好ましくは、該アミン反応性物質はグルタルアルデヒ
ド、サクシンジアルデヒドおよびテレフタルアルデヒド
からなる群から選ばれる。最良の結果は、グルタルアル
デヒドを使用することによって得られた。該処理酵素−
含有アダクトと該担体との間の比は、該担体1g当たり該
処理アダクト約0.05ml〜約0.6 mlの範囲にあることが更
に好ましい。更に好ましくは、該アミン反応性物質と該
酵素との間の比は、該酵素１ml当たり該アミン反応性物
質約0.10ｇ〜約1.50ｇの範囲にある。本明細書に記載さ
れた固定化酵素複合体は、該アミン反応性物質と反応で
きるアミノ基を含有する任意の酵素を包含する。
ド、多官能性有機ハライド、多官能性無水物、多官能性
アゾ化合物、多官能性イソチオシアネート、多官能性イ
ソシアネートおよびその２種以上を含むブレンドからな
る群から選ばれる。該アミン反応性物質は、グルタルア
ルデヒド、サクシンジアルデヒド、テレフタルアルデヒ
ド、ビス−ジアゾベンジジン-2,2'-ジスルホン酸、4,4'
- ジフルオロ-3,3'-ジニトロジフェニルスルホン、ジフ
ェニル-4,4'-ジチオシアネート-2,2'-ジスルホン酸、3-
メトキシ−ジフェニルメタン-4,4'-ジイソシアネート、
トルエン-2- イソシアネート-4- イソチオシアネート、
トルエン-2,4- ジイソチオシアネート、ジアゾベンジジ
ン、ジアゾベンジジン-3,3'-ジアニシジン、N,N'- ヘキ
サメチレンビスアイオド−アセタミド、ヘキサメチレン
ジイソシアネート、シアヌル酸クロリド、1,5-ジフルオ
ロ-2,4- ジニトロベンゼンおよび２種以上のこれらアミ
ン反応性物質のブレンドからなる群から選ばれることが
更に好ましい。更に一層好ましくは、該アミン反応性物
質は多官能性アルデヒドからなる群から選ばれる。より
好ましくは、該アミン反応性物質はグルタルアルデヒ
ド、サクシンジアルデヒドおよびテレフタルアルデヒド
からなる群から選ばれる。最良の結果は、グルタルアル
デヒドを使用することによって得られた。該処理酵素−
含有アダクトと該担体との間の比は、該担体1g当たり該
処理アダクト約0.05ml〜約0.6 mlの範囲にあることが更
に好ましい。更に好ましくは、該アミン反応性物質と該
酵素との間の比は、該酵素１ml当たり該アミン反応性物
質約0.10ｇ〜約1.50ｇの範囲にある。本明細書に記載さ
れた固定化酵素複合体は、該アミン反応性物質と反応で
きるアミノ基を含有する任意の酵素を包含する。
【００１１】本発明の教示に従えば、固定化グルコアミ
ラーゼ複合体が記載される。この固定化グルコアミラー
ゼ複合体は担体と処理アダクトとを含む。該担体はポリ
エチレンイミンを含む。固体支持体を該ポリエチレンイ
ミンと結合して、該担体を形成する。該処理アダクトは
グルタルアルデヒドを含む。グルコアミラーゼをこのグ
ルタルアルデヒドに結合することにより、該グルコアミ
ラーゼを処理し、該処理アダクトを生成する。最後に、
該処理グルコアミラーゼを含有する該処理アダクトと該
担体とを結合することにより、安定で高活性の固定化グ
ルコアミラーゼ複合体を生成する。本発明の更なる教示
に従えば、固定化真菌α−アミラーゼ複合体が記載され
る。この固定化真菌α−アミラーゼ複合体は担体と処理
アダクトとを含む。該担体はポリエチレンイミンを含
む。固体支持体を該ポリエチレンイミンと結合して、該
担体を形成する。該処理アダクトはグルタルアルデヒド
を含む。真菌α−アミラーゼをこのグルタルアルデヒド
に結合することにより、該真菌α−アミラーゼを処理
し、該処理アダクトを生成する。最後に、該処理真菌α
−アミラーゼ−含有アダクトと該担体とを結合すること
により、安定で高活性の固定化真菌α−アミラーゼ複合
体を生成する。更に別の本発明の教示に従えば、固定化
β−アミラーゼ複合体が記載される。この固定化β−ア
ミラーゼ複合体は担体と処理アダクトとを含む。該担体
はポリエチレンイミンを含む。固体支持体を該ポリエチ
レンイミンと結合して、該担体を形成する。該処理アダ
クトはグルタルアルデヒドを含む。β−アミラーゼをこ
のグルタルアルデヒドに結合することにより、該β−ア
ミラーゼを処理し、該処理アダクトを生成する。最後
に、該処理β−アミラーゼ−含有アダクトと該担体とを
結合することにより、安定で高活性の固定化β−アミラ
ーゼ複合体を生成する。
ラーゼ複合体が記載される。この固定化グルコアミラー
ゼ複合体は担体と処理アダクトとを含む。該担体はポリ
エチレンイミンを含む。固体支持体を該ポリエチレンイ
ミンと結合して、該担体を形成する。該処理アダクトは
グルタルアルデヒドを含む。グルコアミラーゼをこのグ
ルタルアルデヒドに結合することにより、該グルコアミ
ラーゼを処理し、該処理アダクトを生成する。最後に、
該処理グルコアミラーゼを含有する該処理アダクトと該
担体とを結合することにより、安定で高活性の固定化グ
ルコアミラーゼ複合体を生成する。本発明の更なる教示
に従えば、固定化真菌α−アミラーゼ複合体が記載され
る。この固定化真菌α−アミラーゼ複合体は担体と処理
アダクトとを含む。該担体はポリエチレンイミンを含
む。固体支持体を該ポリエチレンイミンと結合して、該
担体を形成する。該処理アダクトはグルタルアルデヒド
を含む。真菌α−アミラーゼをこのグルタルアルデヒド
に結合することにより、該真菌α−アミラーゼを処理
し、該処理アダクトを生成する。最後に、該処理真菌α
−アミラーゼ−含有アダクトと該担体とを結合すること
により、安定で高活性の固定化真菌α−アミラーゼ複合
体を生成する。更に別の本発明の教示に従えば、固定化
β−アミラーゼ複合体が記載される。この固定化β−ア
ミラーゼ複合体は担体と処理アダクトとを含む。該担体
はポリエチレンイミンを含む。固体支持体を該ポリエチ
レンイミンと結合して、該担体を形成する。該処理アダ
クトはグルタルアルデヒドを含む。β−アミラーゼをこ
のグルタルアルデヒドに結合することにより、該β−ア
ミラーゼを処理し、該処理アダクトを生成する。最後
に、該処理β−アミラーゼ−含有アダクトと該担体とを
結合することにより、安定で高活性の固定化β−アミラ
ーゼ複合体を生成する。
【００１２】本発明の教示に従えば、担体と処理アダク
トとを含む固定化酵素複合体が記載される。該処理アダ
クトは、多官能性アルデヒド、多官能性有機ハライド、
多官能性無水物、多官能性アゾ化合物、多官能性イソチ
オシアネート、多官能性イソシアネートおよび２種以上
のこれら物質のブレンドからなる群から選ばれる少なく
とも１種のアミン反応性物質を含む。該処理アダクトは
更に、該少なくとも１種のアミン反応性物質と結合した
少なくとも１種の酵素をも含む。このようにして、該酵
素を処理し、処理酵素−含有アダクトを形成する。最後
に、該処理酵素−含有アダクトと該担体とを結合するこ
とにより、安定で高活性の固定化酵素複合体を生成す
る。更に他の本発明の教示に従えば、固定化酵素複合体
を調製するのに使用する処理アダクトが記載される。該
処理アダクトは、多官能性アルデヒド、多官能性有機ハ
ライド、多官能性無水物、多官能性アゾ化合物、多官能
性イソチオシアネート、多官能性イソシアネートおよび
２種以上のこれら物質のブレンドからなる群から選ばれ
る少なくとも１種のアミン反応性物質を含む。該処理ア
ダクトは更に、該少なくとも１種のアミン反応性物質と
結合した少なくとも１種の酵素をも含む。このようにし
て、該酵素を処理し、処理酵素−含有アダクトを形成す
る。これらの並びに他の本発明の目的並びに利点は、本
発明の好ましい態様と関連して述べられる以下の記載を
参照することにより、更に容易に理解されるであろう。
本発明の方法は、高活性かつ安定である新規な固定化酵
素複合体であって、該酵素が該複合体に堅固に維持され
た該複合体の調製のために有用である。
トとを含む固定化酵素複合体が記載される。該処理アダ
クトは、多官能性アルデヒド、多官能性有機ハライド、
多官能性無水物、多官能性アゾ化合物、多官能性イソチ
オシアネート、多官能性イソシアネートおよび２種以上
のこれら物質のブレンドからなる群から選ばれる少なく
とも１種のアミン反応性物質を含む。該処理アダクトは
更に、該少なくとも１種のアミン反応性物質と結合した
少なくとも１種の酵素をも含む。このようにして、該酵
素を処理し、処理酵素−含有アダクトを形成する。最後
に、該処理酵素−含有アダクトと該担体とを結合するこ
とにより、安定で高活性の固定化酵素複合体を生成す
る。更に他の本発明の教示に従えば、固定化酵素複合体
を調製するのに使用する処理アダクトが記載される。該
処理アダクトは、多官能性アルデヒド、多官能性有機ハ
ライド、多官能性無水物、多官能性アゾ化合物、多官能
性イソチオシアネート、多官能性イソシアネートおよび
２種以上のこれら物質のブレンドからなる群から選ばれ
る少なくとも１種のアミン反応性物質を含む。該処理ア
ダクトは更に、該少なくとも１種のアミン反応性物質と
結合した少なくとも１種の酵素をも含む。このようにし
て、該酵素を処理し、処理酵素−含有アダクトを形成す
る。これらの並びに他の本発明の目的並びに利点は、本
発明の好ましい態様と関連して述べられる以下の記載を
参照することにより、更に容易に理解されるであろう。
本発明の方法は、高活性かつ安定である新規な固定化酵
素複合体であって、該酵素が該複合体に堅固に維持され
た該複合体の調製のために有用である。
【００１３】本明細書に記載される方法にとって有用な
酵素は、上記アミン反応性物質と反応性のアミノ基を含
む任意の酵素を包含する。また、２種以上の酵素を同一
の複合体中に固定化することもできる。これらの酵素は
トリプシン、パパイン、ヘキソキナーゼ、フィシン、ブ
ロメライン、乳酸デヒドロゲナーゼ、ラクターゼ、グル
コースイソメラーゼ、グルコアミラーゼ、キモトリプシ
ン、プロナーゼ、アシラーゼ、インベルターゼ、アミラ
ーゼ、プルラナーゼ、トランスグルコシダーゼ、グルコ
ースオキシダーゼ、ペプシン、プロテアーゼ、カタラー
ゼ、ヒドロラーゼ、レニン、トランスフェラーゼおよび
その混合物を包含する。これら酵素の内で好ましいもの
はグルコースイソメラーゼ、グルコアミラーゼ、インベ
ルターゼ、β−アミラーゼ、バクテリアα−アミラー
ゼ、真菌α−アミラーゼ、トランスグルコシダーゼおよ
びその混合物を包含する。これら酵素は、更に好ましく
はグルコアミラーゼ、バクテリアα−アミラーゼ、真菌
α−アミラーゼ、β−アミラーゼおよびその混合物を包
含する。良好な結果は、ソルベーエンザイムズ社(SOLVA
Y ENZYMES, Inc.)（インジアナ州、エルカート）から、
商標名ジアジム(DIAZYME) L-200 の下で市販されている
グルコアミラーゼを使用することにより得られた。良好
な結果は、またソルベーエンザイムズ社により、商標名
クララーゼ(CLARASE) L-40,000の下で市販されている真
菌α−アミラーゼを使用することによっても得られた。
更に、良好な結果はまた商標名スペジム(SPEZYME) BBA
1500の下で市販されているβ−アミラーゼを使用して得
られた。
酵素は、上記アミン反応性物質と反応性のアミノ基を含
む任意の酵素を包含する。また、２種以上の酵素を同一
の複合体中に固定化することもできる。これらの酵素は
トリプシン、パパイン、ヘキソキナーゼ、フィシン、ブ
ロメライン、乳酸デヒドロゲナーゼ、ラクターゼ、グル
コースイソメラーゼ、グルコアミラーゼ、キモトリプシ
ン、プロナーゼ、アシラーゼ、インベルターゼ、アミラ
ーゼ、プルラナーゼ、トランスグルコシダーゼ、グルコ
ースオキシダーゼ、ペプシン、プロテアーゼ、カタラー
ゼ、ヒドロラーゼ、レニン、トランスフェラーゼおよび
その混合物を包含する。これら酵素の内で好ましいもの
はグルコースイソメラーゼ、グルコアミラーゼ、インベ
ルターゼ、β−アミラーゼ、バクテリアα−アミラー
ゼ、真菌α−アミラーゼ、トランスグルコシダーゼおよ
びその混合物を包含する。これら酵素は、更に好ましく
はグルコアミラーゼ、バクテリアα−アミラーゼ、真菌
α−アミラーゼ、β−アミラーゼおよびその混合物を包
含する。良好な結果は、ソルベーエンザイムズ社(SOLVA
Y ENZYMES, Inc.)（インジアナ州、エルカート）から、
商標名ジアジム(DIAZYME) L-200 の下で市販されている
グルコアミラーゼを使用することにより得られた。良好
な結果は、またソルベーエンザイムズ社により、商標名
クララーゼ(CLARASE) L-40,000の下で市販されている真
菌α−アミラーゼを使用することによっても得られた。
更に、良好な結果はまた商標名スペジム(SPEZYME) BBA
1500の下で市販されているβ−アミラーゼを使用して得
られた。
【００１４】本発明の方法は、以前に記載された方法と
は、グルタルアルデヒド等のアミン反応性物質の溶液と
酵素とを接触させて、（処理酵素−含有）処理アダクト
を形成し、その後該処理酵素−含有アダクトを該担体に
結合する工程を含む点で異なっている。以前は理解され
ていなかったが、このようにして該酵素を処理した後
に、該担体と反応（結合）させ、該処理アダクトを後に
該担体と接触（反応）させた場合に、該処理酵素がかく
して生成される固定化酵素複合体中でより堅固に結合
し、および／またはその中により堅固に維持（封入）さ
れるものと考えられる〔これは、該反応媒体から該固定
化複合体を除去した後に、該媒体中に存在する酵素活性
の大きさ（量）により測定される。このような酵素活性
の量は、該酵素複合体から該複合体の使用中に失われた
酵素活性の量に等しい〕。該酵素と、該アミン反応性物
質とを接触させることによる該アダクトの形成、および
これにより生成された化合物、組成物並びに成分に関連
して本明細書で使用した用語「処理（された）」とは、
該酵素と該アミン反応性物質との接触によりそのアダク
トを形成する実際の工程並びに該酵素の構造およびこの
ような接触（または処理）により形成される化合物およ
び／または組成物を意味する。従って、例えば本明細書
で使用する「処理」酵素とは、本明細書に記載したよう
な、該アミン反応性物質と接触させた酵素であり、並び
にこのような接触の結果として、例えば（例示のみの目
的で）強力な（緊密な）該酵素を包含する共有結合、お
よび／または該酵素を包含する架橋結合および／または
該酵素の封入より高い「維持」力を有する化合物に転化
されたものである。本発明の方法を利用することによ
り、改良された長期間に及ぶ安定性並びに高い全体とし
ての活性をもつ固定化酵素複合体を提供することが可能
となる。
は、グルタルアルデヒド等のアミン反応性物質の溶液と
酵素とを接触させて、（処理酵素−含有）処理アダクト
を形成し、その後該処理酵素−含有アダクトを該担体に
結合する工程を含む点で異なっている。以前は理解され
ていなかったが、このようにして該酵素を処理した後
に、該担体と反応（結合）させ、該処理アダクトを後に
該担体と接触（反応）させた場合に、該処理酵素がかく
して生成される固定化酵素複合体中でより堅固に結合
し、および／またはその中により堅固に維持（封入）さ
れるものと考えられる〔これは、該反応媒体から該固定
化複合体を除去した後に、該媒体中に存在する酵素活性
の大きさ（量）により測定される。このような酵素活性
の量は、該酵素複合体から該複合体の使用中に失われた
酵素活性の量に等しい〕。該酵素と、該アミン反応性物
質とを接触させることによる該アダクトの形成、および
これにより生成された化合物、組成物並びに成分に関連
して本明細書で使用した用語「処理（された）」とは、
該酵素と該アミン反応性物質との接触によりそのアダク
トを形成する実際の工程並びに該酵素の構造およびこの
ような接触（または処理）により形成される化合物およ
び／または組成物を意味する。従って、例えば本明細書
で使用する「処理」酵素とは、本明細書に記載したよう
な、該アミン反応性物質と接触させた酵素であり、並び
にこのような接触の結果として、例えば（例示のみの目
的で）強力な（緊密な）該酵素を包含する共有結合、お
よび／または該酵素を包含する架橋結合および／または
該酵素の封入より高い「維持」力を有する化合物に転化
されたものである。本発明の方法を利用することによ
り、改良された長期間に及ぶ安定性並びに高い全体とし
ての活性をもつ固定化酵素複合体を提供することが可能
となる。
【００１５】この本発明の固定化酵素複合体は、担体と
処理酵素−含有アダクトを含む。これら複合体におい
て、該酵素を該アダクトのアミン反応性物質と接触させ
ることにより処理（反応）した後に、該処理酵素−含有
アダクトを担体に結合する。このような該酵素の処理
は、(1) 多数の、該複合体および／または該酵素を含む
結合（共有結合を含む）の数を有し、および／または
(2) 該処理酵素と該固定化酵素複合体の残部との間の多
数の架橋を含んでいて、マトリックス（または改良され
たマトリックス）を形成して、その内部に該酵素を堅固
に保持（または取り込んだ）、固定化酵素複合体を与え
る。ここに記載する好ましい方法は、固体支持体と、少
なくとも１つのペンダントアミノ基を含むポリアミン化
合物の溶液とを接触させることにより、別途に該処理ア
ダクトから該担体を生成することを含む。該固体支持体
が多孔質粒状珪藻土であるこのような工程は、米国特許
第4,713,333 号に十分に記載されており、その内容を本
発明の参考とする。用語「少なくとも１つのペンダント
アミノ基を含むポリアミン化合物」とは、本明細書にお
いて、上記のアミン反応性物質との反応に有効な少なく
とも１個のアミノ基を有する任意のポリアミン化合物を
意味する。本発明において使用するのに適したこのよう
なポリアミン化合物の具体的な例はポリエチレンジアミ
ン、ポリエチレンイミン（例えば、ポリジエチレントリ
アミン、ポリトリエチレンテトラミン、ポリペンタエチ
レンヘキサミンまたはポリヘキサメチレンジアミン）、
ポリメチレンジシクロヘキシルアミン、ポリメチレンジ
アニリン、ポリテトラエチレンペンタミン、ポリフェニ
レンジアミンおよび２種以上のこれらポリアミン化合物
のブレンドからなる群から選ばれる。好ましいものは、
水溶性の上記ポリアミンである。該ポリアミン化合物の
分子量は特に制限されないと考えられるが、更に好まし
くは、500-100,000 ダルトンの分子量を有する上記のポ
リアミン化合物である。該ポリアミン化合物はポリエチ
レンイミンであることが最も好ましい。
処理酵素−含有アダクトを含む。これら複合体におい
て、該酵素を該アダクトのアミン反応性物質と接触させ
ることにより処理（反応）した後に、該処理酵素−含有
アダクトを担体に結合する。このような該酵素の処理
は、(1) 多数の、該複合体および／または該酵素を含む
結合（共有結合を含む）の数を有し、および／または
(2) 該処理酵素と該固定化酵素複合体の残部との間の多
数の架橋を含んでいて、マトリックス（または改良され
たマトリックス）を形成して、その内部に該酵素を堅固
に保持（または取り込んだ）、固定化酵素複合体を与え
る。ここに記載する好ましい方法は、固体支持体と、少
なくとも１つのペンダントアミノ基を含むポリアミン化
合物の溶液とを接触させることにより、別途に該処理ア
ダクトから該担体を生成することを含む。該固体支持体
が多孔質粒状珪藻土であるこのような工程は、米国特許
第4,713,333 号に十分に記載されており、その内容を本
発明の参考とする。用語「少なくとも１つのペンダント
アミノ基を含むポリアミン化合物」とは、本明細書にお
いて、上記のアミン反応性物質との反応に有効な少なく
とも１個のアミノ基を有する任意のポリアミン化合物を
意味する。本発明において使用するのに適したこのよう
なポリアミン化合物の具体的な例はポリエチレンジアミ
ン、ポリエチレンイミン（例えば、ポリジエチレントリ
アミン、ポリトリエチレンテトラミン、ポリペンタエチ
レンヘキサミンまたはポリヘキサメチレンジアミン）、
ポリメチレンジシクロヘキシルアミン、ポリメチレンジ
アニリン、ポリテトラエチレンペンタミン、ポリフェニ
レンジアミンおよび２種以上のこれらポリアミン化合物
のブレンドからなる群から選ばれる。好ましいものは、
水溶性の上記ポリアミンである。該ポリアミン化合物の
分子量は特に制限されないと考えられるが、更に好まし
くは、500-100,000 ダルトンの分子量を有する上記のポ
リアミン化合物である。該ポリアミン化合物はポリエチ
レンイミンであることが最も好ましい。
【００１６】水溶性のこれらポリアミン化合物はその水
性溶液から、該粒状珪藻土に適用され、一方で非水溶性
のポリマーは有機溶媒、例えばメチルアルコール、エチ
ルアルコール、プロピルアルコールの溶液から該珪藻土
に適用される。一般に、該担体に対して、該固体支持体
（例えば、多孔質粒状珪藻土）1g当たり少なくとも約10
mgのポリアミン化合物を使用する。好ましくは、該固体
支持体1g当たり少なくとも約15mgのポリアミン化合物を
使用する。一般に、該担体に対して、該固体支持体（例
えば、多孔質粒状珪藻土）1g当たり約60mg以下のポリア
ミン化合物を使用する。好ましくは、該固体支持体1g当
たり約25mg以下のポリアミン化合物を使用する。該ポリ
アミン化合物と該珪藻土との間の好ましい比は、該固体
支持体1g当たり約10mg〜約60mgのポリアミン化合物なる
比率である。最も好ましくは、この比は該固体支持体
（例えば、多孔質粒状珪藻土）1g当たり約15mg〜約25mg
のポリアミン化合物なる比率である。使用する該ポリア
ミン化合物の溶液は、該溶液の溶媒（例えば、水）に対
してポリアミン化合物約1%(wt/vol)〜約0.01%(wt/vol)
なる濃度を有する。この溶液中のポリアミン化合物を、
約10mlの該粒状珪藻土に対して該ポリアミン化合物の溶
液約50mlなる比で、該粒状珪藻土に添加する。該ポリア
ミンとの反応に適し、かつ該処理アダクトの処理酵素を
支持するのに適した任意の固体支持体を本発明において
使用できる。このような固体支持体は多孔質であること
が好ましい。この点に関連して、使用する該固体支持体
が多孔質粒状珪藻土であることが特に好ましい。
性溶液から、該粒状珪藻土に適用され、一方で非水溶性
のポリマーは有機溶媒、例えばメチルアルコール、エチ
ルアルコール、プロピルアルコールの溶液から該珪藻土
に適用される。一般に、該担体に対して、該固体支持体
（例えば、多孔質粒状珪藻土）1g当たり少なくとも約10
mgのポリアミン化合物を使用する。好ましくは、該固体
支持体1g当たり少なくとも約15mgのポリアミン化合物を
使用する。一般に、該担体に対して、該固体支持体（例
えば、多孔質粒状珪藻土）1g当たり約60mg以下のポリア
ミン化合物を使用する。好ましくは、該固体支持体1g当
たり約25mg以下のポリアミン化合物を使用する。該ポリ
アミン化合物と該珪藻土との間の好ましい比は、該固体
支持体1g当たり約10mg〜約60mgのポリアミン化合物なる
比率である。最も好ましくは、この比は該固体支持体
（例えば、多孔質粒状珪藻土）1g当たり約15mg〜約25mg
のポリアミン化合物なる比率である。使用する該ポリア
ミン化合物の溶液は、該溶液の溶媒（例えば、水）に対
してポリアミン化合物約1%(wt/vol)〜約0.01%(wt/vol)
なる濃度を有する。この溶液中のポリアミン化合物を、
約10mlの該粒状珪藻土に対して該ポリアミン化合物の溶
液約50mlなる比で、該粒状珪藻土に添加する。該ポリア
ミンとの反応に適し、かつ該処理アダクトの処理酵素を
支持するのに適した任意の固体支持体を本発明において
使用できる。このような固体支持体は多孔質であること
が好ましい。この点に関連して、使用する該固体支持体
が多孔質粒状珪藻土であることが特に好ましい。
【００１７】任意の粒状珪藻土が本発明において使用可
能である。極めて適した粒状珪藻土は約72メッシュを越
える粒径をもち、約52メッシュを越える粒径が好まし
く、また約40メッシュを越える粒径が最も好ましい。極
めて適した粒状珪藻土は、また約10メッシュより小さ
な、好ましくは約14メッシュより小さな粒径をもつ。特
に良好な結果は、約16メッシュより小さな粒径をもつ粒
状珪藻土を使用することにより得られた〔このようなメ
ッシュサイズは米国篩シリーズに基いて測定したもので
ある〕。粒状珪藻土の孔の寸法は、その半径として、好
ましくは約35Å〜約1000Åの範囲である。この粒状珪藻
土は約20m2/g〜約60m2/gの範囲の表面積を有する。上記
の如く調製した該担体を、次いで好ましくは該担体から
遊離のポリアミン化合物を除去するのに有効な任意の適
当な化合物を用いて洗浄する。この洗浄に水を使用する
ことが好ましい。この洗浄については、米国特許第4,71
3,333 号に十分に記載されており、その内容を本発明の
参考とする。この担体の調製とは別に、上記の処理アダ
クトを生成する。この処理アダクトは、酵素とアミン反
応性物質の溶液とを接触させ、該酵素を該アミン反応性
物質で処理することにより形成され、かくして該処理酵
素−含有アダクトが形成される。「アミン反応性物質」
なる用語は、本発明において、アミノ基との反応に有効
な任意の化合物を意味する。このアミン反応性物質は多
官能性アルデヒド、多官能性有機ハライド、多官能性無
水物、多官能性アゾ化合物、多官能性イソチオシアネー
ト、多官能性イソシアネートおよび２種以上のこれら物
質のブレンドからなる群から選ばれる。
能である。極めて適した粒状珪藻土は約72メッシュを越
える粒径をもち、約52メッシュを越える粒径が好まし
く、また約40メッシュを越える粒径が最も好ましい。極
めて適した粒状珪藻土は、また約10メッシュより小さ
な、好ましくは約14メッシュより小さな粒径をもつ。特
に良好な結果は、約16メッシュより小さな粒径をもつ粒
状珪藻土を使用することにより得られた〔このようなメ
ッシュサイズは米国篩シリーズに基いて測定したもので
ある〕。粒状珪藻土の孔の寸法は、その半径として、好
ましくは約35Å〜約1000Åの範囲である。この粒状珪藻
土は約20m2/g〜約60m2/gの範囲の表面積を有する。上記
の如く調製した該担体を、次いで好ましくは該担体から
遊離のポリアミン化合物を除去するのに有効な任意の適
当な化合物を用いて洗浄する。この洗浄に水を使用する
ことが好ましい。この洗浄については、米国特許第4,71
3,333 号に十分に記載されており、その内容を本発明の
参考とする。この担体の調製とは別に、上記の処理アダ
クトを生成する。この処理アダクトは、酵素とアミン反
応性物質の溶液とを接触させ、該酵素を該アミン反応性
物質で処理することにより形成され、かくして該処理酵
素−含有アダクトが形成される。「アミン反応性物質」
なる用語は、本発明において、アミノ基との反応に有効
な任意の化合物を意味する。このアミン反応性物質は多
官能性アルデヒド、多官能性有機ハライド、多官能性無
水物、多官能性アゾ化合物、多官能性イソチオシアネー
ト、多官能性イソシアネートおよび２種以上のこれら物
質のブレンドからなる群から選ばれる。
【００１８】本明細書において使用する、該アミン反応
性物質を含む種々の化合物を表すのに使用する「多官能
性」なる用語は、酵素と接触させた場合に、別々のアミ
ノ基と反応するのに有効な少なくとも２種の化学的官能
基（その一つは該担体の該ポリアミン化合物由来のアミ
ノ基と反応でき、その他方は該処理アダクトの該酵素由
来のアミノ基と反応できる）を有するまたはもつことの
できる任意の化合物である。一般に、該アミン反応性物
質はグルタルアルデヒド、サクシンジアルデヒド、テレ
フタルアルデヒド、ビス−ジアゾベンジジン-2,2'-ジス
ルホン酸、4,4'- ジフルオロ-3,3'-ジニトロジフェニル
スルホン、ジフェニル-4,4'-ジチオシアネート-2,2'-ジ
スルホン酸、3-メトキシジフェニルメタン-4,4'-ジイソ
シアネート、トルエン-2- イソシアネート-4- イソチオ
シアネート、トルエン-2,4- ジイソチオシアネート、ジ
アゾベンジジン、ジアゾベンジジン-3,3'-ジアニシジ
ン、N,N'- ヘキサメチレンビスアイオド−アセタミド、
ヘキサメチレンジイソシアネート、シアヌル酸クロリ
ド、1,5-ジフルオロ-2,4- ジニトロベンゼンおよび２種
以上のこれらアミン反応性物質のブレンドからなる群か
ら選ばれる。好ましくは、該アミン反応性物質は多官能
性アルデヒドからなる群から選ばれる。より好ましく
は、該アミン反応性物質はグルタルアルデヒド、サクシ
ンジアルデヒド、テレフタルアルデヒドからなる群から
選ばれる。最良の結果は、グルタルアルデヒドを使用す
ることによって得られた。
性物質を含む種々の化合物を表すのに使用する「多官能
性」なる用語は、酵素と接触させた場合に、別々のアミ
ノ基と反応するのに有効な少なくとも２種の化学的官能
基（その一つは該担体の該ポリアミン化合物由来のアミ
ノ基と反応でき、その他方は該処理アダクトの該酵素由
来のアミノ基と反応できる）を有するまたはもつことの
できる任意の化合物である。一般に、該アミン反応性物
質はグルタルアルデヒド、サクシンジアルデヒド、テレ
フタルアルデヒド、ビス−ジアゾベンジジン-2,2'-ジス
ルホン酸、4,4'- ジフルオロ-3,3'-ジニトロジフェニル
スルホン、ジフェニル-4,4'-ジチオシアネート-2,2'-ジ
スルホン酸、3-メトキシジフェニルメタン-4,4'-ジイソ
シアネート、トルエン-2- イソシアネート-4- イソチオ
シアネート、トルエン-2,4- ジイソチオシアネート、ジ
アゾベンジジン、ジアゾベンジジン-3,3'-ジアニシジ
ン、N,N'- ヘキサメチレンビスアイオド−アセタミド、
ヘキサメチレンジイソシアネート、シアヌル酸クロリ
ド、1,5-ジフルオロ-2,4- ジニトロベンゼンおよび２種
以上のこれらアミン反応性物質のブレンドからなる群か
ら選ばれる。好ましくは、該アミン反応性物質は多官能
性アルデヒドからなる群から選ばれる。より好ましく
は、該アミン反応性物質はグルタルアルデヒド、サクシ
ンジアルデヒド、テレフタルアルデヒドからなる群から
選ばれる。最良の結果は、グルタルアルデヒドを使用す
ることによって得られた。
【００１９】水溶性のこれらアミン反応性物質は、その
水性溶液から酵素に適用できる。水不溶性のこれらアミ
ン反応性物質は、その有機溶媒、例えばメチルアルコー
ル、エチルアルコール、プロピルアルコールの溶液から
酵素に適用できる。水溶性アミン反応性物質が好まし
い。一般に、該酵素は水性溶液として使用する。好まし
くは、この水性溶液は緩衝された水性溶液である。酵素
の正確な有効濃度および正確な最適濃度の選択、並びに
使用すべき溶液の組成は、該使用する酵素および関連す
る該溶液の組成に依存して変動するであろう。しかしな
がら、これらの濃度は本明細書の記載に照らして、簡単
なルーチンテストの後に、当業者には容易に明らかとな
るであろう。何れにしろ、これら溶液が酵素溶液１ml
（または固体酵素1g）当たり、70〜100mlの水性バッフ
ァーを含むことが好ましいことを述べておく。一般に、
該アミン反応性物質の（水）溶液中の該アミン反応性物
質の濃度は少なくとも約0.05%(wt/vol) であり、少なく
とも約0.1%(wt/vol)であることが好ましい。更に、該ア
ミン反応性物質の（水）溶液中における該アミン反応性
物質の濃度は、一般的に、約0.4%以下であり、約0.2%(w
t/vol)以下であることが好ましい。該処理アダクトは、
該酵素溶液（水性バッファーの添加前）１ml当たり少な
くとも約0.10ｇの該アミン反応性物質を含む。好ましく
は、該処理アダクトは該酵素溶液（水性バッファーの添
加前）１ml当たり少なくとも約0.15ｇの該アミン反応性
物質を含む。最も好ましくは、該酵素溶液（水性バッフ
ァーの添加前）１ml当たり少なくとも約0.2gの該アミン
反応性物質を使用する。該処理アダクトは、該酵素溶液
（水性バッファーの添加前）１ml当たり約1.50ｇ以下の
該アミン反応性物質を含む。好ましくは、該処理アダク
トは、該酵素溶液（水性バッファーの添加前）１ml当た
り約1.0g以下の該アミン反応性物質を含む。最も好まし
くは、該酵素溶液（水性バッファーの添加前）１ml当た
り約0.3g以下の該アミン反応性物質を使用する。
水性溶液から酵素に適用できる。水不溶性のこれらアミ
ン反応性物質は、その有機溶媒、例えばメチルアルコー
ル、エチルアルコール、プロピルアルコールの溶液から
酵素に適用できる。水溶性アミン反応性物質が好まし
い。一般に、該酵素は水性溶液として使用する。好まし
くは、この水性溶液は緩衝された水性溶液である。酵素
の正確な有効濃度および正確な最適濃度の選択、並びに
使用すべき溶液の組成は、該使用する酵素および関連す
る該溶液の組成に依存して変動するであろう。しかしな
がら、これらの濃度は本明細書の記載に照らして、簡単
なルーチンテストの後に、当業者には容易に明らかとな
るであろう。何れにしろ、これら溶液が酵素溶液１ml
（または固体酵素1g）当たり、70〜100mlの水性バッフ
ァーを含むことが好ましいことを述べておく。一般に、
該アミン反応性物質の（水）溶液中の該アミン反応性物
質の濃度は少なくとも約0.05%(wt/vol) であり、少なく
とも約0.1%(wt/vol)であることが好ましい。更に、該ア
ミン反応性物質の（水）溶液中における該アミン反応性
物質の濃度は、一般的に、約0.4%以下であり、約0.2%(w
t/vol)以下であることが好ましい。該処理アダクトは、
該酵素溶液（水性バッファーの添加前）１ml当たり少な
くとも約0.10ｇの該アミン反応性物質を含む。好ましく
は、該処理アダクトは該酵素溶液（水性バッファーの添
加前）１ml当たり少なくとも約0.15ｇの該アミン反応性
物質を含む。最も好ましくは、該酵素溶液（水性バッフ
ァーの添加前）１ml当たり少なくとも約0.2gの該アミン
反応性物質を使用する。該処理アダクトは、該酵素溶液
（水性バッファーの添加前）１ml当たり約1.50ｇ以下の
該アミン反応性物質を含む。好ましくは、該処理アダク
トは、該酵素溶液（水性バッファーの添加前）１ml当た
り約1.0g以下の該アミン反応性物質を含む。最も好まし
くは、該酵素溶液（水性バッファーの添加前）１ml当た
り約0.3g以下の該アミン反応性物質を使用する。
【００２０】しかしながら、該アミン反応性物質と該酵
素との間の比は関連する該酵素の活性に依存することを
ここに述べておく。例えば、該アミン反応性物質がグル
タルアルデヒドであり、かつ該酵素がグルコアミラーゼ
(200 DU/mlを含む）である場合、グルコアミラーゼ１ml
当たりグルタルアルデヒド少なくとも約0.15ｇであり、
グルコアミラーゼ１ml当たりグルタルアルデヒド少なく
とも約0.2gであることが最も好ましく、グルコアミラー
ゼ１ml当たりグルタルアルデヒド約1.00ｇ以下の使用が
好ましく、またグルコアミラーゼ１ml当たりグルタルア
ルデヒド0.3g以下の使用が最も好ましい。１ジアジム単
位(DU)とは、基質として可溶性澱粉を使用して、pH 4.
2、60℃におけるアッセイ条件下で、１時間以内にグル
コース1gの生産を触媒する活性を意味する。もう一つの
例として、該アミン反応性物質がグルタルアルデヒドで
あり、かつ該酵素が真菌α−アミラーゼ(4000 SKBU/ml
を含む）である場合、該α−アミラーゼ１ml当たりグル
タルアルデヒド少なくとも約0.15ｇであることが好まし
く、α−アミラーゼ１ml当たり該グルタルアルデヒド少
なくとも約0.2gであることが最も好ましく、該α−アミ
ラーゼ１ml当たりグルタルアルデヒド約1.00ｇ以下の使
用が好ましく、また該α−アミラーゼ１ml当たりグルタ
ルアルデヒド0.3g以下の使用が最も好ましい。α−アミ
ラーゼ１単位(SKBU)とは、該アッセイ条件下で１時間当
たり限界−デキストリン基質1.0gをデキストリンに転化
する活性を意味する。同様に、最後の例として、該アミ
ン反応性物質がグルタルアルデヒドであり、かつ該酵素
がβ−アミラーゼ(1ml当たりジアスターゼ活性1500単位
を含む）である場合、該β−アミラーゼ１ml当たりグル
タルアルデヒド少なくとも約0.15ｇであることが好まし
く、β−アミラーゼ１ml当たり該グルタルアルデヒド少
なくとも約0.2gであることが最も好ましく、該β−アミ
ラーゼ１ml当たりグルタルアルデヒド約1.00ｇ以下の使
用が好ましく、また該β−アミラーゼ１ml当たりグルタ
ルアルデヒド0.3g以下の使用が最も好ましい。
素との間の比は関連する該酵素の活性に依存することを
ここに述べておく。例えば、該アミン反応性物質がグル
タルアルデヒドであり、かつ該酵素がグルコアミラーゼ
(200 DU/mlを含む）である場合、グルコアミラーゼ１ml
当たりグルタルアルデヒド少なくとも約0.15ｇであり、
グルコアミラーゼ１ml当たりグルタルアルデヒド少なく
とも約0.2gであることが最も好ましく、グルコアミラー
ゼ１ml当たりグルタルアルデヒド約1.00ｇ以下の使用が
好ましく、またグルコアミラーゼ１ml当たりグルタルア
ルデヒド0.3g以下の使用が最も好ましい。１ジアジム単
位(DU)とは、基質として可溶性澱粉を使用して、pH 4.
2、60℃におけるアッセイ条件下で、１時間以内にグル
コース1gの生産を触媒する活性を意味する。もう一つの
例として、該アミン反応性物質がグルタルアルデヒドで
あり、かつ該酵素が真菌α−アミラーゼ(4000 SKBU/ml
を含む）である場合、該α−アミラーゼ１ml当たりグル
タルアルデヒド少なくとも約0.15ｇであることが好まし
く、α−アミラーゼ１ml当たり該グルタルアルデヒド少
なくとも約0.2gであることが最も好ましく、該α−アミ
ラーゼ１ml当たりグルタルアルデヒド約1.00ｇ以下の使
用が好ましく、また該α−アミラーゼ１ml当たりグルタ
ルアルデヒド0.3g以下の使用が最も好ましい。α−アミ
ラーゼ１単位(SKBU)とは、該アッセイ条件下で１時間当
たり限界−デキストリン基質1.0gをデキストリンに転化
する活性を意味する。同様に、最後の例として、該アミ
ン反応性物質がグルタルアルデヒドであり、かつ該酵素
がβ−アミラーゼ(1ml当たりジアスターゼ活性1500単位
を含む）である場合、該β−アミラーゼ１ml当たりグル
タルアルデヒド少なくとも約0.15ｇであることが好まし
く、β−アミラーゼ１ml当たり該グルタルアルデヒド少
なくとも約0.2gであることが最も好ましく、該β−アミ
ラーゼ１ml当たりグルタルアルデヒド約1.00ｇ以下の使
用が好ましく、また該β−アミラーゼ１ml当たりグルタ
ルアルデヒド0.3g以下の使用が最も好ましい。
【００２１】該ジアスターゼ活性はフードケミカルコー
デックス(Food Chemical Codex), Vol. III (1981), p.
484に開示された方法によって測定し、デグリーオブジ
アスタティックパワー(Degee of Diastatic Power: D
P0）として表示する。一般には、少なくとも約10℃、好
ましくは少なくとも約18℃、最も好ましくは少なくとも
約20℃の温度にて、該酵素を該アミン反応性物質と接触
（並びに該物質と反応）させる。一般には、上限として
約30℃以下であり、好ましくは約28℃以下であり、最も
好ましくは約25℃以下である。少なくとも約２時間、好
ましくは少なくとも約３時間、より好ましくは少なくと
も約４時間の接触時間で、該酵素を該アミン反応性物質
と接触（並びに該物質と反応）させる。約24時間以下、
好ましくは約６時間以下、より好ましくは約４時間以下
の接触時間で、該酵素を該アミン反応性物質と接触（並
びに該物質と反応）させる。該酵素と該アミン反応性物
質との接触（並びに該物質との反応）は、該酵素の活性
がその大幅な喪失なしに許容されるpH範囲によって支配
されるpHにて実施する。該酵素がグルコアミラーゼであ
る場合、該酵素と該アミン反応性物質との接触（並びに
該物質との反応）は、少なくとも約3.5 、好ましくは少
なくとも約4.5であって、かつ約6.0 以下、好ましくは
約5.0 以下のpHにて実施する。該酵素が真菌α−アミラ
ーゼである場合、該酵素と該アミン反応性物質との接触
（並びに該物質との反応）は、少なくとも約4.5 、好ま
しくは少なくとも約5.0 であって、かつ約7.0 以下、好
ましくは約5.5 以下のpHにて実施する。該酵素がβ−ア
ミラーゼである場合には、該酵素と該アミン反応性物質
との接触（並びに該物質との反応）は、少なくとも約4.
5 、好ましくは少なくとも約5.0 であって、かつ約7.0
以下、好ましくは約5.5 以下のpHにて実施する。
デックス(Food Chemical Codex), Vol. III (1981), p.
484に開示された方法によって測定し、デグリーオブジ
アスタティックパワー(Degee of Diastatic Power: D
P0）として表示する。一般には、少なくとも約10℃、好
ましくは少なくとも約18℃、最も好ましくは少なくとも
約20℃の温度にて、該酵素を該アミン反応性物質と接触
（並びに該物質と反応）させる。一般には、上限として
約30℃以下であり、好ましくは約28℃以下であり、最も
好ましくは約25℃以下である。少なくとも約２時間、好
ましくは少なくとも約３時間、より好ましくは少なくと
も約４時間の接触時間で、該酵素を該アミン反応性物質
と接触（並びに該物質と反応）させる。約24時間以下、
好ましくは約６時間以下、より好ましくは約４時間以下
の接触時間で、該酵素を該アミン反応性物質と接触（並
びに該物質と反応）させる。該酵素と該アミン反応性物
質との接触（並びに該物質との反応）は、該酵素の活性
がその大幅な喪失なしに許容されるpH範囲によって支配
されるpHにて実施する。該酵素がグルコアミラーゼであ
る場合、該酵素と該アミン反応性物質との接触（並びに
該物質との反応）は、少なくとも約3.5 、好ましくは少
なくとも約4.5であって、かつ約6.0 以下、好ましくは
約5.0 以下のpHにて実施する。該酵素が真菌α−アミラ
ーゼである場合、該酵素と該アミン反応性物質との接触
（並びに該物質との反応）は、少なくとも約4.5 、好ま
しくは少なくとも約5.0 であって、かつ約7.0 以下、好
ましくは約5.5 以下のpHにて実施する。該酵素がβ−ア
ミラーゼである場合には、該酵素と該アミン反応性物質
との接触（並びに該物質との反応）は、少なくとも約4.
5 、好ましくは少なくとも約5.0 であって、かつ約7.0
以下、好ましくは約5.5 以下のpHにて実施する。
【００２２】特に好ましい態様においては、該処理酵素
−含有アダクトを調製するために、攪拌下で、該酵素と
該アミン反応性物質とを接触（並びに該物質と反応）さ
せる。該酵素と該アミン反応性物質との接触（並びに該
物質との反応）を混合条件下で実施して、該溶液全体を
通して均一な混合物を形成する。好ましくは、発泡が生
じないように、穏やかに攪拌することで十分である。該
担体と該処理酵素−含有アダクトとの接触は、該担体と
該処理アダクトとが相互に反応して、該固定化酵素複合
体を生成するような様式かつ条件下で実施する。一般
に、本発明の固定化酵素複合体は、該担体1g当たり、該
処理酵素−含有アダクトを少なくとも約0.05ml、好まし
くは該担体1g当たり、該処理酵素−含有アダクトを少な
くとも約0.07mlの量で含む。本発明の固定化酵素複合体
は、更に該担体1g当たり、該処理酵素−含有アダクトを
約0.6 ml以下の量、好ましくは該担体1g当たり、該処理
酵素−含有アダクトを約0.5 ml以下の量で含む。処理グ
ルコアミラーゼおよびグルタルアルデヒドを使用して生
成した処理アダクトを、ポリエチレンイミンと粒状珪藻
土とを使用して生成した担体と接触させる場合、これら
の間の好ましい比は該担体1g当たり、該処理アダクト約
0.11ml〜約0.13mlである。処理真菌α−アミラーゼおよ
びグルタルアルデヒドを使用して生成した処理アダクト
を、ポリエチレンイミンと粒状珪藻土とを使用して生成
した担体と接触させる場合、これらの間の好ましい比は
該担体1g当たり、該処理アダクト約0.14ml〜約0.16mlで
ある。処理βアミラーゼおよびグルタルアルデヒドを使
用して生成した処理アダクトを、ポリエチレンイミンと
粒状珪藻土とを使用して生成した担体と接触させる場
合、これらの間の好ましい比率は該担体1g当たり、該処
理アダクト約0.15ml〜約0.17mlである。
−含有アダクトを調製するために、攪拌下で、該酵素と
該アミン反応性物質とを接触（並びに該物質と反応）さ
せる。該酵素と該アミン反応性物質との接触（並びに該
物質との反応）を混合条件下で実施して、該溶液全体を
通して均一な混合物を形成する。好ましくは、発泡が生
じないように、穏やかに攪拌することで十分である。該
担体と該処理酵素−含有アダクトとの接触は、該担体と
該処理アダクトとが相互に反応して、該固定化酵素複合
体を生成するような様式かつ条件下で実施する。一般
に、本発明の固定化酵素複合体は、該担体1g当たり、該
処理酵素−含有アダクトを少なくとも約0.05ml、好まし
くは該担体1g当たり、該処理酵素−含有アダクトを少な
くとも約0.07mlの量で含む。本発明の固定化酵素複合体
は、更に該担体1g当たり、該処理酵素−含有アダクトを
約0.6 ml以下の量、好ましくは該担体1g当たり、該処理
酵素−含有アダクトを約0.5 ml以下の量で含む。処理グ
ルコアミラーゼおよびグルタルアルデヒドを使用して生
成した処理アダクトを、ポリエチレンイミンと粒状珪藻
土とを使用して生成した担体と接触させる場合、これら
の間の好ましい比は該担体1g当たり、該処理アダクト約
0.11ml〜約0.13mlである。処理真菌α−アミラーゼおよ
びグルタルアルデヒドを使用して生成した処理アダクト
を、ポリエチレンイミンと粒状珪藻土とを使用して生成
した担体と接触させる場合、これらの間の好ましい比は
該担体1g当たり、該処理アダクト約0.14ml〜約0.16mlで
ある。処理βアミラーゼおよびグルタルアルデヒドを使
用して生成した処理アダクトを、ポリエチレンイミンと
粒状珪藻土とを使用して生成した担体と接触させる場
合、これらの間の好ましい比率は該担体1g当たり、該処
理アダクト約0.15ml〜約0.17mlである。
【００２３】該担体と該処理酵素−含有アダクトとは、
攪拌しつつ、あるいは循環により接触させる。この場
合、穏やかな攪拌で十分である。該担体と該処理酵素−
含有アダクトとは、少なくとも約５℃、好ましくは少な
くとも約15℃、特に好ましくは少なくとも約20℃の温度
にて接触させる。該担体と該処理酵素−含有アダクトと
は、約30℃以下、好ましくは約28℃以下、特に好ましく
は約25℃以下の温度にて接触させる。該担体と該処理酵
素−含有アダクトとは、少なくとも約２時間、好ましく
は少なくとも約４時間の間接触させる。該担体と該処理
酵素−含有アダクトとは、約24時間以下、好ましくは約
６時間以下、特に好ましくは約４時間以下の時間接触さ
せる。該担体と該処理酵素−含有アダクトとの接触は、
少なくとも約4.0 、好ましくは少なくとも約4.5 のpHに
て実施する。該担体と該処理酵素−含有アダクトとの接
触は、約7.0 以下、好ましくは約6.0 以下のpHにて実施
する。更に、かくして得た固定化酵素複合体を適当な溶
液で洗浄して、遊離のアダクトおよび遊離の担体を除去
することが特に好ましい。好ましくは、該溶液は水であ
る。この洗浄段階は、上記の担体と処理酵素−含有アダ
クトとを接触させる工程と同一の条件下で実施すること
が好ましい。
攪拌しつつ、あるいは循環により接触させる。この場
合、穏やかな攪拌で十分である。該担体と該処理酵素−
含有アダクトとは、少なくとも約５℃、好ましくは少な
くとも約15℃、特に好ましくは少なくとも約20℃の温度
にて接触させる。該担体と該処理酵素−含有アダクトと
は、約30℃以下、好ましくは約28℃以下、特に好ましく
は約25℃以下の温度にて接触させる。該担体と該処理酵
素−含有アダクトとは、少なくとも約２時間、好ましく
は少なくとも約４時間の間接触させる。該担体と該処理
酵素−含有アダクトとは、約24時間以下、好ましくは約
６時間以下、特に好ましくは約４時間以下の時間接触さ
せる。該担体と該処理酵素−含有アダクトとの接触は、
少なくとも約4.0 、好ましくは少なくとも約4.5 のpHに
て実施する。該担体と該処理酵素−含有アダクトとの接
触は、約7.0 以下、好ましくは約6.0 以下のpHにて実施
する。更に、かくして得た固定化酵素複合体を適当な溶
液で洗浄して、遊離のアダクトおよび遊離の担体を除去
することが特に好ましい。好ましくは、該溶液は水であ
る。この洗浄段階は、上記の担体と処理酵素−含有アダ
クトとを接触させる工程と同一の条件下で実施すること
が好ましい。
【００２４】この固定化酵素複合体は、数カ月に渡り、
大幅な酵素活性の損失なしに、冷蔵条件下で保存でき
る。該複合体を保存する前に、0.3%(wt/vol)の安息香酸
ナトリウム、0.15%(wt/vol) のカリウムソルベートおよ
び5%(wt/vol)のコーンシロップ固形分を含む組成物の、
pH 4.2の0.02M アセテートバッファー溶液を、該固定化
酵素複合体に添加することが好ましい。本発明の予想外
の観測の一つは、上記方法によって得られた該固定化酵
素複合体が米国レターパテントNo. 4,713,333 に従って
得られた固定化酵素複合体よりも実質的に高い安定性
（該複合体の使用中における、その反応媒体中への喪失
を表す酵素活性の百分率の測定により決定された）を示
すことである。更に、該複合体は、米国レターパテント
No. 4,713,333 に従って得られた固定化酵素複合体より
も良好な熱安定性を示す。最後に、同一の使用条件下
で、本発明により調製された固定化酵素複合体の半減期
は、米国レターパテントNo. 4,713,333 に従って得られ
た固定化酵素複合体の半減期よりも長い。このことは該
酵素の生産性が大幅に改善されたことを示す。本発明の
もう一つの望ましい局面は、ここに開示する固定化酵素
複合体が容易に回収でき、かつ再利用のために、塩基−
酸洗浄を包含する簡単な方法を利用する再生後の固定化
により再調製できることである。典型的には、この使用
済みの固定化酵素複合体を水、0.5 N NaOH、水、0.5N H
Clおよび次いで水に分散してスラリーとする。本発明の
この局面は重要である。というのは、これに関連する投
棄の問題が排除され、該酵素の生産性を高めることによ
る大幅な経費節減がもたらされるからである。
大幅な酵素活性の損失なしに、冷蔵条件下で保存でき
る。該複合体を保存する前に、0.3%(wt/vol)の安息香酸
ナトリウム、0.15%(wt/vol) のカリウムソルベートおよ
び5%(wt/vol)のコーンシロップ固形分を含む組成物の、
pH 4.2の0.02M アセテートバッファー溶液を、該固定化
酵素複合体に添加することが好ましい。本発明の予想外
の観測の一つは、上記方法によって得られた該固定化酵
素複合体が米国レターパテントNo. 4,713,333 に従って
得られた固定化酵素複合体よりも実質的に高い安定性
（該複合体の使用中における、その反応媒体中への喪失
を表す酵素活性の百分率の測定により決定された）を示
すことである。更に、該複合体は、米国レターパテント
No. 4,713,333 に従って得られた固定化酵素複合体より
も良好な熱安定性を示す。最後に、同一の使用条件下
で、本発明により調製された固定化酵素複合体の半減期
は、米国レターパテントNo. 4,713,333 に従って得られ
た固定化酵素複合体の半減期よりも長い。このことは該
酵素の生産性が大幅に改善されたことを示す。本発明の
もう一つの望ましい局面は、ここに開示する固定化酵素
複合体が容易に回収でき、かつ再利用のために、塩基−
酸洗浄を包含する簡単な方法を利用する再生後の固定化
により再調製できることである。典型的には、この使用
済みの固定化酵素複合体を水、0.5 N NaOH、水、0.5N H
Clおよび次いで水に分散してスラリーとする。本発明の
この局面は重要である。というのは、これに関連する投
棄の問題が排除され、該酵素の生産性を高めることによ
る大幅な経費節減がもたらされるからである。
【００２５】
【実施例】本発明を、以下の実施例によって更に詳細に
説明する。これら実施例は好ましい態様を例示するため
に与えられるものであって、本発明を何等限定するもの
ではない。実施例１ ：固定化グルコアミラーゼ複合体の調製 16〜40メッシュ（米国メッシュ単位）の多孔質粒状珪藻
土（米国レターパテントNo. 4,713,333 に記載されたも
の、この特許を本発明の参考文献とする）700mlを、径
５cm、高さ100 cmのガラスカラム反応器に移した。12メ
ッシュの砂利（アクアリウム用の砂利）の４cmの床を該
カラムのせき板上に配置して、該工程中の該溶液の上昇
の際の、該液体の分配を助けた。約20% の粒状珪藻土を
展開させ、もしくは流動化するような速度で、水をポン
プで上昇させて該粒状珪藻土の微細な部分を除去した。
一般に、１時間以内に流出水は微細な珪藻土粒子を含ま
なくなった。該粒状珪藻土床の頂部までの水を排除し
た。次いで、ポリエチレンイミン(PEI-600; 分子量40,0
00-60,000; 9.8のpHを有する）の0.1%(wt/vol)水性溶液
3500mlを、ポンプで上昇流として供給し、該床に２時間
に渡り該流出液を循環した。該カラムから、該粒状珪藻
土の床の頂部までの該ポリエチレンイミンの水性溶液を
排除した。次いで、該粒状珪藻土を水の上昇流で洗浄し
て、室温における遊離ポリエチレンイミンを除去した。
このようにして、粒状珪藻土−ポリエチレンイミン担体
を得た。
説明する。これら実施例は好ましい態様を例示するため
に与えられるものであって、本発明を何等限定するもの
ではない。実施例１ ：固定化グルコアミラーゼ複合体の調製 16〜40メッシュ（米国メッシュ単位）の多孔質粒状珪藻
土（米国レターパテントNo. 4,713,333 に記載されたも
の、この特許を本発明の参考文献とする）700mlを、径
５cm、高さ100 cmのガラスカラム反応器に移した。12メ
ッシュの砂利（アクアリウム用の砂利）の４cmの床を該
カラムのせき板上に配置して、該工程中の該溶液の上昇
の際の、該液体の分配を助けた。約20% の粒状珪藻土を
展開させ、もしくは流動化するような速度で、水をポン
プで上昇させて該粒状珪藻土の微細な部分を除去した。
一般に、１時間以内に流出水は微細な珪藻土粒子を含ま
なくなった。該粒状珪藻土床の頂部までの水を排除し
た。次いで、ポリエチレンイミン(PEI-600; 分子量40,0
00-60,000; 9.8のpHを有する）の0.1%(wt/vol)水性溶液
3500mlを、ポンプで上昇流として供給し、該床に２時間
に渡り該流出液を循環した。該カラムから、該粒状珪藻
土の床の頂部までの該ポリエチレンイミンの水性溶液を
排除した。次いで、該粒状珪藻土を水の上昇流で洗浄し
て、室温における遊離ポリエチレンイミンを除去した。
このようにして、粒状珪藻土−ポリエチレンイミン担体
を得た。
【００２６】商標名ジアジム(DIAZYME) L-200(ソルベー
エンザイムズ社(SOLVAY ENZYMES Inc.)(インジアナ州、
エルカート）製）の下で市販されているグルコアミラー
ゼ35mlをpH 5.0の0.02 Mアセテートバッファー3500mlに
添加した。このグルコアミラーゼジアジムL-200 はグル
コアミラーゼ活性200 DU/ml を含んでいた。次いで、1
7.5ｇの50%(wt/vol) グルタルアルデヒド（水性溶液）
を、穏やかに攪拌しつつ、該グルコアミラーゼの水性溶
液に添加し、該グルタルアルデヒドと該グルコアミラー
ゼの水性溶液とを20-25 ℃にて４時間、穏やかに攪拌し
つつ反応させた。その結果、処理グルコアミラーゼを含
有する処理グルコアミラーゼ−グルタルアルデヒドアダ
クトが生成した。次に、この処理グルコアミラーゼ−グ
ルタルアルデヒドアダクトを、上で調製した該粒状珪藻
土−ポリエチレンイミン担体を通して循環させた。この
循環状態を、穏やかに攪拌しつつ、約20-25 ℃にて４時
間維持し、次いで過剰の処理アダクトを該担体から水で
洗い流した。結果として、安定かつ高活性の固定化グル
コアミラーゼ複合体が生成した。この洗浄した複合体
を、次に該カラムから取り出し、後の使用のために、0.
3%(wt/vol)の安息香酸ナトリウム、0.15%(wt/vol) のカ
リウムソルベートおよび5%(wt/vol)のコーンシロップ固
形分を含む、pH 4.2の0.02M アセテートバッファー中で
保存した。
エンザイムズ社(SOLVAY ENZYMES Inc.)(インジアナ州、
エルカート）製）の下で市販されているグルコアミラー
ゼ35mlをpH 5.0の0.02 Mアセテートバッファー3500mlに
添加した。このグルコアミラーゼジアジムL-200 はグル
コアミラーゼ活性200 DU/ml を含んでいた。次いで、1
7.5ｇの50%(wt/vol) グルタルアルデヒド（水性溶液）
を、穏やかに攪拌しつつ、該グルコアミラーゼの水性溶
液に添加し、該グルタルアルデヒドと該グルコアミラー
ゼの水性溶液とを20-25 ℃にて４時間、穏やかに攪拌し
つつ反応させた。その結果、処理グルコアミラーゼを含
有する処理グルコアミラーゼ−グルタルアルデヒドアダ
クトが生成した。次に、この処理グルコアミラーゼ−グ
ルタルアルデヒドアダクトを、上で調製した該粒状珪藻
土−ポリエチレンイミン担体を通して循環させた。この
循環状態を、穏やかに攪拌しつつ、約20-25 ℃にて４時
間維持し、次いで過剰の処理アダクトを該担体から水で
洗い流した。結果として、安定かつ高活性の固定化グル
コアミラーゼ複合体が生成した。この洗浄した複合体
を、次に該カラムから取り出し、後の使用のために、0.
3%(wt/vol)の安息香酸ナトリウム、0.15%(wt/vol) のカ
リウムソルベートおよび5%(wt/vol)のコーンシロップ固
形分を含む、pH 4.2の0.02M アセテートバッファー中で
保存した。
【００２７】上記の如くして調製した該固定化グルコア
ミラーゼ複合体を、次に冷蔵条件下で保存したところ、
数カ月の期間に渡り活性の大幅な喪失を示さなかった。
この固定化酵素複合体をpH 4.2の0.02M アセテートバッ
ファー中に分散した30%(w/v)コーンスターチ50mlを基質
として使用して、55℃の温度にてアッセイした。このア
ッセイを実施するために、該基質および酵素を250 mlの
フラスコに入れ、55℃のシェーカー水浴中でインキュベ
ートした。反応時間15および75分において、反応混合物
のアリコート0.2 mlを取り出し、0.2NのH2SO4 溶液0.5
ml中に添加して該反応を停止させた。次いで、これらサ
ンプルを5.3 mlの蒸留水の添加により希釈し、次いで0.
45μのフィルタで濾過した。この生成物を、炭水化物高
圧液体クロマトグラフィー(HPLC)により分析した。活性
１単位は、該アッセイの条件下で１分間にグルコース１
μM を生成するであろう酵素の量を表し、U/g(複合体1g
当たりの活性単位）で報告した。この調製物の酵素活性
は、乾燥重量基準で881U/gであることが分かった。全活
性の84.6% が固定化酵素によるものであり、かつその1
5.4% が固定化されていない酵素によるものであること
を見出した。該固定化酵素の密度は0.43 g/ml であっ
た。
ミラーゼ複合体を、次に冷蔵条件下で保存したところ、
数カ月の期間に渡り活性の大幅な喪失を示さなかった。
この固定化酵素複合体をpH 4.2の0.02M アセテートバッ
ファー中に分散した30%(w/v)コーンスターチ50mlを基質
として使用して、55℃の温度にてアッセイした。このア
ッセイを実施するために、該基質および酵素を250 mlの
フラスコに入れ、55℃のシェーカー水浴中でインキュベ
ートした。反応時間15および75分において、反応混合物
のアリコート0.2 mlを取り出し、0.2NのH2SO4 溶液0.5
ml中に添加して該反応を停止させた。次いで、これらサ
ンプルを5.3 mlの蒸留水の添加により希釈し、次いで0.
45μのフィルタで濾過した。この生成物を、炭水化物高
圧液体クロマトグラフィー(HPLC)により分析した。活性
１単位は、該アッセイの条件下で１分間にグルコース１
μM を生成するであろう酵素の量を表し、U/g(複合体1g
当たりの活性単位）で報告した。この調製物の酵素活性
は、乾燥重量基準で881U/gであることが分かった。全活
性の84.6% が固定化酵素によるものであり、かつその1
5.4% が固定化されていない酵素によるものであること
を見出した。該固定化酵素の密度は0.43 g/ml であっ
た。
【００２８】実施例２：抽出媒体中での固定化グルコア
ミラーゼ複合体の安定性 本例では、該複合体の安定性（どの程度良好に、該酵素
が該複合体中に堅固に維持されているか）を立証する。
この方法の原理は、該固定化酵素複合体を抽出媒体中で
インキュベートすることである。このようなインキュベ
ートの後、該複合体を取り出し、該抽出媒体をアッセイ
して、該複合体から解離（結合解除）することにより、
該媒体中に失われた該酵素の量を測定した（該媒体の酵
素活性を測定することにより決定した）。実施例１に従
って調製した固定化酵素複合体のサンプル５mlを、15ml
の円錐型プラスチックチューブに入れ、数回水で洗浄し
た。次いで、該液体をデカンテーションし、次いで5%(w
/v) のNaClを含むpH 5.0の0.02 Nアセテートバッファー
５mlを添加した。数分間混合した後、該チューブを30℃
の水浴中で18時間インキュベートした。このインキュベ
ーションの後、該酵素のスラリーをファットマン(WHATM
AN)No. 1濾紙を通して重力濾過した。次いで、0.1 mlの
濾液を1.0 mlの基質溶液(pH5.0の0.02 Nアセテートバッ
ファー中に溶解した20%(w/v)コーンスターチ溶液）に添
加し、60℃の水浴中に60分間入れた。60分後に、該チュ
ーブを沸騰水浴に10分間置くことにより、該反応を停止
させた。次いで、このサンプル（サンプルＡという）
を、0.01 NのH2SO4 溶液の移動相で10倍に希釈し、炭水
化物プロフィールをHPLCで解析した。比較のため、固定
化グルコアミラーゼ複合体のサンプル（サンプルＢとい
う）を、米国レターパテントNo. 4,713,333 の実施例１
に従って調製し、上の章で記載した方法と同様な方法で
テストした。サンプルＡおよびＢのアッセイの結果を以
下の表１に与えた。
ミラーゼ複合体の安定性 本例では、該複合体の安定性（どの程度良好に、該酵素
が該複合体中に堅固に維持されているか）を立証する。
この方法の原理は、該固定化酵素複合体を抽出媒体中で
インキュベートすることである。このようなインキュベ
ートの後、該複合体を取り出し、該抽出媒体をアッセイ
して、該複合体から解離（結合解除）することにより、
該媒体中に失われた該酵素の量を測定した（該媒体の酵
素活性を測定することにより決定した）。実施例１に従
って調製した固定化酵素複合体のサンプル５mlを、15ml
の円錐型プラスチックチューブに入れ、数回水で洗浄し
た。次いで、該液体をデカンテーションし、次いで5%(w
/v) のNaClを含むpH 5.0の0.02 Nアセテートバッファー
５mlを添加した。数分間混合した後、該チューブを30℃
の水浴中で18時間インキュベートした。このインキュベ
ーションの後、該酵素のスラリーをファットマン(WHATM
AN)No. 1濾紙を通して重力濾過した。次いで、0.1 mlの
濾液を1.0 mlの基質溶液(pH5.0の0.02 Nアセテートバッ
ファー中に溶解した20%(w/v)コーンスターチ溶液）に添
加し、60℃の水浴中に60分間入れた。60分後に、該チュ
ーブを沸騰水浴に10分間置くことにより、該反応を停止
させた。次いで、このサンプル（サンプルＡという）
を、0.01 NのH2SO4 溶液の移動相で10倍に希釈し、炭水
化物プロフィールをHPLCで解析した。比較のため、固定
化グルコアミラーゼ複合体のサンプル（サンプルＢとい
う）を、米国レターパテントNo. 4,713,333 の実施例１
に従って調製し、上の章で記載した方法と同様な方法で
テストした。サンプルＡおよびＢのアッセイの結果を以
下の表１に与えた。
【００２９】
【表１】 サンプル 初期活性(U/ml) 後抽出活性(U/ml) 活性喪失量(%) Ａ 379 369 2.6 Ｂ 332 293 12.0
【００３０】明らかにこの結果は、本発明の方法に従っ
て調製した該固定化グルコアミラーゼ複合体の該処理グ
ルコアミラーゼが、該複合体のマトリックス中におい
て、米国レターパテントNo. 4,713,333 に従って調製し
た固定化グルコアミラーゼ複合体の処理グルコアミラー
ゼよりも、一層安定性が高い（堅固に維持されている）
ことを示しており、かくして本発明の複合体に見られた
如く、該複合体から該反応媒体への該酵素の喪失量が低
減されることが分かる。実施例３ ：ガラスカラム中での固定化グルコアミラーゼ
複合体の安定性 実施例１に記載のように調製した固定化グルコアミラー
ゼ複合体50mlを、径1.5 cmおよび高さ50cmのジャケット
付きガラスカラムに入れた。このカラムを循環水浴によ
って温度55℃に保った。次いで、pH 5.0の0.02 Nアセテ
ートバッファー中に10%(w/v)の乾燥固体(DS) 43 DEシロ
ップおよび5%(w/v)のNaClを溶解した溶液からなる抽出
媒体を、55℃にて、50 ml/時の流量にて24時間該カラム
に通じた。該抽出の終了時点において、かくして得た該
固定化グルコアミラーゼ複合体のサンプル（サンプルＣ
という）をアッセイしてその安定性を評価した。比較の
ために、米国レターパテントNo. 4,713,333 の実施例１
に従って調製した固定化グルコアミラーゼ複合体のサン
プル（サンプルＤという）を上の章に記載したものと同
様の方法でテストした。サンプルＣおよびＤち関するア
ッセイの結果を以下の表２に与える。
て調製した該固定化グルコアミラーゼ複合体の該処理グ
ルコアミラーゼが、該複合体のマトリックス中におい
て、米国レターパテントNo. 4,713,333 に従って調製し
た固定化グルコアミラーゼ複合体の処理グルコアミラー
ゼよりも、一層安定性が高い（堅固に維持されている）
ことを示しており、かくして本発明の複合体に見られた
如く、該複合体から該反応媒体への該酵素の喪失量が低
減されることが分かる。実施例３ ：ガラスカラム中での固定化グルコアミラーゼ
複合体の安定性 実施例１に記載のように調製した固定化グルコアミラー
ゼ複合体50mlを、径1.5 cmおよび高さ50cmのジャケット
付きガラスカラムに入れた。このカラムを循環水浴によ
って温度55℃に保った。次いで、pH 5.0の0.02 Nアセテ
ートバッファー中に10%(w/v)の乾燥固体(DS) 43 DEシロ
ップおよび5%(w/v)のNaClを溶解した溶液からなる抽出
媒体を、55℃にて、50 ml/時の流量にて24時間該カラム
に通じた。該抽出の終了時点において、かくして得た該
固定化グルコアミラーゼ複合体のサンプル（サンプルＣ
という）をアッセイしてその安定性を評価した。比較の
ために、米国レターパテントNo. 4,713,333 の実施例１
に従って調製した固定化グルコアミラーゼ複合体のサン
プル（サンプルＤという）を上の章に記載したものと同
様の方法でテストした。サンプルＣおよびＤち関するア
ッセイの結果を以下の表２に与える。
【００３１】
【表２】 サンプル 初期活性(U/ml) 後抽出活性(U/ml) 活性喪失量(%) Ｃ 881 653 26 Ｄ 771 396 49
【００３２】明らかにこの結果は、本発明の方法に従っ
て調製した該固定化グルコアミラーゼ複合体の該処理グ
ルコアミラーゼが、該複合体のマトリックス中におい
て、米国レターパテントNo. 4,713,333 に従って調製し
た固定化グルコアミラーゼ複合体の処理グルコアミラー
ゼよりも、一層安定性が高い（堅固に維持されている）
ことを示しており、かくして本発明の複合体に見られた
如く、該複合体から該反応媒体への該酵素の喪失量が低
減されることが分かる。実施例４ ：固定化α−アミラーゼ複合体の調製 商標名クララーゼ(CLARASE) L-40,000（ソルベーエンザ
イムズ社(SOLVAY ENZYMES Inc.)(インジアナ州、エルカ
ート）製）の下で市販されている真菌α−アミラーゼ44
mlを準備し、実施例１に記載の固定化手順に従って、固
定化α−アミラーゼ複合体のサンプル（サンプルＥとい
う）を形成した。この商標名クララーゼ(CLARASE) L-4
0,000の下で市販されている真菌α−アミラーゼは酵素
活性40,000 SKBU/ｇを有する。１(SKBU)α−アミラーゼ
活性単位は、該アッセイ条件下で、１時間当たり1.0gの
限界−デキストリン基質をデキストリンに転化するであ
ろう活性を表す。この固定化酵素複合体の活性は638 U/
g であることが分かった。
て調製した該固定化グルコアミラーゼ複合体の該処理グ
ルコアミラーゼが、該複合体のマトリックス中におい
て、米国レターパテントNo. 4,713,333 に従って調製し
た固定化グルコアミラーゼ複合体の処理グルコアミラー
ゼよりも、一層安定性が高い（堅固に維持されている）
ことを示しており、かくして本発明の複合体に見られた
如く、該複合体から該反応媒体への該酵素の喪失量が低
減されることが分かる。実施例４ ：固定化α−アミラーゼ複合体の調製 商標名クララーゼ(CLARASE) L-40,000（ソルベーエンザ
イムズ社(SOLVAY ENZYMES Inc.)(インジアナ州、エルカ
ート）製）の下で市販されている真菌α−アミラーゼ44
mlを準備し、実施例１に記載の固定化手順に従って、固
定化α−アミラーゼ複合体のサンプル（サンプルＥとい
う）を形成した。この商標名クララーゼ(CLARASE) L-4
0,000の下で市販されている真菌α−アミラーゼは酵素
活性40,000 SKBU/ｇを有する。１(SKBU)α−アミラーゼ
活性単位は、該アッセイ条件下で、１時間当たり1.0gの
限界−デキストリン基質をデキストリンに転化するであ
ろう活性を表す。この固定化酵素複合体の活性は638 U/
g であることが分かった。
【００３３】実施例５：抽出媒体中における固定化α−
アミラーゼ複合体の安定性 実施例４に従って調製した固定化酵素複合体のサンプル
５mlを準備し、かつ実施例１に記載した酵素活性のアッ
セイ手順に従ってアッセイした。但し、基質のpHを 6.0
とした。該固定化真菌α−アミラーゼ複合体の安定性
を、該酵素を一夜30℃にてインキュベートすることによ
り、実施例２に記載の如く評価した。該NaClアセテート
バッファーのpHは、実施例１の固定化グルコアミラーゼ
に対するpHが5.0 であったのに対して、 6.0であり、可
溶化真菌α−アミラーゼの活性をアッセイするための温
度は60℃ではなく、50℃とした。比較のために、米国レ
ターパテントNo. 4,713,333 の実施例１で使用した方法
に従って調製した固定化真菌α−アミラーゼ複合体のサ
ンプル（サンプルＦという）を、上の章に記載したもの
と同一の方法でテストした。サンプルＥおよびＦをアッ
セイした結果を以下の表３に与える。
アミラーゼ複合体の安定性 実施例４に従って調製した固定化酵素複合体のサンプル
５mlを準備し、かつ実施例１に記載した酵素活性のアッ
セイ手順に従ってアッセイした。但し、基質のpHを 6.0
とした。該固定化真菌α−アミラーゼ複合体の安定性
を、該酵素を一夜30℃にてインキュベートすることによ
り、実施例２に記載の如く評価した。該NaClアセテート
バッファーのpHは、実施例１の固定化グルコアミラーゼ
に対するpHが5.0 であったのに対して、 6.0であり、可
溶化真菌α−アミラーゼの活性をアッセイするための温
度は60℃ではなく、50℃とした。比較のために、米国レ
ターパテントNo. 4,713,333 の実施例１で使用した方法
に従って調製した固定化真菌α−アミラーゼ複合体のサ
ンプル（サンプルＦという）を、上の章に記載したもの
と同一の方法でテストした。サンプルＥおよびＦをアッ
セイした結果を以下の表３に与える。
【００３４】
【表３】 サンプル 初期活性(U/ml) 後抽出活性(U/ml) 活性喪失量(%) Ｅ 274 266.5 3.0 Ｆ 366 156.0 57.0
【００３５】明らかにこの結果は、本発明の方法に従っ
て調製した該固定化α−アミラーゼ複合体の該処理α−
アミラーゼが、該複合体のマトリックス中において、米
国レターパテントNo. 4,713,333 に従って調製した固定
化真菌α−アミラーゼ複合体の処理α−アミラーゼより
も、一層安定性が高い（堅固に維持されている）ことを
示しており、かくして本発明の複合体に見られた如く、
該複合体から該反応媒体への該酵素の喪失量が低減され
ることが分かる。実施例６ ：ガラスカラムにおける固定化α−アミラーゼ
複合体の安定性 実施例４に従って、固定化α−アミラーゼ複合体50mlを
調製した（サンプルＧという）。比較のために、米国レ
ターパテントNo. 4,713,333 の実施例１に従って固定化
α−アミラーゼ複合体のサンプルをも調製した（サンプ
ルＨという）。これら固定化真菌α−アミラーゼ複合体
の両サンプル（サンプルＧおよびＨ）の安定性を実施例
３に記載したカラム法によって評価した。但し、5%(w/
v) のNaClを含む0.02 Nアセテートバッファー中の10%(w
/v)のDS（乾燥固体）シロップのpHを 5.0ではなく6.0
とし、かつ該カラムの温度を55℃ではなく50℃とした。
カラム法を利用した、サンプルＧおよびＨのアッセイの
結果を以下の表４に与える。
て調製した該固定化α−アミラーゼ複合体の該処理α−
アミラーゼが、該複合体のマトリックス中において、米
国レターパテントNo. 4,713,333 に従って調製した固定
化真菌α−アミラーゼ複合体の処理α−アミラーゼより
も、一層安定性が高い（堅固に維持されている）ことを
示しており、かくして本発明の複合体に見られた如く、
該複合体から該反応媒体への該酵素の喪失量が低減され
ることが分かる。実施例６ ：ガラスカラムにおける固定化α−アミラーゼ
複合体の安定性 実施例４に従って、固定化α−アミラーゼ複合体50mlを
調製した（サンプルＧという）。比較のために、米国レ
ターパテントNo. 4,713,333 の実施例１に従って固定化
α−アミラーゼ複合体のサンプルをも調製した（サンプ
ルＨという）。これら固定化真菌α−アミラーゼ複合体
の両サンプル（サンプルＧおよびＨ）の安定性を実施例
３に記載したカラム法によって評価した。但し、5%(w/
v) のNaClを含む0.02 Nアセテートバッファー中の10%(w
/v)のDS（乾燥固体）シロップのpHを 5.0ではなく6.0
とし、かつ該カラムの温度を55℃ではなく50℃とした。
カラム法を利用した、サンプルＧおよびＨのアッセイの
結果を以下の表４に与える。
【００３６】
【表４】 サンプル 初期活性(U/ml) 後抽出活性(U/ml) 活性喪失量(%) Ｇ 638 608 4.7 Ｈ 851 518 39.0
【００３７】明らかにこれらの結果は、本発明の方法に
従って調製した該固定化真菌α−アミラーゼ複合体の該
処理真菌α−アミラーゼが、該複合体のマトリックス中
において、米国レターパテントNo. 4,713,333 に従って
調製した固定化真菌α−アミラーゼ複合体の処理真菌α
−アミラーゼよりも、一層安定性が高い（堅固に維持さ
れている）ことを示しており、かくして本発明の複合体
に見られた如く、該複合体から該反応媒体への該酵素の
喪失量が低減されることが分かる。実施例７ ：固定化α−アミラーゼ複合体の安定性（半減
期） 安定性を観測するためのもう一つの方法は、固定化酵素
複合体をカラム中に入れ、次いで該酵素複合体の床に基
質を通した際の活性を監視することである。実施例４に
記載のようにして調製した固定化真菌α−アミラーゼ複
合体（サンプルＩという）15mlを、径1.5 cm、高さ50cm
のガラス製のジャケット付きカラムに入れた。このカラ
ムを温度60℃に維持し、約45 ml/時の一定流量にて供給
シロップを該床を介して浸透させた。この供給シロップ
は、pH 6.0に調節した、40%DS（乾燥固体）43 DE シロ
ップで構成され、また以下の保存剤を添加したものであ
った：0.3%(w/v) の安息香酸ナトリウム、0.15%(w/v)の
カリウムソルベート、125ppmのメチルパラベンおよび25
0ppmのSO2 。毎日サンプルを採取し、その炭水化物プロ
フィールをHPLC分析により得た。その二糖画分を使用
し、固定化酵素複合体１ml当たり、かつ１分当たりに形
成されるマルトースの量（μM)を算出することにより、
その活性を計算した。比較のために、米国レターパテン
トNo. 4,713,333 の実施例１で使用した方法に従って固
定化真菌α−アミラーゼ複合体のサンプルをも調製し
（サンプルＪという）、上記の章に記載のものと同一の
方法でテストした。これらサンプルＩおよびＪのアッセ
イの結果を以下の表５に与える。
従って調製した該固定化真菌α−アミラーゼ複合体の該
処理真菌α−アミラーゼが、該複合体のマトリックス中
において、米国レターパテントNo. 4,713,333 に従って
調製した固定化真菌α−アミラーゼ複合体の処理真菌α
−アミラーゼよりも、一層安定性が高い（堅固に維持さ
れている）ことを示しており、かくして本発明の複合体
に見られた如く、該複合体から該反応媒体への該酵素の
喪失量が低減されることが分かる。実施例７ ：固定化α−アミラーゼ複合体の安定性（半減
期） 安定性を観測するためのもう一つの方法は、固定化酵素
複合体をカラム中に入れ、次いで該酵素複合体の床に基
質を通した際の活性を監視することである。実施例４に
記載のようにして調製した固定化真菌α−アミラーゼ複
合体（サンプルＩという）15mlを、径1.5 cm、高さ50cm
のガラス製のジャケット付きカラムに入れた。このカラ
ムを温度60℃に維持し、約45 ml/時の一定流量にて供給
シロップを該床を介して浸透させた。この供給シロップ
は、pH 6.0に調節した、40%DS（乾燥固体）43 DE シロ
ップで構成され、また以下の保存剤を添加したものであ
った：0.3%(w/v) の安息香酸ナトリウム、0.15%(w/v)の
カリウムソルベート、125ppmのメチルパラベンおよび25
0ppmのSO2 。毎日サンプルを採取し、その炭水化物プロ
フィールをHPLC分析により得た。その二糖画分を使用
し、固定化酵素複合体１ml当たり、かつ１分当たりに形
成されるマルトースの量（μM)を算出することにより、
その活性を計算した。比較のために、米国レターパテン
トNo. 4,713,333 の実施例１で使用した方法に従って固
定化真菌α−アミラーゼ複合体のサンプルをも調製し
（サンプルＪという）、上記の章に記載のものと同一の
方法でテストした。これらサンプルＩおよびＪのアッセ
イの結果を以下の表５に与える。
【００３８】
【表５】
【００３９】明らかにこれらの結果は、本発明の方法に
従って調製した該固定化真菌α−アミラーゼ複合体の該
処理真菌α−アミラーゼが、米国レターパテントNo. 4,
713,333 に従って調製した固定化真菌α−アミラーゼ複
合体の処理真菌α−アミラーゼよりも、前者が著しく高
い半減期を示すことから、一層安定性が高いことを示し
ている。実施例８ ：固定化β−アミラーゼ複合体の調製 １ml当たり1500単位のジアスターゼ活性をもつβ−アミ
ラーゼ48mlを準備し、実施例１の固定化手順に従って、
固定化β−アミラーゼ腹腔体のサンプル（サンプルＫと
いう）を調製した。フードケミカルコーデックス(Food
Chemical Codex), Vol. III (1981), p. 484に記載され
たジアスターゼ活性測定法により決定し、デグリーオブ
ジアスタティックパワー(DP0) として表した。この調製
品の酵素活性は乾燥重量基準で、860 U/g であることが
分かった。
従って調製した該固定化真菌α−アミラーゼ複合体の該
処理真菌α−アミラーゼが、米国レターパテントNo. 4,
713,333 に従って調製した固定化真菌α−アミラーゼ複
合体の処理真菌α−アミラーゼよりも、前者が著しく高
い半減期を示すことから、一層安定性が高いことを示し
ている。実施例８ ：固定化β−アミラーゼ複合体の調製 １ml当たり1500単位のジアスターゼ活性をもつβ−アミ
ラーゼ48mlを準備し、実施例１の固定化手順に従って、
固定化β−アミラーゼ腹腔体のサンプル（サンプルＫと
いう）を調製した。フードケミカルコーデックス(Food
Chemical Codex), Vol. III (1981), p. 484に記載され
たジアスターゼ活性測定法により決定し、デグリーオブ
ジアスタティックパワー(DP0) として表した。この調製
品の酵素活性は乾燥重量基準で、860 U/g であることが
分かった。
【００４０】実施例９：抽出媒体における固定化β−ア
ミラーゼ複合体の安定性 実施例８に従って調製した固定化酵素複合体のサンプル
（サンプルＬという）５mlを準備し、かつ実施例１に記
載の酵素活性のアッセイ法に従って（但し、基質のpHを
5.5とした）アッセイした。この固定化β−アミラーゼ
複合体の安定性は、実施例２に記載の如くして、該酵素
を一夜30℃にてインキュベートすることにより評価し
た。該NaClアセテートバッファーのpHは、実施例２の固
定化グルコアミラーゼに対する 5.0に対して、5.5と
し、また可溶性β−アミラーゼの活性をアッセイするた
めの温度は60℃ではなく55℃とした。比較の目的で、米
国レターパテントNo. 4,713,333 の実施例１で使用した
方法に従って調製した固定化β−アミラーゼ複合体のサ
ンプル（サンプルＭという）を上の章に記載したものと
同一の方法でテストした。これらサンプルＬおよびＭに
関するアッセイの結果を以下の表６に与える。
ミラーゼ複合体の安定性 実施例８に従って調製した固定化酵素複合体のサンプル
（サンプルＬという）５mlを準備し、かつ実施例１に記
載の酵素活性のアッセイ法に従って（但し、基質のpHを
5.5とした）アッセイした。この固定化β−アミラーゼ
複合体の安定性は、実施例２に記載の如くして、該酵素
を一夜30℃にてインキュベートすることにより評価し
た。該NaClアセテートバッファーのpHは、実施例２の固
定化グルコアミラーゼに対する 5.0に対して、5.5と
し、また可溶性β−アミラーゼの活性をアッセイするた
めの温度は60℃ではなく55℃とした。比較の目的で、米
国レターパテントNo. 4,713,333 の実施例１で使用した
方法に従って調製した固定化β−アミラーゼ複合体のサ
ンプル（サンプルＭという）を上の章に記載したものと
同一の方法でテストした。これらサンプルＬおよびＭに
関するアッセイの結果を以下の表６に与える。
【００４１】
【表６】 サンプル 初期活性(U/ml) 後抽出活性(U/ml) 活性喪失量(%) Ｌ 370 369 < 0.5 Ｍ 201 188 6.5
【００４２】明らかにこれらの結果は、本発明の方法に
従って調製した該固定化β−アミラーゼ複合体の該処理
β−アミラーゼが、該複合体のマトリックス中におい
て、米国レターパテントNo. 4,713,333 に従って調製し
た固定化β−アミラーゼ複合体の処理β−アミラーゼよ
りも、一層安定性が高い（堅固に維持されている）こと
を示しており、かくして本発明の複合体に見られた如
く、該複合体から該反応媒体への該酵素の喪失量が低減
されることが分かる。上記教示に照らして、本発明の多
数の改良並びに変更が可能であることは明らかである。
従って、本発明の上記特許請求の範囲内で、本発明は、
本明細書に具体的に記載した以上のことをも実施できる
と理解すべきである。
従って調製した該固定化β−アミラーゼ複合体の該処理
β−アミラーゼが、該複合体のマトリックス中におい
て、米国レターパテントNo. 4,713,333 に従って調製し
た固定化β−アミラーゼ複合体の処理β−アミラーゼよ
りも、一層安定性が高い（堅固に維持されている）こと
を示しており、かくして本発明の複合体に見られた如
く、該複合体から該反応媒体への該酵素の喪失量が低減
されることが分かる。上記教示に照らして、本発明の多
数の改良並びに変更が可能であることは明らかである。
従って、本発明の上記特許請求の範囲内で、本発明は、
本明細書に具体的に記載した以上のことをも実施できる
と理解すべきである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジャック ダブリュー ブルーア アメリカ合衆国 インディアナ州 46514 エルクハート ストロング アベニュー 814 (72)発明者 シャロン エム サーバー アメリカ合衆国 インディアナ州 46507 ブリストル ウッドサイド ドライヴ 53577
Claims (22)
- 【請求項１】 (a) 多孔質粒状珪藻土と、少なくとも１
つのペンダントアミノ基をもつポリアミン化合物の溶液
とを接触させて、担体を生成する工程と、 (b) 酵素と、多官能性アルデヒド、多官能性有機ハライ
ド、多官能性無水物、多官能性アゾ化合物、多官能性イ
ソチオシアネート、多官能性イソシアネートおよび２種
以上のこれら物質のブレンドからなる群から選ばれる少
なくとも１種のアミン反応性物質の溶液とを接触させ
て、処理酵素−含有アダクトを生成する工程と、 (c) 該担体と、該処理アダクトとが反応して固定化酵素
複合体を形成するように、該担体と、該処理アダクトと
を接触させる工程と、を含むことを特徴とする固定化酵
素複合体の調製方法。 - 【請求項２】 該アミン反応性物質がグルタルアルデヒ
ドである請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 該ポリアミン化合物がポリエチレンイミ
ンである請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 該酵素が、該アミン反応性物質と反応し
得るアミノ基を含む請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 該アミン反応性物質と該酵素との間の比
が、該酵素１ml当たり、該アミン反応性物質約0.10ｇ〜
約1.50ｇである請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 上記工程(b) を、攪拌を含む条件下で実
施する請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 上記工程(c) の後に、水で該固定化酵素
複合体を洗浄する工程をも含む請求項１に記載の方法。 - 【請求項８】 該処理アダクトと該担体との間の比が、
該担体１ｇ当たり、該処理アダクト約0.05ml〜約0.6 ml
の範囲である請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】 固定化グルコアミラーゼ複合体の調製方
法であって、 (a) 固体支持体と、ポリエチレンイミンの溶液とを接触
させて、担体を生成する工程と、 (b) グルコアミラーゼと、グルタルアルデヒドの溶液と
を接触させて、処理酵素−含有アダクトを生成する工程
と、 (c) 該担体と該処理アダクトとが反応して、該固定化グ
ルコアミラーゼ複合体を形成するように、該担体と該処
理アダクトとを接触させる工程と、を含むことを特徴と
する上記方法。 - 【請求項10】 固定化真菌α−アミラーゼ複合体の調製
方法であって、 (a) 固体支持体と、ポリエチレンイミンの溶液とを接触
させて、担体を生成する工程と、 (b) 真菌α−アミラーゼと、グルタルアルデヒドの溶液
とを接触させて、処理酵素−含有アダクトを生成する工
程と、 (c) 該担体と該処理アダクトとが反応して、該固定化真
菌α−アミラーゼ複合体を形成するように、該担体と該
処理アダクトとを接触させる工程と、を含むことを特徴
とする上記方法。 - 【請求項11】 固定化β−アミラーゼ複合体の調製方法
であって、 (a) 固体支持体と、ポリエチレンイミンの溶液とを接触
させて、担体を生成する工程と、 (b) β−アミラーゼと、グルタルアルデヒドの溶液とを
接触させて、処理酵素−含有アダクトを生成する工程
と、 (c) 該担体と該処理アダクトとが反応して、該固定化β
−アミラーゼ複合体を形成するように、該担体と該処理
アダクトとを接触させる工程と、を含むことを特徴とす
る上記方法。 - 【請求項12】 担体と処理アダクトとを含み、該担体が
少なくとも１つのペンダントアミノ基をもつポリアミン
化合物および該ポリアミン化合物と結合して担体を形成
している固体支持体を含み、該処理アダクトが多官能性
アルデヒド、多官能性有機ハライド、多官能性無水物、
多官能性アゾ化合物、多官能性イソチオシアネート、多
官能性イソシアネートおよび２種以上のこれら物質のブ
レンドからなる群から選ばれる少なくとも１種のアミン
反応性物質を含み、かつ該処理アダクトが、更に少なく
とも１種の酵素をも含み、該酵素と該少なくとも１種の
アミン反応性物質とを接触させることにより該酵素を処
理して、処理酵素−含有アダクトを形成しており、かつ
該担体が該処理酵素−含有アダクトと結合し、安定かつ
活性な固定化酵素複合体を形成していることを特徴とす
る、固定化酵素複合体。 - 【請求項13】 該アミン反応性物質がグルタルアルデヒ
ドである請求項12記載の固定化酵素複合体。 - 【請求項14】 該ポリアミン化合物がポリエチレンイミ
ンである請求項12記載の固定化酵素複合体。 - 【請求項15】 該酵素が該アミン反応性物質と反応でき
るアミノ基を含有する請求項12記載の固定化酵素複合
体。 - 【請求項16】 該アミン反応性物質と該酵素との間の比
が、該酵素１ml当たり該アミン反応性物質約0.10ｇ〜約
1.50ｇの範囲にある請求項12記載の固定化酵素複合体。 - 【請求項17】 該処理酵素−含有アダクトと該担体との
間の比が、該担体1g当たり該処理酵素−含有アダクト約
0.05ml〜約0.6 mlの範囲にある請求項12記載の固定化酵
素複合体。 - 【請求項18】 担体と処理アダクトとを含み、該担体が
ポリエチレンイミンと該ポリエチレンイミンに結合して
担体を形成する固体支持体とを含み、該処理アダクトが
グルタルアルデヒドおよびグルコアミラーゼを含み、該
グルコアミラーゼは該グルタルアルデヒドとの接触によ
り処理されて処理グルコアミラーゼ−含有アダクトを形
成し、かつ該担体は該処理グルコアミラーゼ−含有アダ
クトと結合し、安定かつ活性な固定化グルコアミラーゼ
複合体を形成していることを特徴とする、固定化グルコ
アミラーゼ複合体。 - 【請求項19】 担体と処理アダクトとを含み、該担体が
ポリエチレンイミンと該ポリエチレンイミンに結合して
担体を形成する固体支持体とを含み、該処理アダクトが
グルタルアルデヒドおよび真菌α−アミラーゼとを含
み、該真菌α−アミラーゼは該グルタルアルデヒドとの
接触により処理されて、処理真菌α−アミラーゼ−含有
アダクトを形成し、かつ該担体は該処理真菌α−アミラ
ーゼ−含有アダクトと結合して、安定かつ活性な固定化
真菌α−アミラーゼ複合体を形成していることを特徴と
する、固定化真菌α−アミラーゼ複合体。 - 【請求項20】 担体と処理アダクトとを含み、該担体が
ポリエチレンイミンと該ポリエチレンイミンに結合して
担体を形成する固体支持体とを含み、該処理アダクトが
グルタルアルデヒドおよびβ−アミラーゼを含み、該β
−アミラーゼは該グルタルアルデヒドとの接触により処
理されて、処理β−アミラーゼ−含有アダクトを形成
し、かつ該担体は該処理β−アミラーゼ−含有アダクト
と結合して、安定かつ活性な固定化β−アミラーゼ複合
体を形成していることを特徴とする、固定化β−アミラ
ーゼ複合体。 - 【請求項21】 固体担体と処理アダクトとを含み、該処
理アダクトが多官能性アルデヒド、多官能性有機ハライ
ド、多官能性無水物、多官能性アゾ化合物、多官能性イ
ソチオシアネート、多官能性イソシアネートおよび２種
以上のこれら物質のブレンドからなる群から選ばれる少
なくとも１種のアミン反応性物質を含み、かつ該処理ア
ダクトが、更に少なくとも１種の酵素をも含み、該酵素
と少なくとも１種の該アミン反応性物質とを接触させる
ことにより該酵素を処理して、処理酵素−含有アダクト
を形成しており、かつ該担体が該処理酵素−含有アダク
トと結合して、安定かつ活性な固定化酵素複合体を形成
していることを特徴とする、固定化酵素複合体。 - 【請求項22】 固定化酵素複合体を調製するための液状
処理アダクトであって、該処理アダクトが多官能性アル
デヒド、多官能性有機ハライド、多官能性無水物、多官
能性アゾ化合物、多官能性イソチオシアネート、多官能
性イソシアネートおよび２種以上のこれら物質のブレン
ドからなる群から選ばれる少なくとも１種のアミン反応
性物質を含み、かつ該処理アダクトが、更に少なくとも
１種の酵素をも含み、該酵素と少なくとも１種の該アミ
ン反応性物質とを接触させることにより該酵素を処理し
て、処理酵素−含有アダクトを形成していることを特徴
とする上記液状処理アダクト。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11414393A | 1993-09-01 | 1993-09-01 | |
| US08/114143 | 1993-09-01 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07147981A true JPH07147981A (ja) | 1995-06-13 |
Family
ID=22353595
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6208447A Pending JPH07147981A (ja) | 1993-09-01 | 1994-09-01 | 固定化酵素複合体の製造法および該方法により調製した固定化酵素複合体 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5472861A (ja) |
| EP (1) | EP0641859B1 (ja) |
| JP (1) | JPH07147981A (ja) |
| KR (1) | KR950008685A (ja) |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009509513A (ja) * | 2005-09-30 | 2009-03-12 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 酵素の固定化 |
| WO2012137752A1 (ja) * | 2011-04-07 | 2012-10-11 | 国立大学法人名古屋大学 | 有機物吸着材および該有機物吸着材を含有してなる有機物吸着性担体 |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998021302A1 (en) * | 1996-11-14 | 1998-05-22 | Polymer Technology Corporation | Use of water soluble enzyme-polymer conjugates for cleaning contact lenses |
| DE19833406A1 (de) * | 1998-07-24 | 2000-02-03 | Stadler Johann | Verfahren zur Immobilisierung von Mikroorganismen oder Enzymen |
| AU7595701A (en) * | 2000-07-17 | 2002-01-30 | Harvard College | Surfaces that resist the adsorption of biological species |
| AU2002307343A1 (en) * | 2001-04-17 | 2002-10-28 | Genencor International, Inc. | Method to bind enzyme to carrier using cationic copolymers and product produced thereby |
| US7147687B2 (en) * | 2001-05-25 | 2006-12-12 | Nanosphere, Inc. | Non-alloying core shell nanoparticles |
| US6960466B2 (en) * | 2001-05-31 | 2005-11-01 | Instrumentation Laboratory Company | Composite membrane containing a cross-linked enzyme matrix for a biosensor |
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| US20040256227A1 (en) * | 2003-02-11 | 2004-12-23 | Jungwon Shin | Electrochemical urea sensors and methods of making the same |
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| US7166451B1 (en) * | 2003-02-24 | 2007-01-23 | The Ohio State University | Immobilization of enzyme on a fibrous matrix |
| JP2005131492A (ja) * | 2003-10-29 | 2005-05-26 | Fuji Photo Film Co Ltd | 気液分離方法及び装置 |
| KR100930772B1 (ko) * | 2004-12-27 | 2009-12-09 | 현대자동차주식회사 | 글로브박스 댐퍼 구조 |
| US7241586B2 (en) * | 2005-02-17 | 2007-07-10 | Medtronic Minimed, Inc. | Polypeptide formulations and methods for making, using and characterizing them |
| US20110236859A1 (en) * | 2008-04-22 | 2011-09-29 | Keleman Bradley R | Oral care composition containing oxidase enzyme |
| US20170006902A1 (en) | 2014-02-13 | 2017-01-12 | Danisco Us Inc. | Strategy for sucrose reduction and generation of insoluble fiber in juices |
| US9988657B2 (en) * | 2014-02-27 | 2018-06-05 | E I Du Pont De Nemours And Company | Enzymatic hydrolysis of disaccharides and oligosaccharides using alpha-glucosidase enzymes |
| CN104911225A (zh) * | 2015-06-05 | 2015-09-16 | 浙江工业大学 | 一种化学-酶法生产加巴喷丁的方法 |
| US10266861B2 (en) | 2015-12-14 | 2019-04-23 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Production and composition of fructose syrup |
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Family Cites Families (5)
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|---|---|---|---|---|
| US4355105A (en) * | 1981-03-30 | 1982-10-19 | Miles Laboratories, Inc. | Glutaraldehyde/polyethylenimine immobilization of whole microbial cells |
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| US4713333A (en) * | 1985-09-23 | 1987-12-15 | Miles Laboratories, Inc. | Immobilization of biocatalysts on granular diatomaceous earth |
-
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009509513A (ja) * | 2005-09-30 | 2009-03-12 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 酵素の固定化 |
| WO2012137752A1 (ja) * | 2011-04-07 | 2012-10-11 | 国立大学法人名古屋大学 | 有機物吸着材および該有機物吸着材を含有してなる有機物吸着性担体 |
| JPWO2012137752A1 (ja) * | 2011-04-07 | 2014-07-28 | 国立大学法人名古屋大学 | 有機物吸着材および該有機物吸着材を含有してなる有機物吸着性担体 |
| JP5952187B2 (ja) * | 2011-04-07 | 2016-07-13 | 国立大学法人名古屋大学 | 微生物吸着担体 |
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