WO2020159061A1 - 효소-다공성 탄소 복합체 - Google Patents

효소-다공성 탄소 복합체 Download PDF

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WO2020159061A1
WO2020159061A1 PCT/KR2019/016745 KR2019016745W WO2020159061A1 WO 2020159061 A1 WO2020159061 A1 WO 2020159061A1 KR 2019016745 W KR2019016745 W KR 2019016745W WO 2020159061 A1 WO2020159061 A1 WO 2020159061A1
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enzyme
group
porous carbon
porous
complex
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PCT/KR2019/016745
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김중배
주영준
김리나
남자현
이인선
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고려대학교 산학협력단
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    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y101/03—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a oxygen as acceptor (1.1.3)
    • C12Y101/03004—Glucose oxidase (1.1.3.4)

Definitions

  • the present invention relates to an enzyme-porous carbon complex, and more specifically, to improve the stability of an enzyme by immobilizing the enzyme on a porous material, preventing enzyme leakage for a long time and effectively fixing the enzyme inside the porous carbon material- Porous carbon composites.
  • Enzymes are biocatalysts that promote a variety of chemical reactions, have high selectivity, precision, and efficiency, and can be used in a variety of industries because they promote chemical reactions at very high speeds even at room temperature and pressure.
  • the three-dimensional structure of the enzyme is easily denatured by an external environment such as heat, pH, and shear stress, and thus, the activity of the enzyme is rapidly lost. Therefore, various studies have been conducted to improve the stability of the enzyme.
  • the technique of immobilizing the enzyme on a solid support not only improves the stability of the enzyme, but also has the advantage of easily separating the immobilized enzyme from the reaction solution as a heterogeneous catalyst.
  • the porous material has been studied as an optimal material for immobilization of enzymes because it can control the size and shape of pores in various ways in response to the size of the enzyme.
  • the stability of the enzyme inside the pores of the porous material can be significantly improved due to the crowding effect existing at a high concentration of several hundred milligrams per milliliter.
  • the porous material can protect the enzyme immobilized therein from physical effects such as external shear stress, the enzymatic reaction can be applied even in harsh environments.
  • a technology has been studied to prevent the leakage of enzymes by covalently binding the enzymes inside the porous material.
  • a crosslinking agent is used to form a crosslink between the functional group of the porous material and the functional group of the enzyme side chain, thereby allowing the enzyme supported inside the porous material to It is a technology to prevent leakage.
  • Nanoenzyme reactor technology supports the enzyme inside the porous material by increasing the size of the cross-linked enzymes rather than the pore inlet diameter of the porous material by supporting the enzyme inside the porous material and forming cross-links between the enzymes before the supported enzymes leak. It is a technology that prevents enzymes from leaking.
  • biocompatibility of the crosslinking agent such as glutaraldehyde may be a problem, and thus there is a problem that is difficult to utilize in the medical field.
  • the present invention has been devised to solve the above problems, while immobilizing the enzyme in the porous material while minimizing the degradation of enzyme activity, preventing leakage of the enzyme immobilized in the porous material, and improving the stability of the enzyme immobilized in the porous material. It is an object to provide a secured enzyme-porous carbon complex.
  • the present invention provides an enzyme-porous carbon composite comprising a porous carbon carrier and an enzyme supported inside the pores of the porous carbon carrier.
  • At least a portion of the enzyme may be adsorbed and supported inside the pores of the porous carbon carrier.
  • the porous carbon carrier may be mesoporous carbon and/or microporous carbon, and for example, the pore size may be 1 to 5000 nm.
  • the enzyme is trypsin, chymotrypsin, pepsin, lipase, glycase, horseradish peroxidase, tyroxinase, carbonic anhydrase, formaldehyde dehydrogenase, formic acid dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, cholesterol dehydrogenase, One selected from the group consisting of acylase, lactonase, protease, peroxydate, aminopeptide, phosphatase, transaminase, serine-endopeptidase, cysteine-endopeptidase and metalloendopeptidase. It may contain the above enzymes.
  • porous carbon carrier may further include a first functional group on the pore surface to induce any one or more of hydrophobic interaction and hydrophilic interaction with the enzyme.
  • the first functional group is an alkyl group, a phenyl group, a benzyl group, a vinyl group and a functional group that induces any one or more hydrophobic interactions selected from the group consisting of hydroxy group, carbonyl group, halide group, carboxyl group, methox Any one or more functional groups inducing any one or more hydrophilic interactions selected from the group consisting of a group, a hydroperoxy group, an amine group, an imine group, an imide group, a nitryl group, a nitro group, a thiol group, a sulfino group, and a phosphoric acid group. It can contain.
  • the enzyme may further include a second functional group for inducing any one or more of hydrophobic interaction and hydrophilic interaction with the pore surface of the porous carbon carrier.
  • the second functional group is a functional group that induces any one or more hydrophobic interactions selected from the group consisting of an alkyl group, a phenyl group, a benzyl group, a vinyl group, and a halo group, and a hydroxy group, a carbonyl group, a halide group, a carboxyl group, methox
  • Any one or more functional groups inducing any one or more hydrophilic interactions selected from the group consisting of a group, a hydroperoxy group, an amine group, an imine group, an imide group, a nitryl group, a nitro group, a thiol group, a sulfino group, and a phosphoric acid group. It can contain.
  • the enzyme-porous carbon composite may be mixed with a buffer solution for 12 days and then the amount of the enzyme carried on the porous carbon composite may be less than 33% compared to before stirring.
  • the enzyme-porous carbon complex may be mixed with a buffer solution for 12 days and then the enzyme activity of the enzyme-porous carbon complex may be 16% or more compared to before stirring.
  • the enzyme-porous carbon composite may be mixed with a buffer solution for 45 days after stirring, and the enzyme activity of the enzyme-porous carbon composite may be 72% or more compared to before stirring.
  • the present invention provides an electrode for a biofuel cell or biosensor comprising the enzyme-porous carbon composite according to the present invention.
  • the present invention provides a carbon dioxide conversion system comprising the enzyme-porous carbon complex according to the present invention.
  • the present invention provides an antifouling system comprising the enzyme-porous carbon complex according to the present invention.
  • the enzyme-porous carbon composite according to the present invention can be suitably used for immobilizing and stabilizing the enzyme inside the porous carbon without denaturation of the enzyme active site.
  • the use in medical fields where use has been limited may be expanded as the enzyme is immobilized and stabilized without using a component having a problem in biocompatibility such as a crosslinking agent applied to a conventional enzyme stabilization technique.
  • a component having a problem in biocompatibility such as a crosslinking agent applied to a conventional enzyme stabilization technique.
  • the enzyme-porous carbon complex is used for immobilization of related enzymes such as oxidase for the purpose of producing electrodes for glucose-based bio fuel cells and biosensors for the purpose of measuring blood sugar, a very high stabilization effect can be achieved. Can.
  • FIG. 1 schematically shows a process for preparing an enzyme-porous carbon composite according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is a graph showing the activity of the enzyme per porous carbon unit weight in the formic acid dehydrogenase-porous carbon composite according to an embodiment of the present invention.
  • 3A to 3C are graphs showing the activity of enzymes per porous carbon unit weight in each of the oxidase-porous carbon complex, carbonic anhydrase-porous carbon complex, and acylase-porous carbon complex according to an embodiment of the present invention, respectively. to be.
  • 5A to 5C are graphs measuring the stability of enzyme activity over time of a glycosylase-porous carbon complex, carbonic anhydrase-porous carbon complex and acylase-porous carbon complex according to an embodiment of the present invention. .
  • 6A to 6C are graphs showing initial supported amounts of enzymes per porous carbon unit weight in a glycosylase-porous carbon composite, carbonic anhydrase-porous carbon composite, and acylase-porous carbon composite according to an embodiment of the present invention. to be.
  • 7A to 7C are enzymes per unit weight of porous carbon according to time stored in a glycosylase-porous carbon composite, carbonic anhydrase-porous carbon composite and acylase-porous carbon composite according to an embodiment of the present invention. It is a graph showing the change in loading amount.
  • FIG. 8 is a graph comparing the activity of a formic acid dehydrogenase-porous carbon complex and a crosslinked formic acid dehydrogenase immobilized in porous carbon according to an embodiment of the present invention.
  • 9A and 9B are graphs showing an initial loading amount of enzyme per weight of porous carbon in a functional group-treated glycosylase-porous carbon composite and acylase-porous carbon composite according to an embodiment of the present invention.
  • 10A and 10B are graphs showing changes in the amount of enzyme supported per weight of porous carbon units over time stored in functional group-treated glycosylase-porous carbon composites and acylase-porous carbon composites according to an embodiment of the present invention. to be.
  • 11A and 11B are glycosylase-porous carbon complexes, acylase-porous carbon complexes, functionalized glycosylase-porous carbon complexes and functionalized acylase-porous carbon complexes according to an embodiment of the present invention.
  • It is a graph showing the initial loading of the enzyme per unit weight of the porous carrier in the composite implemented by changing the porous carrier to porous silica.
  • the enzyme-porous carbon composite is implemented by including an enzyme and a porous carbon carrier, and specifically, an enzyme is supported in a pore provided inside the porous carbon carrier. .
  • the enzyme can be carried in the pores of the porous carbon carrier pore surface and without covalent bonding between the enzyme and the enzyme.
  • the enzyme may be provided in an adsorbed state in the pores of the porous carbon carrier.
  • at least some of the enzymes in the adsorbed state may be adsorbed on the pore surface of the porous carbon carrier.
  • the enzyme may be provided in the pores in an adsorbed state between any one enzyme and other adjacent enzymes. In this case, as the enzymes form aggregates without covalent bonding between enzymes, the physical size may be relatively larger than the inlet diameter of the pore, and through this, leakage of the enzyme from the pore may be minimized or prevented.
  • the fact that the enzyme is carried inside the pores of the porous material does not prevent the enzyme from leaking through the enzyme surface adsorption or the enzyme-to-enzyme adsorption. Also, regardless of the type of the porous material, the enzyme can be introduced into the pores of the porous material in an amount corresponding to the volume of the pores.
  • the inventor of the present invention can carry a large amount of the enzyme inside the pore when the porous carbon material is used as a carrier instead of the porous silica, which has been conventionally used to accommodate the enzyme in the pore inside the porous material, and the activity of the supported enzyme It has been discovered that it can be stably maintained for a long period of time, leading to this invention. This effect can be evaluated as a breakthrough that could not be expected in a conventional enzyme immobilization and stabilization method in which a crosslinking agent was used to prevent leakage of an enzyme supported in a porous material, or a functional group for covalent bonding had to be provided.
  • Comparative Example 7 in which the free enzyme was prepared in solution instead of Comparative Example 1 in which the activity was not measured was 2 ⁇ after the enzyme activity rapidly decreased to less than 40% compared to the initial activity before 1 day. Enzyme activity was almost lost within 3 days. However, it was confirmed that the enzyme supported in the pores in the porous carbon lasted for more than 45 days while maintaining a level close to 80% compared to the initial activity.
  • the porous carbon carrier may be used without limitation in the case of a carbon material having a plurality of pores therein, and preferably in the case of a carbon material capable of interacting with an enzyme.
  • the porous carbon may be porous carbon having a pore size of 1 to 5,000 nm, another example of 1 to 1,000 nm, and another example of 1 to 500 nm, but is not limited thereto.
  • the porous carbon carrier is not limited in shape, but may be, for example, spherical, elliptical, and amorphous particles, or may be embodied in a film form on the surface.
  • the porous carbon carrier in the form of particles may have a size of 100 nm to 1,000 ⁇ m, where the carrier size means a diameter in the case of a spherical shape or a maximum distance among two different points on the surface in the case of an amorphous shape.
  • the surface area of the porous carbon carrier may be 100 to 5000 m2/g, and the pore volume may be 0.1 to 10 cm3/g, but is not limited thereto.
  • the porous carbon carrier may further include a first functional group capable of inducing an interaction with an enzyme in order to prevent leakage of a supported enzyme and stably express enzymatic activity for a long time
  • the functional group may be provided at least on the surface of the pores in the porous carbon carrier.
  • the interaction is a non-covalent interaction, for example, the interaction may be a hydrophobic interaction or a hydrophilic interaction.
  • the hydrophilic interaction may be, for example, hydrogen bonding or ionic bonding.
  • the first functional group provided in the porous carbon carrier may be more advantageous in that the functional group that induces hydrophobic interaction is prevented from being introduced and leaked into the pores of the enzyme and is stably immobilized for a long time, rather than a functional group that can induce hydrophilic interaction.
  • the hydrophilic interaction may be advantageous depending on the properties of the enzyme to be introduced.
  • the first functional group may be employed without limitation in the case of a functional group capable of inducing a hydrophobic interaction or a hydrophilic interaction.
  • the first functional group is an alkyl group, a phenyl group, a benzyl group, a vinyl group, a halo group, etc.
  • the first functional group may be introduced through a known invention on the surface of the porous carbon pore, and the present invention is not particularly limited.
  • the enzyme supported in the pores in the above-described porous carbon carrier may be used without limitation in the case of a known enzyme.
  • the enzyme is preferably trypsin, chymotrypsin, pepsin, lipase, glycosylase, horseradish peroxidase, tyroxinase, carbonic anhydrase, formaldehyde dehydrogenase, formic acid dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, cholesterol dehydrogenase Select from the group consisting of acylase, lactonase, protease, peroxydate, aminopeptide, phosphatase, transaminase, serine-endopeptidase, cysteine-endopeptidase, metalloendopeptidase, etc.
  • any one or more may include any one or more.
  • any one or more enzymes selected from the group consisting of formic acid dehydrogenase, formaldehyde dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, etc. which may degrade enzymatic activity when immobilized through covalent or crosslinking because the stability of the conformation is rather poor
  • the enzyme is one or more of non-covalent interactions, specifically hydrophobic interactions and hydrophilic interactions to enhance the interaction between the porous carbon carrier and/or the enzyme carried in the pores of the carrier
  • a second functional group for inducing may be further provided.
  • the second functional group may function to prevent leakage from the porous carbon pore and to stably express enzymatic activity while minimizing the effect on the steric structure of the enzyme.
  • the second functional group may be employed without limitation in the case of a hydrophobic interaction or a functional group capable of inducing a hydrophilic interaction.
  • the second functional group may be an alkyl group, a phenyl group, a benzyl group, a vinyl group, a halo group, or the like.
  • Functional groups and hydroxy groups, carbonyl groups, halide groups, carboxyl groups, methoxy groups, hydroperoxy groups, amine groups, imine groups, imide groups, nitrile groups, nitro groups to induce any one or more hydrophobic interactions selected from the group consisting of , A thiol group, a sulfino group, a phosphoric acid group, and the like, and may include any one or more of functional groups that induce any one or more hydrophilic interactions.
  • the oxidase added with a vinyl group to the surface using acryloyl chloride and the same surface The acylase added with a vinyl group can be confirmed to have a significantly improved loading amount compared to a case in which a complex is formed with a porous carbon carrier without a second functional group in the enzyme.
  • the carrying amount of the enzyme is significantly lower than when the enzyme without the second functional group is supported on the porous carbon carrier. Can be confirmed.
  • the porous carbon carrier can easily introduce the enzyme into the pores when compared to the porous material of other materials, can provide a higher carrying amount compared to the silica carrier, and prevents the leakage of the enzyme even after continuous stirring reaction after introduction It has the advantage of being able to stably support the enzyme. Furthermore, when a functional group capable of inducing a non-covalent interaction to the porous carbon carrier and/or enzyme is additionally utilized by utilizing the porous carbon carrier, the interaction between the enzyme and the porous material is enhanced, thereby increasing the loading amount in the porous material, It has the advantage of being able to express more elevated enzyme immobilization and stabilization effects.
  • the enzyme may be an amino acid constituting the enzyme for the purpose of improving the interaction with the porous carbon carrier described above, but may be genetically recombined for the purpose of addition/removal or modification, but is not limited thereto.
  • the porous carbon used was one having a pore size of 26 nm, a window size of 17 nm, and a pore volume of 1.53 cm 3 /g.
  • the formic acid dehydrogenase solution (5 mg/mL) prepared in phosphate buffer (100 mM pH 7.0) and 2 mg of porous silica (mesoporous silica) powder were mixed in a volume of 2 mL, and then stirred at 200 rpm for 30 minutes. Through this process, formic acid dehydrogenase is carried in pores in the porous silica. The formic acid dehydrogenase unsupported on the porous silica was removed, washed three times with a phosphate buffer solution, and stored at 4°C.
  • the porous silica was used to have a pore size of 25 nm, a window size of 18 nm, and a pore volume of 1.90 cm 3 /g.
  • an enzyme-porous carbon complex was prepared by using carbonic anhydrase (bCA) in a phosphate buffer (100 mM pH 7.6).
  • Preparation was carried out in the same manner as in Example 1, but the enzyme was changed to a sugar oxidase having a vinyl group introduced to prepare an enzyme-porous carbon complex. At this time, a vinyl group was introduced on the enzyme surface by treating acryloyl chloride with a phosphoric acid buffer solution containing glycosylase.
  • Example 2 Prepared in the same manner as in Example 1, the enzyme was changed to an acylase into which vinyl groups were introduced to prepare an enzyme-porous carbon composite. At this time, a vinyl group was introduced on the surface of the enzyme by treating acryloyl chloride with a phosphoric acid buffer solution containing acylase.
  • FDH formic acid dehydrogenase
  • glutaraldehyde was added as a crosslinking agent to prepare a complex carrying a crosslinked glycase. At this time, glutaraldehyde was added at a concentration of 0.01% w/v.
  • glutaraldehyde was added as a crosslinking agent to prepare a complex carrying a crosslinked acylase. At this time, glutaraldehyde was added at a concentration of 0.1% w/v.
  • the amount of the enzyme supported was determined by quantifying the amount of the initial enzyme introduced for immobilization and the amount of the enzyme released in the washing process through a protein analysis method, and calculating the difference between the amount of the initial enzyme and the amount of the enzyme released in the washing process.
  • the amount of enzyme released is continuously quantified through the protein analysis method by dispersing a sample in a phosphate buffer, and then, while stirring at 200 rpm, the amount of the enzyme released over time, and the accumulated amount of the enzyme is calculated. At this time, the amount of enzyme released over time was calculated, including up to three washing processes after enzyme loading, and the results are shown in FIGS. 6A, 7A, 9A, 10A, and 11A.
  • the enzyme release amount of Example 2 which is an enzyme-porous carbon composite using carbon
  • Comparative Example 2 which is an enzyme-porous silica composite using a sugar oxidase and porous silica
  • the initial activity of the formic acid dehydrogenase-porous carbon complex was measured using an ultraviolet-visible spectrophotometer. More specifically, a formic acid dehydrogenase-porous carbon complex was added to the mixed solution (200 mM sodium formate, 2 mM NAD+, and 100 mM sodium phosphate buffer), and the time at 340 nm can be measured for the amount of NADH. The absorbance according to was measured, and the activity was calculated.
  • the enzyme stability of the formic acid dehydrogenase-porous carbon complex was evaluated while continuously measuring the enzyme activity over time, and the results are shown in FIGS. 2, 4 and 8. At this time, the solution containing the enzyme-porous carbon complex was stored under stirring at 200 rpm at room temperature.
  • the enzyme activity of the glycase-porous carbon complex was measured using an ultraviolet-visible spectrophotometer. More specifically, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB), glucose, horseradish peroxidase (horseradish peroxidase) was added to a mixed solution of oxidase-porous carbon complex, and time at 655 nm The absorbance according to was measured, and the activity was calculated.
  • TMB 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine
  • glucose horseradish peroxidase
  • horseradish peroxidase horseradish peroxidase
  • the enzyme stability of the glycase-porous carbon complex was evaluated while continuously measuring the enzyme activity over time, and the results are shown in FIGS. 3A and 5A. At this time, the solution containing the enzyme-porous carbon complex was stored under stirring at 200 rpm at room temperature.
  • the initial activity of the carbonic anhydrase-porous carbon complex was measured using an ultraviolet-visible spectrophotometer. More specifically, a carbonic anhydrase-porous carbon complex was added to a mixed solution in which 60 mM 4-nitrophenyl acetate (4-NA) was dissolved in acetonitrile, and at 348 nm. The resulting absorbance change was measured.
  • 4-NA 4-nitrophenyl acetate
  • the enzyme stability of the carbonic anhydride-porous carbon complex was evaluated while continuously measuring the enzyme activity over time, and the results are shown in FIGS. 3B and 5B. At this time, the solution containing the enzyme-porous carbon complex was stored under stirring at 200 rpm at room temperature.
  • the enzyme activity of the acylase-porous carbon complex was measured using a fluorescence spectrophotometer. More specifically, the amount of change was measured using fluorescence generated by reaction of L-methionine produced by hydrolysis of N-acetyl-L-methionine with o-phthalaldehyde (OPA).
  • OPA o-phthalaldehyde
  • the enzyme stability of the acylase-porous carbon complex was evaluated while continuously measuring the enzyme activity over time, and the results are shown in FIGS. 3C and 5C. At this time, the solution containing the enzyme-porous carbon complex was stored under stirring at 200 rpm at room temperature.

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Abstract

본 발명은 효소-다공성 탄소 복합체에 관한 것이며, 더욱 상세하게는 다공성실리카보다 현저히 높은 효소 흡착량과 실현할 수 있으며, 고정화된 효소의 안정성을 높게 유지할 수 있는 효소-다공성 물질 복합체에 관한 것이다.

Description

효소-다공성 탄소 복합체
본 발명은 효소-다공성 탄소 복합체에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 다공성 물질에 효소를 고정화함으로써 효소의 안정성을 향상시키는 기술로서 장시간 효소의 누출을 방지하여 효소를 효과적으로 다공성 탄소 물질 내부에 고정시킨 효소-다공성 탄소 복합체에 관한 것이다.
효소는 다양한 화학반응을 촉진하는 생촉매 물질로, 고도의 선택성, 정밀성, 효율성 등을 가지고 있으며, 상온·상압 조건에서도 매우 빠른 속도로 화학반응을 촉진하기 때문에 다양한 산업에 이용될 수 있다. 하지만 산업 분야의 반응 환경에서는 열, pH, 전단 응력 등의 외부 환경에 의해 효소의 3차원 구조가 쉽게 변성이 되어 효소의 활성을 빠르게 잃어버리는 문제가 있다. 따라서 효소의 안정성을 향상시키기 위한 다양한 연구가 진행되고 있다.
효소의 안정성을 향상시키는 기술 중에서도 고체 지지체에 효소를 고정화하는 기법은 효소의 안정성을 향상시킬 수 있을 뿐 만 아니라, 비균질 촉매로서 반응 용액으로부터 고정화된 효소를 손쉽게 분리해 낼 수 있다는 장점이 있다. 특히 다공성 물질은 효소의 크기에 대응하여 공극의 크기 및 형태를 다양하게 조절할 수 있기 때문에 효소 고정화를 위한 최적의 물질로 연구되고 있다. 또한, 다공성 물질 내부에 효소를 고정화할 경우, 다공성 물질의 공극 내부에서 효소는 단위 밀리리터 당 수백 밀리그램의 고농도로 존재하는 밀집 효과(crowding effect)로 인해 그 안정성이 획기적으로 향상될 수 있다. 또한, 다공성 물질은 외부의 전단 응력 등 물리적인 효과로부터 내부에 고정화된 효소를 보호할 수 있기 때문에 가혹한 환경에서도 효소 반응을 적용할 수 있다.
그러나, 일반적인 다공성 물질의 내부에 담지된 효소는 쉽게 외부로 누출될 수 있고, 누출된 효소는 회수되지 못하고 버려지거나, 외부 환경에 의해 효소 구조가 변성될 수 있기 때문에, 결과적으로는 고정화된 효소의 활성 감소로 이어질 수 있다.
이를 해결하기 위해서 효소를 다공성 물질 내부에 공유결합시켜서 효소의 누출을 방지하는 기술이 연구되었다. 물리화학적 방법을 통해 다공성 물질을 기능화(functionalization)한 뒤에, 가교결합제를 이용하여 다공성 물질의 기능기와 효소 곁사슬(side chain)의 기능기 사이에 가교결합을 형성시킴으로써, 다공성 물질 내부에 담지된 효소가 누출되는 것을 방지하는 기술이다.
그러나 공유결합 기술을 적용하기 위해서는 다공성 물질 합성 과정에서 추가적인 기능화 과정을 도입해야 하는 단점이 있다. 또한 다공성 물질의 기공내 표면에 위치한 작용기와 효소 표면의 작용기 사이에 둘 이상의 공유결합이 유도되면, 효소의 구조적 변성을 통한 효소의 비활성화가 발생할 수 있다.
한편 공유결합 기술이 응용되어 효소의 누출을 방지하기 위해 나노효소반응기(nanoscale enzyme reactor) 기술이 연구되었다. 나노효소반응기 기술은 다공성 물질 내부에 효소를 담지시키고, 담지된 효소들이 누출되기 전 효소 간에 가교결합을 형성시켜서 다공성 물질의 포어 입구 직경보다 가교된 효소들의 크기를 증가시킴으로써, 다공성 물질 내부에 담지된 효소가 누출되는 것을 방지하는 기술이다.
그러나 종래의 나노효소반응기 기술로는 가교결합제에 의해 효소 표면에 둘 이상의 가교결합이 유도될 수 있는데, 이때, 포름산 탈수소효소, 포름알데히드 탈수소효소, 알코올탈수소효소 등과 같이 효소가 쉽게 변성이 되어 활성을 잃을 수 있는 불안정한 효소의 경우 당해 기술로 안정화시키기 어렵다.
또한, 효소를 가교결합제를 이용해 안정화시키는 경우 글루타르다이알데히드 등과 같은 가교결합제의 생체적합성이 문제될 수 있고, 이로 인해 의료분야에는 활용하기 어려운 문제가 있다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 효소 활성의 저하를 최소화하면서 효소를 다공성 물질 내에 고정화시키되, 다공성 물질 내에 고정화된 효소의 누출이 방지되고, 다공성 물질 내에 고정화된 효소의 안정성을 확보한 효소-다공성 탄소복합체를 제공하는 데에 목적이 있다.
[이 발명을 지원한 대한민국 국가연구개발사업]
- 과제고유번호: 20182010600430
- 부처명: 산업통상자원부
- 연구관리 전문기관: 에너지기술평가원
- 연구사업명: 에너지기술개발사업
- 연구과제명: 고집적·고안정성 효소 시스템을 기반으로 한 CO2 전환 공정기술 개발
- 주관기관: 고려대학교
-연구기간: 2019.04.01 ~ 2019.12.31
상술한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 다공성 탄소 담체 및 상기 다공성 탄소 담체의 공극 내부에 담지된 효소를 포함하는 효소-다공성 탄소 복합체를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 효소는 적어도 일부가 다공성 탄소 담체의 공극 내부에 흡착되어 담지된 것일 수 있다.
또한, 상기 다공성 탄소 담체는 메조포러스 탄소 및/또는 마이크로포러스 탄소일 수 있고, 일예로 공극 크기는 1 ~ 5000 nm일 수 있다.
또한, 상기 효소는 트립신, 키모트립신, 펩신, 리파아제, 당산화효소, 양고추냉이 과산화효소, 티록시네이즈, 탄산무수화효소, 포름알데히드 탈수소효소, 포름산 탈수소효소, 알콜 탈수소효소, 콜레스테롤 탈수소효소, 아실레이즈, 락토네이즈, 프로테이즈, 퍼옥시데이트, 아미노펩티데이즈, 포스파테이즈, 트렌스아미네이즈, 세린-엔도펩티데이즈, 시스테인-엔도펩티데이즈 및 메탈로엔도펩티데이즈로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 효소를 포함할 수 있다.
또한, 상기 다공성 탄소 담체는 상기 효소와의 소수성 상호작용 및 친수성 상호작용 중 어느 하나 이상을 유도하기 위하여 공극 표면에 제1작용기를 더 구비할 수 있다.
또한, 상기 제1작용기는 알킬기, 페닐기, 벤질기, 비닐기 및 할로기 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 소수성 상호작용을 유도하는 작용기 및 하이드록시기, 카보닐기, 할라이드기, 카복실기, 메톡시기, 하이드로퍼옥시기, 아민기, 이민기, 이미드기, 나이트릴기, 나이트로기, 싸이올기, 설피노기 및 인산기 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 친수성 상호작용을 유도하는 작용기 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
또한, 상기 효소는 상기 다공성 탄소 담체의 공극 표면과 소수성 상호작용 및 친수성 상호작용 중 어느 하나 이상을 유도하기 위한 제2작용기를 더 구비할 수 있다.
또한, 상기 제2작용기는 알킬기, 페닐기, 벤질기, 비닐기 및 할로기 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 소수성 상호작용을 유도하는 작용기 및 하이드록시기, 카보닐기, 할라이드기, 카복실기, 메톡시기, 하이드로퍼옥시기, 아민기, 이민기, 이미드기, 나이트릴기, 나이트로기, 싸이올기, 설피노기 및 인산기 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 친수성 상호작용을 유도하는 작용기 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
또한, 상기 효소-다공성 탄소 복합체는 완충용액에 혼합된 상태로 12일 간 교반 후 다공성 탄소 복합체에 담지된 효소의 유출량이 교반 전에 대비해서 33% 미만일 수 있다.
또한, 상기 효소-다공성 탄소 복합체는 완충용액에 혼합된 상태로 12일 간 교반 후 효소-다공성 탄소 복합체의 효소 활성이 교반 전에 대비해서 16% 이상일 수 있다.
또한, 상기 효소-다공성 탄소 복합체는 완충용액에 혼합된 상태로 45일 간 교반 후 효소-다공성 탄소 복합체의 효소활성이 교반 전에 대비해서 72% 이상일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 효소-다공성 탄소 복합체를 포함하는 바이오 연료전지 또는 바이오센서용 전극을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 효소-다공성 탄소 복합체를 포함하는 이산화탄소 전환 시스템을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 효소-다공성 탄소 복합체를 포함하는 안티파울링(antifouling) 시스템을 제공한다.
본 발명에 의한 효소-다공성 탄소 복합체는 효소 활성부위의 변성 없이, 다공성 탄소 내부에 효소를 고정화시키고 안정화하는데 적합하게 사용할 수 있다. 또한, 종래의 효소 안정화 기술에 응용되던 가교결합제와 같은 생체 적합성이 문제되는 성분을 사용하지 않고 효소를 고정화, 안정화함에 따라서 사용이 제한되던 의료분야에도 사용이 확대될 수 있다. 더불어 효소-다공성 탄소 복합체를 포도당을 기반으로 하는 바이오 연료전지 및 혈당 측정을 목적으로 하는 바이오센서의 전극 제작을 목적으로 당산화효소 등의 관련 효소를 고정화에 활용할 경우, 매우 높은 안정화 효과를 달성할 수 있다. 또한, 이산화탄소를 중탄산염으로 전환할 수 있는 탄산무수화효소 및 중탄산염으로부터 포름산 전환이 가능한 포름산 탈수소효소 등의 관련 효소를 고정화에 활용될 경우, 종래의 다공성 물질을 이용한 고정화 방식에 비해 효소의 활성을 장시간 안정적으로 유지하는 것이 가능하여 이산화탄소 전환 및 활용 시스템의 촉매 소재로 활용할 수 있다. 또한, 정족수 감지(quorum sensing) 역할을 수행하는 신호 분자(signaling molecule)를 분해하여 생물막(biofilm) 형성을 억제할 수 있는 아실레이즈 등의 관련 효소를 고정화에 활용될 경우, 종래의 다공성 물질을 이용한 고정화 방식에 비해 효소의 활성을 안정적으로 유지하는 것이 가능하여, 멤브레인 표면의 바이오필름 형성을 억제하기 위한 목적으로 안티파울링(antifouling) 시스템 내의 촉매 소재로 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 효소-다공성 탄소 복합체의 제조과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 포름산 탈수소효소-다공성 탄소 복합체에서 다공성 탄소 단위 무게당 효소의 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3a 내지 도 3c는 각각 본 발명의 일 실시예에 따른 당산화효소-다공성 탄소 복합체, 탄산무수화효소-다공성 탄소 복합체 및 아실레이즈-다공성 탄소 복합체에서 다공성 탄소 단위 무게당 효소의 활성을 나타낸 그래프이다.
도4는 본 발명의 일 실시예에 따른 포름산 탈수소효소-다공성 탄소 복합체의 시간에 따른 효소 활성의 안정성을 측정한 그래프이다.
도 5a 내지 도 5c는 본 발명의 일 실시예에 따른 당산화효소-다공성 탄소 복합체, 탄산무수화효소-다공성 탄소 복합체 및 아실레이즈-다공성 탄소 복합체의 시간에 따른 효소 활성의 안정성을 측정한 그래프이다.
도 6a 내지 도 6c는 본 발명의 일실시예에 따른 당산화효소-다공성 탄소 복합체, 탄산무수화효소-다공성 탄소 복합체 및 아실레이즈-다공성 탄소 복합체에서 다공성 탄소 단위 무게당 효소의 초기 담지량을 나타낸 그래프이다.
도7a 내지 도 7c는 본 발명의 일실시예에 따른 당산화효소-다공성 탄소 복합체, 탄산무수화효소-다공성 탄소 복합체 및 아실레이즈-다공성 탄소 복합체에서 보관된 시간에 따른 다공성 탄소 단위 무게 당 효소의 담지량의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 포름산 탈수소효소-다공성 탄소 복합체와, 가교결합된 포름산 탈수소효소가 다공성 탄소 내에 고정화된 복합체의 활성을 비교한 그래프이다.
도 9a 및 9b는 본 발명의 일실시예에 따른 작용기 처리된 당산화효소-다공성 탄소 복합체 및 아실레이즈-다공성 탄소 복합체에서 다공성 탄소 단위 무게당 효소의 초기 담지량을 나타낸 그래프이다.
도10a 및 도 10b는 본 발명의 일실시예에 따른 작용기 처리된 당산화효소-다공성 탄소 복합체 및 아실레이즈-다공성 탄소 복합체에서 보관된 시간에 따른 다공성 탄소 단위 무게 당 효소의 담지량의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 11a 및 도 11b는 본 발명의 일실시예에 따른 당산화효소-다공성 탄소 복합체, 아실레이즈-다공성 탄소 복합체, 작용기 처리된 당산화효소-다공성 탄소 복합체 및 작용기 처리된 아실레이즈-다공성 탄소 복합체와, 다공성 담체를 다공성 실리카로 변경하여 구현된 복합체에서 다공성 담체 단위 무게당 효소의 초기 담지량을 나타낸 그래프이다.
이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세하게 설명한다. 다만, 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
도 1을 참조하여 설명하면 본 발명의 일 실시예에 의한 효소-다공성 탄소 복합체는 효소와 다공성 탄소 담체를 포함하여 구현되며, 구체적으로 상기 다공성 탄소 담체 내부에 구비된 공극에 효소가 담지되어 구비된다. 이때, 상기 효소는 다공성 탄소 담체 공극 표면 및 효소와 효소 간에 공유결합 없이 공극에 담지될 수 있다. 일예로 상기 효소는 다공성 탄소 담체의 공극에 흡착 상태로 구비될 수 있다. 이때, 상기 흡착 상태의 효소 중 적어도 일부는 다공성 탄소 담체의 공극 표면에 흡착될 수 있다. 또한, 상기 효소는 어느 일 효소와 인접한 다른 효소 간에도 흡착 상태로 공극에 구비될 수 있다. 이 경우 효소 간 공유결합 없이 효소들이 응집체를 형성함에 따라서 공극의 입구 직경보다 상대적으로 물리적 크기가 커질 수 있는데, 이를 통해서도 효소가 공극에서 누출되는 것이 최소화 또는 방지될 수 있다.
한편, 다공성 물질의 공극 내부에 효소가 담지된다고 하여 위와 같은 다공성 물질 공극 표면과 효소간 흡착이나 효소 간 흡착을 통해서 효소의 누출을 방지할 수 있는 것은 아니다. 또한, 다공성 물질의 종류에 관계없이 공극의 부피에 대응할 양만큼 효소를 다공성 물질의 공극 내부로 도입할 수 있는 것도 아니다.
본 발명의 발명자는 효소를 다공성 물질 내부 공극에 수용하기 위해서 종래에 많이 사용되던 다공성 실리카 대신에 다공성 탄소 물질을 담체로 이용할 때 효소를 공극 내부에 많은 양으로 담지시킬 수 있고, 담지된 효소의 활성을 안정적으로 장기간 유지할 수 있음을 발견하여 본 발명에 이르게 되었다. 이러한 효과는 다공성 물질 내 담지된 효소의 누출을 방지하기 위해서 가교결합제를 사용하거나, 공유결합을 위한 작용기를 구비시킬 수밖에 없었던 종래의 효소 고정화, 안정화 방법에서는 예상할 수 없었던 획기적인 것으로 평가할 수 있다.
즉, 도 2를 통해 확인할 수 있듯이 다공성 물질로 실리카를 사용한 비교예 1의 경우 포름산 탈수소효소(formate dehydrogenase, FDH)를 담지시키는 처리를 했음에도 불구하고, FDH 효소활성이 측정되지 않은 반면에 다공성 물질로 다공성 탄소를 사용한 실시예 1의 경우 동일한 효소를 동일한 방법으로 처리했음에도 현저히 우수한 효소활성이 감지된 것을 확인할 수 있다. 이러한 기술적 특징은 도 3a 내지 도 3c에 도시된 것과 같이 효소의 종류를 당산화효소(glucose oxidase, GOx), 탄산무수화효소(carbonic anhydrase, bCA) 및 아실레이즈(acylase, AC)로 변경한 실험에서와 마찬가지로 확인되었으며, 다공성 실리카(비교예 2 내지 4)에서 효소활성이 측정되긴 했으나 그 정도가 다공성 탄소(실시예 2 내지 4)에서 보다 현격하게 작은 것을 알 수 있다.
또한 도 4을 통해 확인할 수 있듯이, 활성이 측정되지 않은 비교예 1을 대신하여 유리된 효소를 용액 내에 준비한 비교예 7은 효소 활성이 1일 이전에 초기 활성 대비 40% 미만으로 급격히 낮아진 뒤 2 ~ 3일 내 효소활성을 거의 상실했다. 그러나 다공성 탄소 내 공극에 담지 된 효소의 경우 초기 활성 대비 80%에 가까운 수준을 유지하면서 45일 이상 지속되고 있는 것을 확인할 있다. 이러한 기술적 특징은 도 5a 내지 도 5c에 도시된 것과 같이 효소의 종류를 당산화효소, 탄산무수화효소 및 아실레이즈로 변경한 실험에서와 마찬가지로 확인되었다. 결국 본 발명의 일 실시예에 의한 효소-다공성 탄소복합체는 다공성 탄소 내 효소가 어떠한 공유결합 없이도 누출이 방지되면서 안정적으로 효소활성을 장기간 발현할 수 있다.
더불어 도 6a 내지 도 6c를 참고하여 설명하면, 다공성 담체로 실리카를 사용한 비교예 2 내지 4에 비해 다공성담체로 탄소를 사용한 실시예 2 내지 4에서 당산화효소, 탄산무수화효소 및 아실레이즈의 담지량(enzyme loading)이 현저히 높아진 것을 관찰하였다. 또한 도 7a 내지 도 7c에 도시된 것과 같이, 1일이 경과된 이후부터는 다공성 탄소에 담지된 효소들이 거의 누출되지 않고 지속적으로 남아있는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 다공성 탄소 담체는 다른 재질의 다공성 물질과 대비했을 때 효소를 쉽게 공극 내부로 도입할 수 있고, 실리카 담체에 비해 더 높은 담지량을 제공할 수 있으며, 도입 후 지속적인 교반 반응에도 효소의 누출을 방지할 수 있어서 효소를 안정적으로 담지할 수 있는 이점이 있다. 상기 다공성 탄소 담체는 내부에 다수 개의 공극을 갖는 탄소물질의 경우 제한없이 사용될 수 있고, 바람직하게는 효소와 상호작용을 할 수 있는 탄소 물질의 경우 제한없이 사용될 수 있다. 일 예로 상기 다공성 탄소는 공극 크기가 1 ~ 5,000㎚, 다른 일예로 1 ~ 1,000㎚, 또 다른 일예로 1 ~ 500㎚구현된 다공성탄소일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 상기 다공성 탄소 담체는 형상에 있어서 제한되는 것은 아니나, 일예로 구형, 타원형 및 비정형의 입자 형태이거나, 표면에 필름 형태로 구현된 것일 수 있다. 또한, 입자 형태의 다공성 탄소 담체는 크기가 100㎚ ~ 1,000㎛ 일 수 있으며, 여기서 담체 크기는 형상이 구형일 경우 직경, 비정형 일 경우 표면의 서로 다른 두 지점 간 거리 중 최대거리를 의미한다.
또한, 다공성 탄소 담체의 표면적은 100 ~ 5000 m²/g 일 수 있고, 공극 부피는 0.1 ~ 10 cm³/g 일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 다공성 탄소 담체는 담지 되는 효소의 누출을 방지하고 장기간 안정적으로 효소활성을 발현시키기 위하여 효소와 상호작용을 유도할 수 있는 제1작용기를 더 구비할 수 있고, 구체적으로 상기 작용기는 적어도 다공성 탄소 담체 내 공극의 표면에 구비될 수 있다. 상기 상호작용은 비공유 상호작용이며, 일 예로 상기 상호작용은 소수성 상호작용 또는 친수성 상호작용일 수 있다. 상기 친수성 상호작용은 일예로 수소결합, 이온결합일 수 있다. 이러한 상호작용은 공유결합에 대비해 효소의 입체구조에 미치는 영향이 최소화 또는 방지됨에 따라서 종래 공유결합을 통해 지지체에 효소를 고정화시키거나 공유결합을 통해 효소와 효소의 가교결합 시킬 때 발생하는 강한 결합력에 따른 효소의 입체구조 변형의 문제와 이로 인한 효소활성의 저하 또는 상실의 문제를 방지하거나 최소화할 수 있는 이점이 있다. 이때, 다공성 탄소 담체에 구비되는 제1작용기는 친수성 상호작용을 유도할 수 있는 작용기 보다는 소수성 상호작용을 유도하는 작용기가 효소의 공극 내 도입 및 누출을 방지하고 안정적으로 장시간 고정화시키는데 보다 유리할 수 있다. 다만, 이는 도입되는 효소의 특성에 따라서 오히려 친수성 상호작용이 유리한 경우도 있을 수 있음을 밝혀둔다.
상기 제1작용기는 소수성 상호작용이나, 친수성 상호작용을 유도할 수 있는 작용기의 경우 제한 없이 채용될 수 있는데, 일예로, 상기 제1작용기는 알킬기, 페닐기, 벤질기, 비닐기 및 할로기 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 소수성 상호작용을 유도하는 작용기 및 하이드록시기, 카보닐기, 할라이드기, 카복실기, 메톡시기, 하이드로퍼옥시기, 아민기, 이민기, 이미드기, 나이트릴기, 나이트로기, 싸이올기, 설피노기 및 인산기 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 친수성 상호작용을 유도하는 작용기 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
또한, 상기 제1작용기는 다공성 탄소 공극 표면에 공지된 발명을 통해 도입할 수 있으며, 본 발명은 이에 대해 특별히 한정하지 않는다.
다음으로 상술한 다공성 탄소 담체 내 공극에 담지 되는 효소는 공지된 효소의 경우 제한 없이 사용될 수 있다. 상기 효소는 바람직하게는 트립신, 키모트립신, 펩신, 리파아제, 당산화효소, 양고추냉이 과산화효소, 티록시네이즈, 탄산무수화효소, 포름알데히드 탈수소효소, 포름산 탈수소효소, 알콜 탈수소효소, 콜레스테롤 탈수소효소 아실레이즈, 락토네이즈, 프로테이즈, 퍼옥시데이트, 아미노펩티데이즈, 포스파테이즈, 트렌스아미네이즈, 세린-엔도펩티데이즈, 시스테인-엔도펩티데이즈, 메탈로엔도펩티데이즈 등으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 특히, 입체구조의 안정성이 다소 좋지 않아서 공유결합 또는 가교결합을 통한 고정화 시 효소활성이 저하될 수 있는 포름산 탈수소효소, 포름알데히드 탈수소효소, 알코올 탈수소효소 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 효소는 본 발명에 따라서 다공성 탄소 담체 내 담지 시 효소활성을 안정적으로 발현할 수 있는 이점이 있다. 도 8을 참조하여 설명하면, 다공성 담체 내에 흡착된 포름산 탈수소효소가 포함된 실시예 1과 달리, 다공성 담체 내에서 가교결합제에 의해 가교결합된 포름산 탈수소효소가 용액 내에 포함된 비교예 8 내지 9는 가교결합제 농도가 높아짐에 따라 효소활성이 극적으로 저하되는 것을 확인할 수 있다. 결국 본 발명의 일 실시예에 의한 효소-다공성 탄소복합체는 다공성 탄소 담체 내 담지 시 효소활성을 안정적으로 발현할 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 효소는 다공성 탄소 담체 및/또는 상기 담체의 공극에 담지 되는 효소 간에 상호작용 증진시키기 위하여 비공유 상호작용, 구체적으로는 소수성 상호작용 및 친수성 상호작용 중 어느 하나 이상을 유도하기 위한 제2작용기를 더 구비할 수 있다. 상기 제2작용기는 효소의 입체구조에 영향을 최소화하면서도 다공성 탄소 공극에서 누출을 방지하고, 안정적으로 효소활성을 발현되도록 기능할 수 있다. 상기 제2작용기는 소수성 상호작용이나, 친수성 상호작용을 유도할 수 있는 작용기의 경우 제한 없이 채용될 수 있는데, 일예로, 상기 제2작용기는 알킬기, 페닐기, 벤질기, 비닐기 및 할로기 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 소수성 상호작용을 유도하는 작용기 및 하이드록시기, 카보닐기, 할라이드기, 카복실기, 메톡시기, 하이드로퍼옥시기, 아민기, 이민기, 이미드기, 나이트릴기, 나이트로기, 싸이올기, 설피노기 및 인산기 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 친수성 상호작용을 유도하는 작용기 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
효소에 도입되는 제2작용기를 통한 상호작용에 따른 담지량, 효소 안정화를 도 9a 내지 도 11b를 참고하여 설명하면, 아크릴로일 클로라이드를 사용하여 표면에 비닐기를 추가한 당산화효소 및 동일하게 표면에 비닐기를 추가한 아실레이즈는 효소에 제2작용기를 구비시키지 않고 다공성 탄소 담체와 복합체를 형성한 경우에 대비해 담지량이 현저히 향상된 것을 확인할 수 있다. 한편, 다공성 담체로 다공성 실리카를 사용하는 경우에는 효소에 상호작용을 할 수 있는 제2작용기를 구비시켰음에도 불구하고 효소의 담지량이 제2작용기 없는 효소를 다공성 탄소 담체에 담지시킨 경우 대비해 현저히 낮은 것을 확인할 수 있다.
담지 후 효소의 누출량과 관련하여 도 10을 참고하여 설명하면, 1일이 경과된 이후부터는 다공성 탄소에 담지된 효소들이 거의 누출되지 않고 지속적으로 남아있는 것을 확인할 수 있었다.
결국, 다공성 탄소 담체는 다른 재질의 다공성 물질과 대비했을 때 효소를 쉽게 공극 내부로 도입할 수 있고, 실리카 담체에 비해 더 높은 담지량을 제공할 수 있으며, 도입 후 지속적인 교반 반응에도 효소의 누출을 방지할 수 있어서 효소를 안정적으로 담지할 수 있는 이점이 있다. 나아가 이러한 다공성 탄소 담체를 활용해 다공성 탄소 담체 및/또는 효소에 비공유 상호작용을 유도할 수 있는 작용기를 추가로 도입할 경우 효소와 다공성 물질 간의 상호작용을 증진시킴으로써, 다공성 물질 내에 더 높은 담지량과, 더욱 상승된 효소 고정화, 안정화 효과를 발현할 수 있는 이점이 있다.
또한, 상기 효소는 상술한 다공성 탄소 담체와의 상호작용을 향상시킬 목적으로 효소를 구성하는 아미노산이 추가/제거 또는 변경을 목적으로 유전자 재조합 된 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 구체적으로 설명한다. 다만 본 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> - 포름산 탈수소효소가 고정화된 효소-다공성 탄소 복합체 제조 (FDH-Carbon)
인산 완충액 (100 mM pH 7.0)에 준비한 포름산 탈수소효소 (formate dehydrogenase, FDH) 용액 (5 mg/mL)과 다공성 탄소 (mesoporous carbon) 파우더 2 mg을 2 mL 부피로 혼합한 후, 30분 200 rpm으로 교반하였다. 이 과정을 통해 포름산 탈수소효소는 다공성 탄소 내 공극에 담지된 효소-다공성 탄소 복합체를 제조하였다. 이후 다공성 탄소에 미담지된 포름산 탈수소효소를 제거하고 인산완충액으로 3번 세척 후 4℃에 보관하였다.
이때, 상기 다공성 탄소는 공극 크기가 26㎚, 윈도우 크기가 17㎚, 공극부피가 1.53㎤/g인 것을 사용했다.
<비교예 1> - 포름산 탈수소효소가 고정화된 효소-다공성 실리카 복합체 제조 (FDH-Silica)
인산 완충액 (100 mM pH 7.0)에 준비한 포름산 탈수소효소 용액 (5 mg/mL)과 다공성 실리카 (mesoporous silica) 파우더 2 mg을 2 mL 부피로 혼합한 후, 30분 200 rpm으로 교반하였다. 이 과정을 통해 포름산 탈수소효소는 다공성 실리카 내 공극에 담지 되게 된다. 다공성 실리카에 미담지된 포름산 탈수소효소를 제거하고 인산완충액으로 3번 세척 후 4℃에 보관하였다.
이때, 상기 다공성 실리카는 공극 크기가 25㎚, 윈도우 크기가 18㎚, 공극부피가 1.90㎤/g인 것을 사용했다.
<실시예 2> - 당산화효소가 고정화된 효소-다공성 탄소 복합체 제조 (GOx-Carbon)
실시예1과 동일하게 실시하여 제조하되, 효소를 당산화효소 (glucose oxidase, GOx)로 변경하여 효소-다공성 탄소 복합체를 제조하였다.
<비교예 2> - 당산화효소가 고정화된 효소-다공성 실리카 복합체 제조 (GOx-Silica)
비교예1과 동일하게 실시하여 제조하되, 효소의 종류를 당산화효소로 변경하여 효소-다공성 실리카 복합체를 제조하였다.
<실시예 3> - 탄산무수화효소가 고정화된 효소-다공성 탄소 복합체 제조 (CA-Carbon)
실시예1과 동일하게 실시하여 제조하되, 인산 완충액(100 mM pH 7.6)에 탄산무수화효소 (bovine carbonic anhydrase, bCA)를 이용하여 효소-다공성 탄소 복합체를 제조하였다.
<비교예 3> - 탄산무수화효소가 고정화된 효소-다공성 실리카 복합체 제조 (GOx-Carbon)
비교예1과 동일하게 실시하여 제조하되, 인산 완충액 (100 mM pH 7.6)에 탄산무수화효소로 변경하여 효소-다공성 실리카 복합체를 제조하였다.
<실시예 4> - 아실레이즈가 고정화된 효소-다공성 탄소 복합체 제조 (AC-Carbon)
실시예1과 동일하게 실시하여 제조하되, 효소를 아실레이즈 (acylase, AC)로 변경하여 효소-다공성 탄소 복합체를 제조하였다.
<비교예 4> - 아실레이즈가 고정화된 효소-다공성 실리카 복합체 제조 (AC-Silica)
비교예1과 동일하게 실시하여 제조하되, 효소를 아실레이즈 (acylase, AC)로 변경하여 효소-다공성 실리카 복합체를 제조하였다.
<실시예 5> - 비닐기가 도입된 당산화효소를 고정화한 효소-다공성 탄소 복합체 제조 (fGOx-Carbon)
실시예1과 동일하게 실시하여 제조하되, 효소를 비닐기가 도입된 당산화효소로 변경하여 효소-다공성 탄소 복합체를 제조하였다. 이때, 당산화효소가 포함된 인산 완충용액에 아크릴로일 클로라이드(acryloyl chloride)를 처리하여 효소 표면에 비닐기를 도입하였다.
<비교예 5> - 비닐기가 도입된 당산화효소를 고정화한 효소-다공성 실리카 복합체 제조 (fGOx-Silica)
실시예5와 동일하게 실시하여 제조하되, 담체를 다공성 실리카로 변경하여 효소-다공성 실리카 복합체를 제조하였다.
<실시예 6> - 비닐기가 도입된 당산화효소를 고정화한 효소-다공성 탄소 복합체 제조 (fAC-Carbon)
실시예1과 동일하게 실시하여 제조하되, 효소를 비닐기가 도입된 아실레이즈로 변경하여 효소-다공성 탄소 복합체를 제조하였다. 이때, 아실레이즈가 포함된 인산 완충용액에 아크릴로일 클로라이드(acryloyl chloride)를 처리하여 효소 표면에 비닐기를 도입하였다.
<비교예 6> - 비닐기가 도입된 당산화효소를 고정화한 효소-다공성 실리카 복합체 제조 (fAC-Silica)
실시예6과 동일하게 실시하여 제조하되, 담체를 다공성 실리카로 변경하여 효소-다공성 실리카 복합체를 제조하였다.
<비교예 7> - 유리된 포름산 탈수소효소 (Free FDH)
인산 완충액 (100 mM pH 7.0)에 포름산 탈수소효소 (formate dehydrogenase, FDH) 용액 (5 mg/mL)을 준비하였다.
<비교예 8> - 다공성 물질 내에 가교결합제(0.01% w/v)에 의해 가교결합된 포름산 탈수소효소가 담지된 복합체 제조 (FDH-GA_0.01)
실시예1과 동일하게 실시하여 제조하되, 효소 첨가 후 가교결합제로 글루타르다이알데히드를 첨가하여 가교결합된 당산화효소가 담지된 복합체를 제조하였다. 이때, 0.01% w/v의 농도로 글루타르다이알데히드를 첨가하였다.
<비교예 9> - 다공성 물질 내에 가교결합제(0.1% w/v)에 의해 가교결합된 포름산 탈수소효소가 담지된 복합체 제조 (FDH-GA_0.1)
실시예1과 동일하게 실시하여 제조하되, 효소 첨가 후 가교결합제로 글루타르다이알데히드를 첨가하여 가교결합된 아실레이즈가 담지된 복합체를 제조하였다. 이때, 0.1% w/v의 농도로 글루타르다이알데히드를 첨가하였다.
<실험예 1> 당산화효소와 다공성 탄소를 이용한 효소-다공성 탄소 복합체의 효소 담지량 및 방출량 측정
효소 담지량은 고정화를 위해 투입한 초기 효소의 양 및 세척 과정에서 방출되는 효소의 양들을 단백질 분석법을 통해 정량하고, 초기 효소의 양과 세척 과정에서 방출된 효소 양의 차이를 계산하여 결정하였다.
효소 방출량은 인산 완충액상에 샘플을 분산시킨 후, 200 rpm 교반을 계속하면서 시간에 따라 방출된 효소의 양을 단백질 분석법을 통해 지속적으로 정량하고, 이를 누적한 값인 효소 방출량을 계산하였다. 이때, 효소 담지 이후 3번의 세척과정까지 포함하여 시간에 따른 효소의 방출량을 계산하였으며, 그 결과를 도 6a, 도 7a, 도 9a, 도 10a 및 도 11a에 나타내었다 구체적으로는 당산화효소와 다공성 탄소를 이용한 효소-다공성 탄소 복합체인 실시예 2 및 당산화효소와 다공성 실리카를 이용한 효소-다공성 실리카 복합체인 비교예 2의 효소 방출량을 대비하였다. 도 7a를 통해 확인할 수 있듯이, 비교예 2은 4일 이내에 담지된 당산화효소가 모두 방출된 반면, 실시예 2는 12일 경과했을 때, 초기 담지량 대비 65% 이상의 당산화효소가 남아 있었다.
<실험예 2> 탄산무수화효소와 다공성 탄소를 이용한 효소-다공성 탄소 복합체의 효소 담지량 및 방출량 측정
탄산무수화효소가 고정화 된 효소-다공성 탄소 복합체와 탄산무수화효소가 고정화 된 효소-다공성 실리카 복합체를 이용하여 실험예 1과 동일한 방식으로 진행하였고 그 결과를 도 6b 및 도 7b에 나타내었다. 도 7b를 통해 확인할 수 있듯이, 비교예 3은 1일 이내에 담지 된 탄산무수화효소가 모두 방출된 반면, 실시예 3는 10일 경과했을 때, 초기 담지량 대비 74% 이상의 탄산무수화효소가 남아 있었다.
<실험예 3> 아실레이즈와 다공성 탄소를 이용한 효소-다공성 탄소 복합체의 효소 담지량 및 방출량 측정
아실레이즈가 고정화 된 효소-다공성 탄소 복합체와 아실레이즈가 흡착으로 고정화 된 효소-다공성 실리카 복합체를 이용하여 실험예 1과 동일한 방식으로 진행하였고, 그 결과를 도 6c, 도 7c, 도 9b, 도 10b 및 도 11b에 나타내었다. 도 7c를 통해 확인할 수 있듯이, 비교예 4은 2일 이내에 담지 된 아실레이즈가 모두 방출된 반면, 실시예 4는 10일 경과했을 때, 초기 담지량 대비 86% 이상의 아실레이즈가 남아 있었다.
<실험예 4> 포름산 탈수소효소-다공성 탄소 복합체의 효소 활성 및 안정성 평가
포름산 탈수소효소-다공성 탄소 복합체의 초기 활성은 자외-가시선 분광광도계를 이용하여 측정하였다. 보다 자세하게는, 혼합 용액 (200 mM 포름산 나트륨(sodium formate), 2 mM NAD+ 및 100 mM 인산나트륨 완충액)에 포름산 탈수소효소-다공성 탄소 복합체를 첨가하고, NADH의 양을 측정할 수 있는 340 nm에서 시간에 따른 흡광도를 측정하고, 활성을 계산하였다.
포름산 탈수소효소-다공성 탄소 복합체의 효소 안정성은 시간에 따라 효소 활성을 지속적으로 측정하면서 평가하여 그 결과를 도 2, 도 4 및 도 8에 나타내었다. 이때, 효소-다공성 탄소 복합체가 포함된 용액은 상온에서 200 rpm의 교반 상태에서 보관되었다.
<실험예 5> 당산화효소-다공성 탄소 복합체의 효소 활성 및 안정성 평가
당산화효소-다공성 탄소 복합체의 효소 활성은 자외-가시선 분광광도계를 이용하여 측정하였다. 보다 자세하게는, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine(TMB), 포도당, 고추냉이과산화효소 (horseradish peroxidase)를 혼합한 혼합 용액에 당산화효소-다공성 탄소 복합체를 첨가하고, 655 nm에서 시간에 따른 흡광도를 측정하고, 활성을 계산하였다.
당산화효소-다공성 탄소 복합체의 효소 안정성은 시간에 따라 효소 활성을 지속적으로 측정하면서 평가하였고, 그 결과를 도 3a 및 도 5a에 나타내었다. 이때, 효소-다공성 탄소 복합체가 포함된 용액은 상온에서 200 rpm의 교반 상태에서 보관되었다.
<실험예 6> 탄산무수화효소-다공성 탄소 복합체의 효소 활성 및 안정성 평가
탄산무수화효소-다공성 탄소 복합체의 초기 활성은 자외-가시선 분광광도계를 이용하여 측정하였다. 보다 자세하게는, 60 mM 4-나이트로페닐 아세테이트(4-nitrophenyl acetate, 4-NA)를 아세토니트릴(acetonitrile)에 용해한 혼합 용액에 탄산무수화효소-다공성 탄소 복합체를 첨가하고, 348 nm에서 시간에 따른 흡광도 변화를 측정하였다.
탄산무수화효소-다공성 탄소 복합체의 효소 안정성은 시간에 따라 효소 활성을 지속적으로 측정하면서 평가하였고, 그 결과를 도3b 및 도5b에 나타내었다. 이때, 효소-다공성 탄소 복합체가 포함된 용액은 상온에서 200 rpm의 교반 상태에서 보관되었다.
<실험예 7> 아실레이즈-다공성 탄소 복합체의 효소 활성 및 안정성 평가
아실레이즈-다공성 탄소 복합체의 효소 활성은 형광 분광광도계를 이용하여 측정하였다. 보다 자세하게는, N-아세틸-L-메티오닌의 가수분해로 생성되는 L-메티오닌이 o-프탈알데히드(OPA)와 반응하여 나타나는 형광을 이용하여 변화량을 측정하였다.
아실레이즈-다공성 탄소 복합체의 효소 안정성은 시간에 따라 효소 활성을 지속적으로 측정하면서 평가하였고, 그 결과를 도 3c, 도 5c에 나타내었다. 이때, 효소-다공성 탄소 복합체가 포함된 용액은 상온에서 200 rpm의 교반 상태에서 보관되었다.
이상에서 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 본 발명의 사상은 본 명세서에 제시되는 실시 예에 제한되지 아니하며, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서, 구성요소의 부가, 변경, 삭제, 추가 등에 의해서 다른 실시 예를 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본 발명의 사상범위 내에 든다고 할 것이다.

Claims (16)

  1. 다공성 탄소 담체; 및 상기 다공성 탄소 담체의 공극 내부에 담지된 효소;를 포함하는 효소-다공성 탄소 복합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 효소-다공성 탄소 복합체는 완충용액 상에서 12일간 교반 후 효소의 유출량이 교반 전에 대비해 33% 미만인 것을 특징으로 하는 효소-다공성 탄소 복합체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 효소-다공성 탄소 복합체는 완충용액 상에서 12일간 교반 후 효소의 활성이 교반 전에 대비해 16% 이상인 것을 특징으로 효소-다공성 물질 복합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 효소-다공성 탄소는 완충용액 상에서 45일간 교반 후 효소의 활성이 교반 전에 대비해 72% 이상인 것을 특징으로 효소-다공성 물질 복합체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 다공성 탄소 담체는 상기 효소와의 소수성 상호작용을 유도하기 위하여 공극 표면에 제1작용기를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 효소-다공성 탄소 복합체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 다공성 탄소 담체는 상기 효소와의 친수성 상호작용을 유도하기 위하여 공극 표면에 제1작용기를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 효소-다공성 탄소 복합체.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 제1작용기는 알킬기, 페닐기, 벤질기, 비닐기 및 할로기로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 소수성 상호작용을 유도하는 작용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 효소-다공성 탄소 복합체.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 제1작용기는 하이드록시기, 카보닐기, 할라이드기, 카복실기, 메톡시기, 하이드로퍼옥시기, 아민기, 이민기, 이미드기, 나이트릴기, 나이트로기, 싸이올기, 설피노기 및 인산기로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 친수성 상호작용을 유도하는 작용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 효소-다공성 탄소 복합체.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 다공성 탄소 담체의 공극 크기는 1 ~ 5000 nm 인 것을 특징으로 하는 효소-다공성 탄소 복합체.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 효소는 트립신, 키모트립신, 펩신, 리파아제, 당산화효소, 양고추냉이 과산화효소, 티록시네이즈, 탄산무수화효소, 포름알데히드 탈수소효소, 포름산 탈수소효소, 알콜 탈수소효소, 콜레스테롤 탈수소효소, 아실레이즈, 락토네이즈, 프로테이즈, 퍼옥시데이트, 아미노펩티데이즈, 포스파테이즈, 트렌스아미네이즈, 세린-엔도펩티데이즈, 시스테인-엔도펩티데이즈 및 메탈로엔도펩티데이즈로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 효소-다공성 탄소 복합체.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 효소는 상기 다공성 탄소 담체의 공극 표면과 소수성 상호작용 및 친수성 상호작용 중 어느 하나 이상을 유도하기 위한 제2작용기를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 효소-다공성 탄소 복합체.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 제2작용기는 알킬기, 페닐기, 벤질기, 비닐기 및 할로기로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 소수성 상호작용을 유도하는 작용기 및 하이드록시기, 카보닐기, 할라이드기, 카복실기, 메톡시기, 하이드로퍼옥시기, 아민기, 이민기, 이미드기, 나이트릴기, 나이트로기, 싸이올기, 설피노기 및 인산기로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 친수성 상호작용을 유도하는 작용기 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 효소-다공성 탄소 복합체.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 효소의 적어도 일부는 다공성 탄소 담체의 공극 내부에 흡착된 것을 특징으로 하는 효소-다공성 탄소 복합체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 효소-다공성 탄소 복합체를 포함하는 바이오 연료전지 및 바이오센서용 전극.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 효소-다공성 탄소 복합체를 포함하는 이산화탄소 전환 시스템.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 효소-다공성 탄소 복합체를 포함하는 안티파울링(antifouling) 시스템.
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