KR20050062989A - 효소 고정화 나노 카본볼 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세제, 바이오 센서, 바이오 촉매, 바이오 분자 분리 시스템 등에 적용될 수 있는 효소 고정화 나노 카본볼에 관한 것으로서, 구형의 중공 코어부; 직경이 0.1 내지 20nm인 다수의 기공이 형성된 다공성의 카본 쉘부; 및 상기 카본 쉘부에 고정된 효소;를 포함한다. 본 발명에 따른 효소 고정화 나노 카본볼은 쉘부에 충분한 양의 효소가 안정되게 고정되어 있으므로, 단백질 오염 제거, 기름 성분 제거, 전분 오염 제거를 위한 세제, 바이오 센서, 바이오 촉매, 바이오 분자 분리 시스템 등에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

효소 고정화 나노 카본볼{A Enzyme immobilized nano carbon ball}
본 발명은 세제, 바이오 센서, 바이오 촉매, 바이오 분자 분리 시스템 등에 적용될 수 있는 효소 고정화 나노 카본볼에 관한 것이다.
효소는 높은 촉매 활성과 기질에 대한 특이성을 가지고 있기 때문에 이를 적당한 고체 지지체에 고정화하여 물리적으로나 화학적으로 쉽게 흡-탈착 하려는 노력이 시도되고 있으며, 다양한 효소들이 고정화되어 사용되고 있다. 일반적으로 효소는 외부의 온도에 매우 민감하고 활성에 있어 큰 차이를 보이는데, 이러한 특성을 지닌 효소를 다양한 고체 지지체에 고정화 시켜서 사용하면 열적 안정성이 증가되고 활성이 높은 상태로 장기간 유지된다.
효소를 고정화시키기 위해서는 효소가 고체 지지체 내에는 효소가 고정화 될 수 있는 충분한 공간, 즉 세공이 존재해야 한다. 고체 지지체의 세공의 크기는 버퍼 이온들, 기질, 산물, 효소 등이 이동하는데 영향을 주지 않아야 하고, 동시에 고정화된 효소가 밖으로 쉽게 빠져 나오지 않도록 크기가 적당해야 한다. 대부분의 효소의 크기는 30 ~ 60A°이므로 메조포어 분자체는 효소를 고정화하는 고체 지지체로 사용하는데 매우 적합하다.
현재까지 알려진 효소를 고정화시킨 지지체는 폴리머, 졸-겔 메트릭스 등이 보고 되었다. 일반적으로 효소를 고정화 시키는 방법에는 고체 지지체의 표면에 있는 하이드록시 그룹에 효소를 물리적으로 흡착시키는 방법, 졸-겔 실리카의 내부에 인캡슐레이션 시키는 방법, 적당한 유기 그룹을 고체 지지체 표면에 붙이고 여기에 효소의 말단에 있는 유기그룹과 공유결합을 시키는 방법 등이 있다.
효소를 고체 지지체에 물리적으로 흡착시키는 원리는 정전기적인 인력을 이용한 것이다. 예를 들어, 고체 지지체로서 실리카를 사용하는 경우, 실리카의 등전점은 pH 2이고 2보다 더 큰 환경에서 실리카는 음전하를 띤다. 고정화 되는 효소는 고정화시키는 pH 조건을 효소의 등전점보다 작게 하여 효소가 양전하를 띠도록 한다. 이러한 효소와 지지체 사이의 정전기적 인력에 의해 물리적으로 흡착이 일어나고 고정화된다.
또한, 졸-겔 구조상에 효소를 고정화시키는 방법은 효소가 존재하는 상태에서 이 주위로 졸-겔의 무기 지지체 연결 구조가 형성되는 방법으로서, 효소가 캡슐안에 존재하기 때문에 효소가 엉기거나 펼쳐지는 것이 보호되고 효소의 고정화에서 가장 큰 문제인 용출 되는 현상을 줄일 수 있다는 장점이 있다. 또한 졸-겔에 의해서 형성되는 실리카 구조는 화학적으로 매우 안정하고 친수성이며 합성하는데 비용이 적게 든다. 따라서 여기에 고정화된 효소는 유기 폴리머 등에 고정화된 것과 비교하여 더 높은 기계적 강도와 열적 안정성, 세균에 대해 보호되는 장점이 있다. 이러한 졸-겔 방법에 의한 효소의 고정화는 졸-겔 구조 안에 효소가 있어서 용출 되는 현상이 거의 일어나지 않는 장점이 있으나, 대부분의 졸-겔 물질들은 넓은 세공분포도를 가지며 일부 작은 세공 크기로 인해 효소 또는 큰 분자 기질의 확산에 많은 영향을 끼치고, 효소의 크기에 세공 크기를 조절할 수 없어서 다양하게 사용할 수 없고, 졸-겔 물질이 제조 될 때 적용되는 가혹한 합성 조건과 시약으로 인하여 효소가 변성되는 현상이 발생되기 쉽다는 단점이 있다.
따라서, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 충분한 양의 효소가 안정되게 고정되어 있으므로, 단백질 오염 제거, 기름 성분 제거, 전분 오염 제거를 위한 세제, 바이오 센서, 바이오 촉매, 바이오 분자 분리 시스템 등에 유용하게 사용될 수 있는 효소 고정화 나노 카본볼을 제공하는데 있다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명은 구형의 중공 코어부; 직경이 0.1 내지 20nm인 다수의 기공이 형성된 다공성의 카본 쉘부; 및 상기 카본 쉘부에 고정된 효소;를 포함하는 효소 고정화 나노 카본볼을 제공한다.
본 발명에 따른 효소 고정화 나노 카본볼에 있어서, 쉘부에 고정되는 효소로는 프로테이즈, 라이페이즈, 아밀레이즈, 라이소자임, 트립신 등을 각각 단독으로 또는 이들을 1종 이상 혼합하여 사용할 수 있고, 효소의 농도는 나노 카본볼 1g을 기준으로 0.001 내지 10mg인 것이 바람직하다.
이하, 본 발명의 효소 고정화 나노 카본볼에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명의 효소 고정화 나노 카본볼은 구형의 중공 코어(Core) 부분과 껍질인 다공성의 카본 쉘(Shell) 부분으로 이루어지는 볼(ball) 형상의 탄소 구조체(나노 카본볼)으로서, 카본 쉘부의 내외면 및 쉘부의 기공에는 효소가 고정화되어 있다. 쉘부에 형성된 기공의 직경은 0.1 내지 20nm로서, 주된 기공의 직경은 2nm 이상이다. 중공 코어부의 지름은 10 내지 1,000nm, 쉘부의 두께는 10 내지 500nm인 것이 바람직하다. 본 발명의 효소 고정화 나노 카본볼은 내부가 비어 있는 구조이므로, 효소가 이 중공부에 높은 수율로 고정화되어 높은 효소 활성의 안정성을 나타낸다. 또한, 적절한 크기의 기공으로 인하여 기질과 산물의 출입이 원활하다. 이러한 본 발명의 효소 고정화 나노 카본볼은 규칙적인 세공, 넓은 표면적, 친수 및 소수성의 성질과 함께 열린 기공 구조를 가지고 있기 때문에 졸-겔에 의한 고정화보다 유리한 점이 많다. 또한 이들의 표면특성으로 인해 다양한 유기그룹의 기능화가 가능하고, 정전기적인 인력 또는 반발력을 이용하여 단백질을 흡착시키거나 탈착시키기가 용이하다. 따라서, 본 발명에 따라 효소를 고정화시킨 나노 카본볼은 단백질 오염, 기름 성분, 전분 오염 등을 제거하기 위한 세제 성분 외에도 바이오센서, 바이오촉매, 바이오 분자 분리 시스템 등에 유용하게 적용될 수 있다.
다공성의 쉘부에 고정화될 수 있는 효소로는 프로테이즈, 라이페이즈, 아밀레이즈, 라이소자임, 트립신 등의 효소를 목적에 따라 단독으로 또는 이들을 혼합하여 사용할 수 있는데, 고정되는 효소의 농도는 나노 카본볼 1g을 기준으로 0.001 내지 10mg 정도인 것이 적절하다. 프로테이즈는 단백질 분해 효과, 라이페이즈는 지방 성분의 분해 효과, 아밀레이즈는 전분의 분해 효과를 가지고 있으며, 라이소자임은 세균의 세포벽에 있는 다당류 중의 n-아세틸무람산(NAM)과 n-아세틸글루코사민(NAG) 사이의 1, 4-글리코시드 결합을 가수분해하는 효소로 세균에 대한 살균력을 가지고 있다. 그리고 트립신은 이자액에서 분비되는 단백질 분해효소로 단백질의 소화에 있어서 펩신과 함께 가장 중요한 효소이다.
본 발명의 효소 고정화 나노 카본볼을 제조하는 방법의 일예를 도 1을 참조하여 설명하면 다음과 같다.
먼저 구형의 실리카 코어(1)를 준비한다. 실리카 코어(1)는, 예를 들어 테트라에톡시실란, 테트라메틸오르토실리케이트, 테트라에틸오르토실리케이트와 같은 실리카 전구체로부터 공지의 스토버 공정(Stober, W.; Fink, A.; Bohn, E. J. Colloid Inter. Sci. 1968, 26, 62)에 따라 합성할 수 있다.
이어서, 구형의 실리카 코어(1)와 실리카 전구체 및 계면활성제, 예를 들어 하기 화학식 1로 표시되는 알킬트리메톡시실란, 하기 화학식 2로 표시되는 알킬트리에톡시실란, 하기 화학식 3으로 표시되는 할로겐화알킬트리메틸암모늄, 하기 화학식 4로 표시되는 알킬폴리옥시에틸렌 및 하기 화학식 5로 표시되는 글리세롤에톡실레이트 등과 같은 계면활성제를 용매하에서 반응시켜 실리카 코어(1) 표면에 실리카와 계면활성제 성분으로 이루어진 쉘부(2)를 성장시킨다.
R1R2R3R4Si(OCH3)3
상기 화학식 1에서, R1, R2 및 R3는 서로 독립적으로 메틸 또는 에틸기이고, R4는 탄소수 12 내지 22인 알킬기이다.
R1R2R3R4Si(OC2H5)3
상기 화학식 2에서, R1, R2 및 R3는 서로 독립적으로 메틸 또는 에틸기이고, R4는 탄소수 12 내지 22인 알킬기이다.
R1R2R3R4NX
상기 화학식 3에서, R1, R2 및 R3는 서로 독립적으로 메틸 또는 에틸기이고, R4는 탄소수 4 내지 22인 알킬기이고, X는 할로겐이다.
R(OCH2CH2)nOH
상기 화학식 4에서, R은 탄소수 4 내지 22인 알킬기이고, n은 3 내지 20의 정수이다.
CH2(CH2O)n1HCH(CH2O)n2HCH2(CH 2O)n3H
상기 화학식 5에서, n1, n2 및 n3는 서로 독립적으로 4 내지 20의 정수이다.
그런 다음, 쉘부가 형성된 결과물을 선택적으로 필터링한 후, 소성하여 계면활성제 성분을 제거하면, 계면활성제 성분이 제거된 자리에 메조포러스 기공을 포함하는 소정 직경들의 기공들이 형성된 실리카 쉘부(3)가 형성된 입자(10)를 얻는다. 기공의 크기와 쉘부의 두께는 계면활성제의 종류, 실리카 전구체의 종류 및 몰비를 변화시킴으로서 조절이 가능하다.
이어서, 실리카 쉘부가 형성된 입자(10)에 중합반응에 의하여 고분자 형성이 가능한 모노머, 예를 들어 아크릴로 니트릴, 페놀-포름알데히드, 디비닐벤젠과 같은 모노머(11)를 쉘부에 형성된 메조포러스 기공 안으로 주입한다. 이어서, 모노머를 중합시켜 카본 고분자 전구체를 형성한다. 상기의 모노머(단량체)를 상기 실리카 입자의 메조 세공에 주입하고, 모노머(단량체)의 특성에 따라 중합반응시킨다. 이들 중합반응은 해당분야에 공지된 것이나, 일반적으로 60℃ 이상의 온도에서 약 12시간동안 중합반응시켜 고분자 중합체가 함유된 실리카 구조체를 제조한다.
그런 다음, 고분자 중합체(카본 고분자 전구체)가 함유된 실리카 구조체를 예를 들어 1,000℃ 정도로 질소분위기 하에서 처리하면, 탄화된 고분자 중합체(13)가 함유된 실리카 구조체가 형성된다. 이어서, 탄화시킨 실리카 구조체를 불산이나 가성소다 수용액에 넣어 실리카 구조체를 녹여내면, 구형의 중공(속이 비어 있는) 코어(Core)부(15)를 갖으며 껍질인 다공성의 카본 쉘(Shell)이 형성된 볼 형상의 나노 카본볼(20)이 얻어진다.
그런 다음, 나노 카본볼(20)을 소정의 효소를 함유하는 용액에 함침시키면, 효소(17)가 고정화된 나노 카본볼이 얻어진다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것으로 해석되어져서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당 업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되어 지는 것이다.
효소 고정화 수율 측정
실시예 1
실리카 전구체로서 테트라에톡시실란(tetraethoxysilane)을 사용하여 공지의 스토버 공정에 따라 구형의 실리카 코어를 합성하였다. 여기에 테트라에톡시실란을 계면활성제인 옥타데실트리메톡시실란(C18-TMS: octadecyltri - methoxysilane)과 함께 투입하여 반응시킨 후, 필터링하여 실리카 입자들을 얻은 다음, 이를 550℃에서 5시간동안 열처리하여, 계면활성제가 제거된 자리에 일정한 크기의 메조 세공이 형성된 실리카 입자를 얻었다. 다음으로 디비닐벤젠을 라디칼 개시제인 아조비스이소부티로니트릴 (azobisisobutyronitrile: AIBN)과 잘 혼합한 후 상기 실리카 입자의 메조 세공에 주입하고, 80℃의 온도에서 약 12 시간 동안 중합 반응시켜 고분자 중합체가 함유된 실리카 구조체를 제조하였다. 계속하여 고분자 중합체가 함유된 실리카 구조체를 1,000℃의 질소분위기 하에서 탄화시켜 나노 카본볼을 형성시켰다. 이어서, 나노 카본볼을 불산에 넣어 나노 카본볼의 무기 구조체를 녹여내어 냄으로써 중공(속이 비어 있는)의 코어(Core) 부분과 껍질인 다공성의 쉘(Shell)이 형성된 볼 형상의 탄소 구조체인 나노 카본볼을 제조하였다. 도 2a ~ 2b는 각각 이와 같이 제조된 나노 카본볼의 외관과 그 단면을 촬영한 SEM 사진이다.
이어서, 전술한 방법으로 제조한 나노 카본볼 40mg을 1밀리그램/밀리리터의 농도로 제조한 지방분해효소(Lipase) 4밀리리터(포스페이트 버퍼, pH 7.0에 용해)에 첨가한 후, 20도에서 용액이 증발하지 않도록 유지하여 골고루 교반하면서 반응을 진행시켰다. 일정한 시간이 경과된 후에 시료 용액을 채취하여 곧바로 흡광광도계를 이용하여 단백질의 흡광도를 측정할 수 있는 파장 280nm에서 흡광도를 측정하였다.
전술한 방법으로 측정되어진 흡광도를 이용하여 초기 농도 대비 감소하여진 수치로 단백질의 고정화 정도를 정량적으로 비교하여 표 2에 나타냈다. 한편, 효소가 고정되는 나노 카본볼의 기공 크기, 기공 부피 및 표면적을 표 1에 나타냈다.
실시예 2 ~ 3
실리카 코어의 입경과 제조조건을 변화시켜 표 1에 기재된 나노 카본볼을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
비교예 1 ~ 2
나노 카본볼 대신 표 1에 기재된 일반 활성탄을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
표 2를 참조하면, 본 발명에 따른 효소 고정화 나노 카본볼은 비교예에 비해 매우 우수한 효소 고정화 수율을 나타냄을 알 수 있다.
효소 고정화 수율 측정
전술한 실시예 및 비교예에 따른 나노 카본볼과 일반 활성탄을 이용하여 효소 고정화 이후의 안정성을 측정하였다.
상기 효소 고정화 수율 측정에 나타난 교반 방법으로 제조된 효소 고정화 나노 카본볼 및 일반 활성탄을 4도에 보관하면서 경과 일수별 잔여 효소 활성을 측정하여 효소 고정화 안정성을 측정하였다.
표 3을 참조하면, 본 발명에 따른 효소 고정화 나노 카본볼은 비교예에 비해 비교예에 비해 고정화 이후에 더욱 우수한 효소 고정화 안정성을 나타냈다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 효소 고정화 나노 카본볼은 효소의 고정화 수율과 고정화 안정성이 매우 우수하다. 따라서, 단백질 오염 제거, 기름 성분 제거, 전분 오염 제거를 위한 세제, 바이오 센서, 바이오 촉매, 바이오 분자 분리 시스템 등에 유용하게 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
명세서 내에 통합되어 있고 명세서의 일부를 구성하는 첨부도면은 발명의 현재의 바람직한 실시예를 예시하며, 다음의 바람직한 실시예의 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하는 역할을 할 것이다.
도 1은 본 발명의 효소 고정화 나노 카본볼의 제조공정을 나타낸 개략도이고,
도 2a ~ 2b는 본 발명의 효소 고정화 나노 카본볼에 사용되는 나노 나노볼의 외관 및 그 단면에 대한 SEM 사진이다.

Claims (4)

  1. 구형의 중공 코어부;
    직경이 0.1 내지 20nm인 다수의 기공이 형성된 다공성의 카본 쉘부; 및
    상기 카본 쉘부에 고정된 효소;를 포함하는 것을 특징으로 하는 효소 고정화 나노 카본볼.
  2. 제1항에 있어서, 상기 중공 코어부의 지름은 10 내지 1,000nm이고, 상기 카본 쉘부의 두께는 10 내지 500nm인 것을 특징으로 하는 효소 고정화 나노 카본볼.
  3. 제1항에 있어서, 상기 효소는 프로테이즈, 라이페이즈, 아밀레이즈, 라이소자임, 트립신 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 효소 고정화 나노 카본볼.
  4. 제1항에 있어서, 상기 효소의 농도는 나노 카본볼 1g을 기준으로 0.001 내지 10mg인 것을 특징으로 하는 효소 고정화 나노 카본볼.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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