CN100455664C

CN100455664C - 一种用于固定青霉素酰化酶的载体的制备和负载方法

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Publication number: CN100455664C
Application number: CNB2006101555239A
Authority: CN
Inventors: 林贤福; 金鑫; 吴起; 吕德水; 陈志春
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2006-12-28
Filing date: 2006-12-28
Publication date: 2009-01-28
Anticipated expiration: 2026-12-28
Also published as: CN1995339A

Abstract

本发明公开了一种固定化青霉素酰化酶的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)将带有侧链官能团的多孔树脂进行研磨，筛选，干燥，活化后与壳聚糖溶液混合，烘干，得到固体；(2)将步骤(1)得到的固体加入极性亲水性溶剂中，加入助剂进行修饰反应后抽滤，洗涤，烘干得到多孔树脂载体；(3)将青霉素酰化酶负载于多孔树脂载体上；得到的固定化青霉素酰化酶。发明通过壳聚糖的生物相容性作用提高了酶的活性并维持较高稳定性，而且高分子聚合物基材具有良好的机械性能，使得本发明的固定化青霉素酰化酶更好的满足β-内酰胺抗生素工业化生产条件的要求。

Description

一种用于固定青霉素酰化酶的载体的制备和负载方法

技术领域

本发明涉及一种用于固定青霉素酰化酶的载体的制备和负载方法，主要应用于β-内酰胺类抗生素及其母核的工业制备和合成过程。

背景技术

二十世纪60年代早期β-内酰胺抗生素半合成工业渐渐兴起，这使得β-内酰胺的母核6-氨基青霉素烷酸(6-APA)成为重要的药物合成中间体。因此，人们首先开始通过青霉素酰化酶(PGA)裂解青霉素G来合成6-APA。随后，由于PGA独特的选择性，人们又研究利用PGA的选择催化作用，以6-APA或7-氨基去乙酸基头孢烷酸(7-ADCA)为β-内酰胺的母核，再加上适当的侧链来半合成β-内酰胺抗生素。

四十余年来，经过不断的筛选和基因重组的PGA变得越来越稳定，酶的生产能力也不断的得到提高，再加上有效的固定化方法使得酶的回收变成可能，该方法的成本也被大大的降低。

现在，通过酶的这一催化作用，全世界一年可以生产20000吨的6-APA，而相应的β-内酰胺类抗生素，如头孢氨苄，阿莫西林和头孢羟氨苄等，也已经逐渐实现了工业化的酶促合成。

但值得注意的是，有效的PGA固定化方法是酶促裂解青霉素G和β-内酰胺抗生素半合成的关键。所以现在对于这一领域的研究也相当重视。

许多材料都被研究和开发用来进行青霉素酰化酶的固定化，总体说来这些材料可以分为三大类：

一、高分子聚合物：主要是一些聚丙烯酸及其衍生化的多孔性树脂材料，有代表性的如Eupergit C和Amberlite系列树脂。

二、生物相容性材料：这一类主要是一些天然或具有一定生物相容性的材料，例如壳聚糖，葡聚糖，海藻酸钠，明胶等等。

三、无机材料：这主要是一些具有多孔性的无机材料，例如分子筛，硅藻土或硅胶等等。但是这一类材料通常会通过一些化学方法进行改性。

这三种材料已广泛用于酶固定化之中，不仅仅是青霉素酰化酶的固定，但是这三种材料各有利弊。通常说来，无机材料载体具有较好的机械性能和较高的比表面积，而高分子聚合物则有较高的固定化效率和较好的回收率及选择性。而生物材料则由于它们较好的生物相容性，会给固定化的酶提供一些帮助，如提高它们的化学稳定性，减小固定化过程中酶的失活，但是往往这一类载体的机械性能不是很理想，对于工业上苛刻的反应条件也不能很好的适应。

发明内容

本发明提供了一种用于固定青霉素酰化酶的载体的制备和负载方法，以具有一定活性官能团的高分子聚合物为基材，再通过壳聚糖和一些助剂的吸附修饰作用，对载体内部孔道表面进行修饰，使得高分子聚合物载体内部孔道表面更适于酶的吸附和固定，以获得更高的稳定性和活性。

这种用于固定青霉素酰化酶的载体的制备方法包括如下步骤：

(1)将带有侧链官能团的多孔树脂进行研磨，筛选，干燥，活化后与壳聚糖溶液混合，烘干得到固体；

(2)将步骤(1)得到的固体加入极性亲水性溶剂中，在机械搅拌转速100～800r/min，时间10～100分钟后，调节pH值为7～11，加入助剂进行修饰反应，修饰反应2～10小时后抽滤，洗涤，烘干。

所述的多孔树脂为颗粒状的固体多孔树脂，粒径为0.05～2.0mm，孔径为2～100nm。

所述的多孔树脂分子骨架为聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚乙烯、聚丙烯酸酯、聚氨酯等，多孔树脂带有的侧链官能团为羟基、氨基、羧基、磺酸基、硫脲基、膦酸基或环氧基中的一种或多种。

所述的壳聚糖溶液是将壳聚糖溶于乙酸或盐酸溶液中，壳聚糖的质量百分比浓度为0.5％～10.0％，所述的壳聚糖为生物级或工业级壳聚糖，去乙酰度为60％～95％，分子量为10000～500000。所述的壳聚糖与树脂的质量比在1∶1～1∶50之间。

所述的壳聚糖溶液中可添加有质量百分比浓度为1.0％～10％亲水性的物质，所述的亲水性的物质为聚乙二醇(PEG)2000、聚乙二醇(PEG)5000、聚乙二醇(PEG)20000、葡聚糖、葡聚醛或聚胺类。

步骤(2)中所述的极性亲水性溶剂为水、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮、甲醇、乙醇中的一种或几种。

步骤(2)中所述的助剂为甲醛、乙醛、戊二醛、环氧氯丙烷、三甲氧基氯甲基硅烷、氨丙基三乙氧基硅烷或2-氯乙胺/盐酸盐中的一种或几种，助剂添加量为修饰反应体系重量的1.0％～10％。

按本发明所述的制备方法制备的载体负载青霉素酰化酶的方法，包括如下步骤：

(a)将所述的载体用无机助剂活化，所述的无机助剂为氨水、碳酸氢钠、碳酸钠或多聚磷酸钠的水溶液，浓度为0.1～4.0mol/L，活化温度20～70℃，活化时间6～20小时；

(b)将无机助剂活化后的载体用双官能团试剂进行活化，所述的双官能团试剂为甲醛、乙二醛或戊二醛的水溶液，质量百分比浓度为0.5％～5.0％，活化温度20～70℃，活化时间1～8小时；

(c)活化后的载体在温度20～70℃陈化12～48小时，与浓度为50～2000U/ml青霉素酰化酶的游离酶溶液混合，5～40℃反应12～60小时，在体系中加入硼氢化钠，每毫升游离酶溶液的硼氢化钠用量为0.05～10mg，反应15～200min，抽滤，洗涤，室温真空干燥可得细颗粒状或粉末状的青霉素酰化酶固定化产物。

所述的载体负载青霉素酰化酶的方法同样适用于其他一些种类酶的负载，只要将步骤(c)中的游离青霉素酰化酶的溶液换成其他一些游离酶的溶液即可，如水解酶，氧化还原酶，合成酶等等。优选氨基酰化酶，猪胰脂肪酶，色氨酸合成酶，脲酶。

所述的负载青霉素酰化酶的方法的步骤(c)中，可以根据需要确定载体、游离酶溶液用量的关系，一般每克载体使用游离酶溶液2～20毫升。

制备本发明载体首先要选用一种具有大孔颗粒状树脂作为基材，例如，美国罗门哈斯公司的Amberlite IRC76C，Amberlite 1000Na；国内离子交换树脂通用型号的D101，D201，D316等常见树脂。这种大孔树脂通常含有一定的官能团，如羟基，氨基，羧基，磺酸基，硫脲基，膦酸基，环氧基，以及它们的衍生化基团等。壳聚糖首先通过多孔的吸附作用吸附进树脂的孔道内，再通过不同助剂的作用将其牢靠的与树脂连接在一起。

以三个例子说明：

一个是以羟基为官能团的树脂与壳聚糖共价结合的原理，由于树脂上具有很多的羟基，因此可以通过这些羟基，利用三甲氧基(或三乙氧基)氯烷基硅烷与壳聚糖的氨基发生作用，从而达到一个修饰化的目的，将壳聚糖固定并修饰在树脂上。

一个是以氨基为官能团的树脂与壳聚糖共价结合的原理，由于树脂上具有很多的氨基，因此可以通过这些氨基，利用环氧氯丙烷的交联作用，与壳聚糖的氨基发生反应，从而达到一个修饰化的目的，将壳聚糖固定并修饰在树脂上。

一个是以酯基为官能团的树脂与壳聚糖共价结合的原理，由于树脂上具有很多的酯基，因此可以通过这些酯基，再添加入二氯乙胺(盐酸盐)，与壳聚糖的酯基发生反应，从而达到一个修饰化的目的，将壳聚糖固定并修饰在树脂上。

这样，壳聚糖修饰的多孔树脂载体就可以通过这些不同的方法得以制备，然后采用常见的共价固定法，利用壳聚糖的氨基和双官能团试剂的活化作用对酶进行共价固定。

在这一载体中，不仅仅需要利用到壳聚糖较高的氨基密度，给共价交联提供基础和保障，还需要利用壳聚糖糖环上丰富的羟基，只有这些羟基才能给固定上的酶提供一个优良的亲水性微环境，这样才能保持酶具有较高的水活度，使酶失活率大大降低，保持一个较高的活力稳定性。所以，这也是采用壳聚糖作为树脂载体修饰剂的一个重要目的之一。

综上看来，第一，多孔大孔型树脂为壳聚糖的吸附和酶的吸附提供了基础；第二，壳聚糖稳定的共价修饰于树脂表面提高了整个载体的稳定性；第三，壳聚糖丰富的羟基为酶提供了一个非常优良的微环境；第四，可变的树脂骨架和官能团以及不同的共价修饰过程使得固定化载体具有多样性以适应不同酶和使用环境的需求。

这样，既通过壳聚糖的生物相容性作用保留了酶自身较高的稳定性和活性，又因为有高分子聚合物作为基材而具有良好的机械性能和化学稳定性，使得整个固定化产物能较好的适应β-内酰胺抗生素工业化生产中恶劣的条件。

附图说明

图1为树脂未修饰前的剖面SEM图

图2为壳聚糖修饰树脂后的剖面SEM图

具体实施方式

实施例1

取5.0g聚甲基丙烯酸甲酯球状多孔树脂研磨并过筛得粒径为0.5mm的树脂颗粒。将1.0g壳聚糖溶于50ml的2％乙酸溶液中，再加入0.5gPEG20000，配成透明澄清溶液。将树脂与壳聚糖溶液混合均匀，40℃烘干。将混合固体转入圆底烧瓶中，加入50ml水，机械搅拌200r/min，30分钟后，用NaOH水溶液调节pH值为10，加入0.5g 2-氯乙胺盐酸盐，控制温度40℃，反应5小时后，抽滤，洗涤，40℃烘干。

取1.0g制备好的载体于锥形瓶中，加入1mol/L的碳酸氢钠溶液，温度50℃，反应12小时，分离，再加入10ml 2.0％的乙二醛溶液，摇床振荡，200r/min，温度控制为40℃。6小时后取出，30℃陈化24小时，加入游离的青霉素酰化酶溶液400U/ml共5ml，10℃反应24小时，再在体系中加入NaBH₄ 15mg，处理30min后，抽滤，洗涤，室温真空干燥。分离可得固定化青霉素酰化酶产品，活力约为600～800U/g。

实施例2

取20.0g聚对苯乙烯烷羟基球状多孔树脂研磨并过筛得粒径为0.5mm的树脂颗粒。将1.0g壳聚糖溶于50ml的1％盐酸溶液中，再加入0.5gPEG2000，配成透明澄清溶液。将树脂与壳聚糖溶液混合，40℃烘干。将混合固体转入圆底烧瓶中，加入50ml DMSO，30分钟后，机械搅拌500r/min，用NaOH水溶液调节pH值为9，加入5ml的三甲氧基氯甲基硅烷，控制温度60℃，反应4小时后，抽滤，洗涤，40℃烘干。

取1.0g制备好的载体于锥形瓶中，加入1mol/L的氨水，温度60℃，反应15小时，分离，再加入10ml 2.0％的戊二醛溶液，摇床振荡，200r/min，温度控制为40℃。4小时后取出，30℃陈化36小时，加入游离的青霉素酰化酶溶液600U/ml共5ml，20℃反应36小时，再在体系中加入NaBH₄10mg，处理60min后，抽滤，洗涤，室温真空干燥。分离可得固定化青霉素酰化酶产品，活力约为500～700U/g。

实施例3

取10.0g聚丙烯酸叔氨基多孔树脂研磨并过筛得粒径为0.5mm的树脂颗粒。将1.0壳聚糖溶于50ml的1％盐酸溶液中，再加入0.5g葡萄糖，配成透明澄清溶液。将树脂与壳聚糖溶液混合均匀，40℃烘干。将混合固体转入圆底烧瓶中，加入25mlDMF和25ml乙醇，30分钟后，机械搅拌500r/min，用NaOH水溶液调节pH值为11，加入5ml的环氧氯丙烷，控制温度90℃，反应8小时后，抽滤，洗涤，50℃烘干。

取1.0g制备好的载体于锥形瓶中，加入1mol/L的多聚磷酸钠溶液，温度30℃，反应12小时，分离，再加入10ml 2.0％的乙二醛溶液，摇床振荡，200r/min，温度控制为40℃。6小时后取出，30℃陈化48小时，加入游离的青霉素酰化酶溶液加入游离的青霉素酰化酶溶液800U/ml共5ml，30℃反应50小时，再在体系中加入NaBH₄ 20mg，处理150min后，抽滤，洗涤，室温真空干燥，可得固定化青霉素酰化酶产品，活力约为700～900U/g。

Claims

1、一种用于固定化青霉素酰化酶的载体制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)将带有侧链官能团的多孔树脂进行研磨，筛选，干燥，活化后与壳聚糖溶液混合，壳聚糖与多孔树脂的质量比1∶1～1∶50，40～120℃直接烘干，得到固体；所述的壳聚糖溶液是将壳聚糖溶于2％的乙酸或1％盐酸溶液中，壳聚糖的质量百分比浓度为0.5％～10.0％；

(2)将步骤(1)得到的固体加入极性亲水性溶剂中，在机械搅拌转速100～800r/min，时间10～100分钟后，调节pH值为7～11，加入甲醛、乙醛、戊二醛、环氧氯丙烷、三甲氧基氯甲基硅烷、氨丙基三乙氧基硅烷或2-氯乙胺盐酸盐中的一种或几种进行修饰反应，修饰反应2～10小时后抽滤，洗涤，40～120℃烘干。

2、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的多孔树脂为颗粒状的固体多孔树脂，粒径为0.05～2.0mm，孔径为2～100nm。

3、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的多孔树脂分子骨架为聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚氯乙烯、聚丙烯酸酯、聚氨酯，带有的侧链官能团为羟基、氨基、羧基、磺酸基、硫脲基、或环氧基中的一种或多种

4、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的壳聚糖为生物级或工业级壳聚糖，去乙酰度为60％～95％，分子量为10000～500000。

5、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的壳聚糖溶液中添加有质量百分比浓度为1.0％～10％亲水性的物质，所述的亲水性的物质为聚乙二醇2000、聚乙二醇5000、聚乙二醇20000、葡聚糖、葡聚醛或聚胺类。

6、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的极性亲水性溶剂为水、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、丙酮、甲醇、乙醇中的一种或几种。

7、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的甲醛、乙醛、戊二醛、环氧氯丙烷、三甲氧基氯甲基硅烷、氨丙基三乙氧基硅烷或2-氯乙胺盐酸盐中的一种或几种，添加量为修饰反应体系重量的1.0％～10％。

8、一种如权利要求1所述的制备方法制备的载体。

9、一种如权利要求8所述的载体的负载方法，其特征在于：包括如下步骤：