JPS596885A - 不溶性生体触媒の製法 - Google Patents
不溶性生体触媒の製法Info
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- JPS596885A JPS596885A JP58106014A JP10601483A JPS596885A JP S596885 A JPS596885 A JP S596885A JP 58106014 A JP58106014 A JP 58106014A JP 10601483 A JP10601483 A JP 10601483A JP S596885 A JPS596885 A JP S596885A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、酵素又は酵素含有細胞物質の存在下に、アミ
ンを２個以上のアクリル（又はメタクリル）アミド基を
有する化合物と反応させることによる、不溶性生体触媒
の製法に関する。
ンを２個以上のアクリル（又はメタクリル）アミド基を
有する化合物と反応させることによる、不溶性生体触媒
の製法に関する。
酵素反応を目的として生体触媒を使用するためには、多
くの場合に予備的な固定化が望ましい。そのためには生
体触媒を不溶の形にする。
くの場合に予備的な固定化が望ましい。そのためには生
体触媒を不溶の形にする。
不溶の小粒子の形でこの触媒は、例えばカラム中での連
続反応に有利に使用することかできる。
続反応に有利に使用することかできる。
触媒を反応媒体中にスラリー化して反応を断続的に実施
する場合には、固定化された生体触媒は、再使用が可能
という利点を有する。なぜならば触媒を反応溶液から容
易に、例えば濾過又は傾斜により分別しうるからである
。多くの場合に固定化は生体触媒の使用期間を長くし、
これによって一般に経済的な利用が可能になる。
する場合には、固定化された生体触媒は、再使用が可能
という利点を有する。なぜならば触媒を反応溶液から容
易に、例えば濾過又は傾斜により分別しうるからである
。多くの場合に固定化は生体触媒の使用期間を長くし、
これによって一般に経済的な利用が可能になる。
酵素及び細胞を固定化するための方法を説明する。この
方法の一部は多少とも担体により生体触媒を物理的に結
合することにある。例えば酵素又は細胞はイオンの力に
より又は吸着力により担体に付着することができ、又は
それがゲル母体又は膜の中に包みこまれることもある。
方法の一部は多少とも担体により生体触媒を物理的に結
合することにある。例えば酵素又は細胞はイオンの力に
より又は吸着力により担体に付着することができ、又は
それがゲル母体又は膜の中に包みこまれることもある。
しかしこれらすべての場合に、この結合又は包囲が永続
的でなく、生体触媒の使用の間に徐々に洗い出されるこ
とを考慮せねばならない。これに対し生体触媒を共有結
合により担体に結合する方法がある。これは本質上二種
の処理法に分かれる。その一方は、まず担体を製造し、
この担体は製造様式によってずでに反応性の機能基を有
するか、あるいは後から機能化され又は活性化されうる
。この種の反応性担体な用いて、次いで生体触媒（多く
は溶液の形で）を接触させると、それが共有結合により
結合される。この場合は、担体の能力が機能化の程度に
よって定まり、そして一般にその能力がきわめて低いこ
とが欠点である。そのほか多孔質又はゲル状の担体では
、固定化すべき生体触媒によく同調していなければなら
ない。しかも機能化された担体の貯蔵性は多くの場合に
制限される。
的でなく、生体触媒の使用の間に徐々に洗い出されるこ
とを考慮せねばならない。これに対し生体触媒を共有結
合により担体に結合する方法がある。これは本質上二種
の処理法に分かれる。その一方は、まず担体を製造し、
この担体は製造様式によってずでに反応性の機能基を有
するか、あるいは後から機能化され又は活性化されうる
。この種の反応性担体な用いて、次いで生体触媒（多く
は溶液の形で）を接触させると、それが共有結合により
結合される。この場合は、担体の能力が機能化の程度に
よって定まり、そして一般にその能力がきわめて低いこ
とが欠点である。そのほか多孔質又はゲル状の担体では
、固定化すべき生体触媒によく同調していなければなら
ない。しかも機能化された担体の貯蔵性は多くの場合に
制限される。
共有結合により結び付けられた不溶（固定化）の生体触
媒を製造する他の可能性は、生体触媒の存在下に担体を
製造する方法である。これは、生体触媒をまず適当な試
薬により機能化し、次いで担体の製造に際し反応相手と
して共有結合的結合によって担体の構造中に組みこまれ
るように行うことができる。この方法は、生体触媒を予
備的に機能化する必要がなく、生体触媒が適合する機能
基例えばアミ／基を介して担体の一 ６− 製造の間に担体の構造中に絹みこまれる場合には、より
簡単である。例えばドイツ特許出願公開２６２５４７１
号明細書には、ポリウレタン発泡体中での生物学的材料
の固定化が記載され、その場合反応性のポリイソシアネ
ートが生物学的材料と反応すると共に、他方では泡状物
を形成する。この方法ではイソシアネートプレポリマー
の反応性が高いため、このプし／ポリマーによる乾燥酵
素の予備処理が指示され、それがこの方法の利用性を著
しく制限する。
媒を製造する他の可能性は、生体触媒の存在下に担体を
製造する方法である。これは、生体触媒をまず適当な試
薬により機能化し、次いで担体の製造に際し反応相手と
して共有結合的結合によって担体の構造中に組みこまれ
るように行うことができる。この方法は、生体触媒を予
備的に機能化する必要がなく、生体触媒が適合する機能
基例えばアミ／基を介して担体の一 ６− 製造の間に担体の構造中に絹みこまれる場合には、より
簡単である。例えばドイツ特許出願公開２６２５４７１
号明細書には、ポリウレタン発泡体中での生物学的材料
の固定化が記載され、その場合反応性のポリイソシアネ
ートが生物学的材料と反応すると共に、他方では泡状物
を形成する。この方法ではイソシアネートプレポリマー
の反応性が高いため、このプし／ポリマーによる乾燥酵
素の予備処理が指示され、それがこの方法の利用性を著
しく制限する。
ドイツ特許出願公開２８３５８７４号明細書には、エポ
キシドと適当な硬化剤との混合物中で、細胞又は細胞破
片を固定化する方法が記載されている。この方法は触媒
の成形に影響を与えのちに再び除去される不活性の補助
重合体を用いることが、操作をきわめて複雑にする。
キシドと適当な硬化剤との混合物中で、細胞又は細胞破
片を固定化する方法が記載されている。この方法は触媒
の成形に影響を与えのちに再び除去される不活性の補助
重合体を用いることが、操作をきわめて複雑にする。
さらに用いられるエポキシドが水溶性でないので、この
方法はいずれにしても使用が限定される。
方法はいずれにしても使用が限定される。
４−
ドイツ特許出願公開２９１５１３５号明細書には、水溶
液中でポリアミンの存在下に、グルタルジアルデヒドと
生体触媒を反応させることにより、固定化した生体触媒
を製造することが示されている。この場合生体触媒は、
グルタルジアルデヒドとポリアミンから生ずる網状組織
中に組みこまれる。この方法は、生ずる網状組織が機械
的に満足できる性質を有しないことが欠点である。さら
にグルタルジアルデヒドにより安定な架橋を生ずるもの
が一部アミン基だけで、二級アミン基にはこの作用がな
いので、ポリアミンが高い一部アミノ基の含有率を有す
べきであることが７制限となる。
液中でポリアミンの存在下に、グルタルジアルデヒドと
生体触媒を反応させることにより、固定化した生体触媒
を製造することが示されている。この場合生体触媒は、
グルタルジアルデヒドとポリアミンから生ずる網状組織
中に組みこまれる。この方法は、生ずる網状組織が機械
的に満足できる性質を有しないことが欠点である。さら
にグルタルジアルデヒドにより安定な架橋を生ずるもの
が一部アミン基だけで、二級アミン基にはこの作用がな
いので、ポリアミンが高い一部アミノ基の含有率を有す
べきであることが７制限となる。
本発明の課題は、前記方法の欠点を回避して生体触媒を
固定化するための簡単な方法を開発することであった。
固定化するための簡単な方法を開発することであった。
本発明は、次の成分
Ａ）生物学的に活性な物質すなわち酵素、細胞又は細胞
破片、 Ｂ）少なくとも２個のアクリルアミド基又はメククリル
アミド基を有する少なくとも１種の水溶性化合物及び Ｃ）アミン窒素に結合する少なくとも２個の水素原子を
有する、少なくとも１種の水溶性脂肪族アミン を、水溶液又は水性懸濁液中で、成分Ｂのアクリル（又
はメタクリル）アミド基の平均数と成分Ｃのアミン窒素
に結合する水素原子の平均数との合計が、それぞれ１分
子当り４以上である割合で混合し、そして１時間ないし
４日間に１５℃以上の温度で生じたゲルを粉砕するか、
あるいは水性混合物を小滴状に固化するまで水と混和し
ない溶剤中に懸濁させて保持し、生成した微粒状触媒を
溶剤から分別することを特徴とする、合成担体材料及び
強固にそれに結合された生物学的に活性な物質からの不
溶性生体触媒の製法である。
破片、 Ｂ）少なくとも２個のアクリルアミド基又はメククリル
アミド基を有する少なくとも１種の水溶性化合物及び Ｃ）アミン窒素に結合する少なくとも２個の水素原子を
有する、少なくとも１種の水溶性脂肪族アミン を、水溶液又は水性懸濁液中で、成分Ｂのアクリル（又
はメタクリル）アミド基の平均数と成分Ｃのアミン窒素
に結合する水素原子の平均数との合計が、それぞれ１分
子当り４以上である割合で混合し、そして１時間ないし
４日間に１５℃以上の温度で生じたゲルを粉砕するか、
あるいは水性混合物を小滴状に固化するまで水と混和し
ない溶剤中に懸濁させて保持し、生成した微粒状触媒を
溶剤から分別することを特徴とする、合成担体材料及び
強固にそれに結合された生物学的に活性な物質からの不
溶性生体触媒の製法である。
さらに本発明には、この触媒を不均一酵素反応に使用し
て、有機化合物を合成する方法も含まれる。
て、有機化合物を合成する方法も含まれる。
生物学的に活性な物質としては、酵素及び細胞が適して
おり、細胞は完全なものでも人工を加えたものでもよい
。粉砕又は砕解されあるいは均質化された細胞又は細胞
砕片も使用することができる。酵素の場合は、粗調製物
又は純粋酵素が用いられる。酵素の場合は粗製品で純粋
酵素でもよい。
おり、細胞は完全なものでも人工を加えたものでもよい
。粉砕又は砕解されあるいは均質化された細胞又は細胞
砕片も使用することができる。酵素の場合は、粗調製物
又は純粋酵素が用いられる。酵素の場合は粗製品で純粋
酵素でもよい。
本発明方法に適する酵素は好ましくはインベルターゼ、
グルコースイソメラーゼ、アミログルコシダーゼならび
にα−及びβ−アミラーゼである。さらに下記のものが
適している。オキシドレダクターゼたとえばアルコール
デヒドロゲナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、アミ
ノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、ク
ルコースオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、ザク
ンネートデヒドロゲナーゼ、グルタメートデヒドロゲナ
ーゼ、ウリカーゼ、フェノールオキンダーゼ、カテコー
ルオキシダーゼ、モノアミノオキシダーゼ、リポキンゲ
ナーゼ、ルシフェラーゼ、硝酸還元酵素、亜硝酸還元酵
素、クロルペルオキシダーゼ、アセトアルデヒドデヒド
ロゲナーゼ、アルデヒドオキシゲナーゼ、ディアホラー
ゼ、コレステリンオキシダーゼ、グルタルチオレダクタ
ーゼ、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、キザン
チンオキシダーゼ、ドパミンヒドロキシラーゼ、チトク
ロームオキシダーゼ、モノアミノオキシダーゼ、ジアセ
チルレダクターゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、リ
モナートデヒドロゲナーゼ；トランスフェラーゼたとえ
ばポリヌクレオチドホスホリラーゼ、デキストランスク
ラーゼ、ホスホリラーゼ、カルバメートキナーゼ、アミ
ントランスフェラーゼ、トランスアルドラーゼ、メチル
トランスフェラーゼ、ピルバートキナーゼ、カルバモイ
ルトランスフェラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、デキ
ストランシンテターゼ；加水分解酵素たとえばリパーゼ
、エステラーゼ、ラクターゼ、リゾチーム、アミノ酸ア
シラーゼ、ペニシリンアシラーゼ、セルラーゼ、ウレア
ーゼ、トリプシン、キモトリプシン、グルタミナーゼ、
アスパラギナーゼ、パパイン、フィチン、ペプシン、ロ
イシンアミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ
−）−Ｂ、マリンギナーゼ、プロメライン、ズブティリ
シン、ホスホリノく一ゼ、イソアミラーゼ、セファロス
ポリンアミダーゼ、ヒダントイナーゼ、アデノシンデア
ミナーゼ、ペニシリナーゼ、マルターゼ、デキストラナ
ーゼ、デソキシリボヌクレアーゼ、スルファターゼ、プ
ル２ナーゼ、ホスファターゼ、α−ガラクトンダーゼ、
β−グルカナーゼ；リアーゼたとえばトリプトファナー
ゼ、チロシンデカルボキシラーゼ、オキシニトリラーゼ
、フェニルアラニンデカルボキシラーゼ、フェニルアラ
ニンアンモニウムラーゼ、アミノ酸デカルボキシラーゼ
、ピルバートデカルボキシラーゼ、フマラーゼ、エノラ
ーゼ、アスパルターゼ、アミルプリンデヒドラターゼ、
カルボアンヒドラターゼ；イソメラーゼたとえばアミノ
酸ラセマーゼ、トリオースホスファ−トイツメラーゼ；
リガーゼたとえばグルタチオンシンセターゼ。
グルコースイソメラーゼ、アミログルコシダーゼならび
にα−及びβ−アミラーゼである。さらに下記のものが
適している。オキシドレダクターゼたとえばアルコール
デヒドロゲナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、アミ
ノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、ク
ルコースオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、ザク
ンネートデヒドロゲナーゼ、グルタメートデヒドロゲナ
ーゼ、ウリカーゼ、フェノールオキンダーゼ、カテコー
ルオキシダーゼ、モノアミノオキシダーゼ、リポキンゲ
ナーゼ、ルシフェラーゼ、硝酸還元酵素、亜硝酸還元酵
素、クロルペルオキシダーゼ、アセトアルデヒドデヒド
ロゲナーゼ、アルデヒドオキシゲナーゼ、ディアホラー
ゼ、コレステリンオキシダーゼ、グルタルチオレダクタ
ーゼ、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、キザン
チンオキシダーゼ、ドパミンヒドロキシラーゼ、チトク
ロームオキシダーゼ、モノアミノオキシダーゼ、ジアセ
チルレダクターゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、リ
モナートデヒドロゲナーゼ；トランスフェラーゼたとえ
ばポリヌクレオチドホスホリラーゼ、デキストランスク
ラーゼ、ホスホリラーゼ、カルバメートキナーゼ、アミ
ントランスフェラーゼ、トランスアルドラーゼ、メチル
トランスフェラーゼ、ピルバートキナーゼ、カルバモイ
ルトランスフェラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、デキ
ストランシンテターゼ；加水分解酵素たとえばリパーゼ
、エステラーゼ、ラクターゼ、リゾチーム、アミノ酸ア
シラーゼ、ペニシリンアシラーゼ、セルラーゼ、ウレア
ーゼ、トリプシン、キモトリプシン、グルタミナーゼ、
アスパラギナーゼ、パパイン、フィチン、ペプシン、ロ
イシンアミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ
−）−Ｂ、マリンギナーゼ、プロメライン、ズブティリ
シン、ホスホリノく一ゼ、イソアミラーゼ、セファロス
ポリンアミダーゼ、ヒダントイナーゼ、アデノシンデア
ミナーゼ、ペニシリナーゼ、マルターゼ、デキストラナ
ーゼ、デソキシリボヌクレアーゼ、スルファターゼ、プ
ル２ナーゼ、ホスファターゼ、α−ガラクトンダーゼ、
β−グルカナーゼ；リアーゼたとえばトリプトファナー
ゼ、チロシンデカルボキシラーゼ、オキシニトリラーゼ
、フェニルアラニンデカルボキシラーゼ、フェニルアラ
ニンアンモニウムラーゼ、アミノ酸デカルボキシラーゼ
、ピルバートデカルボキシラーゼ、フマラーゼ、エノラ
ーゼ、アスパルターゼ、アミルプリンデヒドラターゼ、
カルボアンヒドラターゼ；イソメラーゼたとえばアミノ
酸ラセマーゼ、トリオースホスファ−トイツメラーゼ；
リガーゼたとえばグルタチオンシンセターゼ。
生物学的活性物質と担体物質との間の強固な結合とは、
（場合により物理的にのみ結合されていた生物学的活性
物質の若干の最初の撰失を除いて）生物学的活性物質が
長時間後においても担体から洗出されない（好ましくは
共有結合的な）結合を意味する。
（場合により物理的にのみ結合されていた生物学的活性
物質の若干の最初の撰失を除いて）生物学的活性物質が
長時間後においても担体から洗出されない（好ましくは
共有結合的な）結合を意味する。
不溶性生体触媒とは、不均一接触反応に好適であり、ま
たその（常に水性の）反応媒質中での不溶性、粒子の大
きさ及び充分に強固な性状によって容易に沢過しうるか
又は他の手段で反応媒質から分別できる生体触媒をいう
。細胞及び細胞の部分は同様に不溶であるが、それらが
比較的に１過性が悪いので、これに含まれない。
たその（常に水性の）反応媒質中での不溶性、粒子の大
きさ及び充分に強固な性状によって容易に沢過しうるか
又は他の手段で反応媒質から分別できる生体触媒をいう
。細胞及び細胞の部分は同様に不溶であるが、それらが
比較的に１過性が悪いので、これに含まれない。
生物学的活性物質（成分Ａ）の水溶液又は水性懸濁液を
使用する場合は、その濃度に限界がなく、広い範囲に変
動できる。溶液又は懸濁液にする際の濃度は、不変であ
ることが好ましい。
使用する場合は、その濃度に限界がなく、広い範囲に変
動できる。溶液又は懸濁液にする際の濃度は、不変であ
ることが好ましい。
少なくとも２個のメタクリルアミド基又は好ましくはア
クリルアミド基を有する水溶性化合物（成分Ｂ）として
は、たとえばＮ 、 Ｎ’−メチレンビスアクリルアミ
ド、Ｎ、Ｎ’−エチレンビスアクリルアミド又はＮ、Ｎ
’−ジアクリロイルピペラジン、ならびに対応するメタ
クリル化合物が適している。得られるゲルの機械的強度
は、（平均で）２個より多く好ましくは６個までの反応
性二重結合を有する化合物又はそれらの混合物を使用す
ると改善できる。この種の化合物は、たとえば水溶液中
で前記種類のビスアクリルアミドを、不足量のアンモニ
ア又はアミン窒素に結合する２個以上の水素原子を含有
する少なくとも１種の水溶性アミンと、アミンのＮＨ基
１個当りビスアクリルアミドのモル比が０，５モル以上
好ましくは０．７〜１モルとなる量で反応させることに
より得られる。こうして得られる付加生成物はさらに多
くの場合、特にその使用アミン（又は多くのアミンの少
なくとも１種）がたとえばエタノールアミンのように親
水性基を含有するときに、改善された水溶性を有する。
クリルアミド基を有する水溶性化合物（成分Ｂ）として
は、たとえばＮ 、 Ｎ’−メチレンビスアクリルアミ
ド、Ｎ、Ｎ’−エチレンビスアクリルアミド又はＮ、Ｎ
’−ジアクリロイルピペラジン、ならびに対応するメタ
クリル化合物が適している。得られるゲルの機械的強度
は、（平均で）２個より多く好ましくは６個までの反応
性二重結合を有する化合物又はそれらの混合物を使用す
ると改善できる。この種の化合物は、たとえば水溶液中
で前記種類のビスアクリルアミドを、不足量のアンモニ
ア又はアミン窒素に結合する２個以上の水素原子を含有
する少なくとも１種の水溶性アミンと、アミンのＮＨ基
１個当りビスアクリルアミドのモル比が０，５モル以上
好ましくは０．７〜１モルとなる量で反応させることに
より得られる。こうして得られる付加生成物はさらに多
くの場合、特にその使用アミン（又は多くのアミンの少
なくとも１種）がたとえばエタノールアミンのように親
水性基を含有するときに、改善された水溶性を有する。
成分Ｂの水溶性は、室温で６重量％以上好まし １１−
くは１０重景％以上である。
アミン窒素に結合する少なくとも２個の水素原子を有す
る水溶性アミン（成分Ｃ）としては、アンモニア、低級
ジアミンたとえばエチレンジアミン、プロピレンジアミ
ン又はテ）・ラメチレンジアミン、又は低級ポリアミン
たとえばジエチレンジアミン、トリエチレンテトラアミ
ンが用いられる。成分Ｂが２個以上のアクリル（又はメ
タクリル）アミド基を含有するならば、−級モノアミン
たとえばエタノールアミン、メチルアミン、エチルアミ
ン又は二級ジアミンたとえばＮ 、 Ｎ’−ジメチルエ
チレンジアミンも架橋に役立つ。成分Ｂの１分子当りの
アクリル（又はメタクリル）アミド基の数と成分Ｃの１
分子当りのＮＨ基の数との合計が４より犬、すなわち約
４．１以上であれば足りるが、４．５又は５又は好まし
くはそれより犬であるときはさらに良好である。特に好
適なアミン化合物は、重合体の化合物たとえば直線状又
は分岐状のポリエチレンイミン又はポリビニルアミンで
ある。こ １２− れらのアミン類には、固定化された生体触媒の機械的安
定性を明白に改善する作用がある。
る水溶性アミン（成分Ｃ）としては、アンモニア、低級
ジアミンたとえばエチレンジアミン、プロピレンジアミ
ン又はテ）・ラメチレンジアミン、又は低級ポリアミン
たとえばジエチレンジアミン、トリエチレンテトラアミ
ンが用いられる。成分Ｂが２個以上のアクリル（又はメ
タクリル）アミド基を含有するならば、−級モノアミン
たとえばエタノールアミン、メチルアミン、エチルアミ
ン又は二級ジアミンたとえばＮ 、 Ｎ’−ジメチルエ
チレンジアミンも架橋に役立つ。成分Ｂの１分子当りの
アクリル（又はメタクリル）アミド基の数と成分Ｃの１
分子当りのＮＨ基の数との合計が４より犬、すなわち約
４．１以上であれば足りるが、４．５又は５又は好まし
くはそれより犬であるときはさらに良好である。特に好
適なアミン化合物は、重合体の化合物たとえば直線状又
は分岐状のポリエチレンイミン又はポリビニルアミンで
ある。こ １２− れらのアミン類には、固定化された生体触媒の機械的安
定性を明白に改善する作用がある。
固定化された生体触媒の製造は、６成分Ａ１Ｂ及びＣを
混合することにより行われる。後の両成分は水溶液とし
て使用することが好ましく、その場合の好ましい濃度は
２０〜５０重量％である。成分Ｂのアクリル（又はメタ
クリル）アミド基対成分Ｃのアミン水素原子のモル比は
、１：０．５〜１：２０であることが好ましい。好まし
くは溶液又は懸濁液として用いるが粉末としても使用で
きる生物学的活性物質（成分Ａ）を、まず成分Ｂの溶液
と混合し、若干時間（１分間ないし２時間）ののちに成
分Ｃの溶液と混合することが優れている。しかし場合に
より他の順序も可能である。
混合することにより行われる。後の両成分は水溶液とし
て使用することが好ましく、その場合の好ましい濃度は
２０〜５０重量％である。成分Ｂのアクリル（又はメタ
クリル）アミド基対成分Ｃのアミン水素原子のモル比は
、１：０．５〜１：２０であることが好ましい。好まし
くは溶液又は懸濁液として用いるが粉末としても使用で
きる生物学的活性物質（成分Ａ）を、まず成分Ｂの溶液
と混合し、若干時間（１分間ないし２時間）ののちに成
分Ｃの溶液と混合することが優れている。しかし場合に
より他の順序も可能である。
成分Ｃは、中和された形、部分的に中和された形又は中
和されていない形で加えてよく、このことは本質的に生
物学的活性物質のｐＴ（価安定性のいかんにより定まる
。アミン化合物が中和されない形で加えられると、通常
は反応混合物中てのｐ Ｔ−１価が高く、たとえば９〜
１１である。ゲル形成はこの条件下で比較的速やかに行
われる。しかしこの高いｐＨ価は多くの酵素を変性させ
るので、成分Ｃの中和が推奨される。
和されていない形で加えてよく、このことは本質的に生
物学的活性物質のｐＴ（価安定性のいかんにより定まる
。アミン化合物が中和されない形で加えられると、通常
は反応混合物中てのｐ Ｔ−１価が高く、たとえば９〜
１１である。ゲル形成はこの条件下で比較的速やかに行
われる。しかしこの高いｐＨ価は多くの酵素を変性させ
るので、成分Ｃの中和が推奨される。
ここに記載する方法の重要な利点は、ゲル形成が遅い速
度でもまた比較的低（・（たとえば５〜６の）ｐＨ価で
も起こることである。
度でもまた比較的低（・（たとえば５〜６の）ｐＨ価で
も起こることである。
使用する生物学的活性物質の熱安定性が許す限り、ゲル
形成は高められた温度たとえば５０℃で行うことができ
る。これによってゲル形成をかなり促進できる。室温以
下の温度を適用してもなんら利益が生じない。ゲル形成
には１時間ないし４日間、好ましくは２〜８時間かかる
。
形成は高められた温度たとえば５０℃で行うことができ
る。これによってゲル形成をかなり促進できる。室温以
下の温度を適用してもなんら利益が生じない。ゲル形成
には１時間ないし４日間、好ましくは２〜８時間かかる
。
これより長い時間は、経済上の理由からほとんど利益が
ない。
ない。
ゲルは慣用の手段でたとえばふるいを押し通し、切断し
又は押出すことにより細粒化することができる。ゲルは
細粒化の前又は後に乾燥（場合により冷凍乾燥）するこ
とができる。好適な粒子の大きさは、粒径が０．１〜５
闘の範囲である。
又は押出すことにより細粒化することができる。ゲルは
細粒化の前又は後に乾燥（場合により冷凍乾燥）するこ
とができる。好適な粒子の大きさは、粒径が０．１〜５
闘の範囲である。
混合物の固化に際し最初から微細な生成物を得るために
は、攪拌しながら混合物を、水と混合しない不活性溶剤
に（場合により普通の懸濁助剤を添加して）懸濁させれ
ばよい。そのとき混合物は球形に固化し、前記範囲（直
径０．１〜５朋）内においてその大きさは、容器、攪拌
器及び攪拌速度を適当に選択することにより、常法によ
り影響を与えられる。水と混合しない溶剤としては特に
次のものが用いられる。脂肪族、脂環族及び芳香族の炭
化水素たとえばヘキサン、シクロヘキサン及びドルオー
ル、ならびに塩素化炭化水素たとえば１，１１１−）！
Ｊジクロルタン。水相をよりよく懸濁させるため、懸濁
助剤を添加することが好ましい。そのためには反転に＃
懸濁重合に際して使用される物質、たとえばソルビタン
エステルが適している。固化ののち触媒をｒ別し、そし
て水又は緩衝剤水溶液でよく洗浄する。水溶性有機溶剤
たとえばアセトン又はアルコールによりあらかじめ短詩
間洗 １５− 浄することは有利であっても常に必要とは限らない。
は、攪拌しながら混合物を、水と混合しない不活性溶剤
に（場合により普通の懸濁助剤を添加して）懸濁させれ
ばよい。そのとき混合物は球形に固化し、前記範囲（直
径０．１〜５朋）内においてその大きさは、容器、攪拌
器及び攪拌速度を適当に選択することにより、常法によ
り影響を与えられる。水と混合しない溶剤としては特に
次のものが用いられる。脂肪族、脂環族及び芳香族の炭
化水素たとえばヘキサン、シクロヘキサン及びドルオー
ル、ならびに塩素化炭化水素たとえば１，１１１−）！
Ｊジクロルタン。水相をよりよく懸濁させるため、懸濁
助剤を添加することが好ましい。そのためには反転に＃
懸濁重合に際して使用される物質、たとえばソルビタン
エステルが適している。固化ののち触媒をｒ別し、そし
て水又は緩衝剤水溶液でよく洗浄する。水溶性有機溶剤
たとえばアセトン又はアルコールによりあらかじめ短詩
間洗 １５− 浄することは有利であっても常に必要とは限らない。
持することが重要であり、そして他方では、貯蔵時そし
て特に企図する反応のため必要な反応条件（主として温
度及びｐＨ価）における、こうして得られた触媒の主と
して作用に関する安定性が重要である。そのほか機械的
強度もある程度重要である。多くの生体触媒では、既知
の固定化法のいずれによっても満足すべき結果が得られ
ない。多くの場合その手段は費用がかかりすぎ、あるい
はその適用が狭いｐＨ域に限定され、いずれの場合も固
定化ののち残留する残存活性が弱いか又は短命であるこ
とが多い。本発明の方法は種々の点で既知の方法より優
れている。
て特に企図する反応のため必要な反応条件（主として温
度及びｐＨ価）における、こうして得られた触媒の主と
して作用に関する安定性が重要である。そのほか機械的
強度もある程度重要である。多くの生体触媒では、既知
の固定化法のいずれによっても満足すべき結果が得られ
ない。多くの場合その手段は費用がかかりすぎ、あるい
はその適用が狭いｐＨ域に限定され、いずれの場合も固
定化ののち残留する残存活性が弱いか又は短命であるこ
とが多い。本発明の方法は種々の点で既知の方法より優
れている。
１６ 一
実施例１
β−フラクトシダーゼ２５ｍ９を０．０５Ｍ酢酸ナトリ
ウム溶液（ｐＨ５，３）５ｍｌに溶解し、この溶液に順
次に、４，７．１０−） ’）オキサトリデカン−１，
１３−ジアミンとＮ、Ｎ’−メチジ／ビスアクリルアミ
ドの付加生成物（モル比１：４）の２０％溶液５ｍｌ及
びポリエチレンイミンの２５％水溶液（分子量３０００
０；塩酸によりｐＨ６，０に調整）５ｍｌを攪拌しなが
ら加えろ。混合物を室温に２日間放置し、得られた固形
ゲルを、ふるいを通して押出しく粒子の大きさ５００μ
ｍ以下）、ｐＨ５，５の０．０５Ｍ酢酸ナトリウム溶液
により洗浄する。固定化物２．５９ （使用酵素４゜２
■に相当）を、３０°Ｇで６０分間６０％蔗糖溶液５０
ｍ１と共に保温する。変化率を旋光針を用いて測定する
と６０％である。これは遊離酵素の対応量に対し７０％
の残存活性に相当する。
ウム溶液（ｐＨ５，３）５ｍｌに溶解し、この溶液に順
次に、４，７．１０−） ’）オキサトリデカン−１，
１３−ジアミンとＮ、Ｎ’−メチジ／ビスアクリルアミ
ドの付加生成物（モル比１：４）の２０％溶液５ｍｌ及
びポリエチレンイミンの２５％水溶液（分子量３０００
０；塩酸によりｐＨ６，０に調整）５ｍｌを攪拌しなが
ら加えろ。混合物を室温に２日間放置し、得られた固形
ゲルを、ふるいを通して押出しく粒子の大きさ５００μ
ｍ以下）、ｐＨ５，５の０．０５Ｍ酢酸ナトリウム溶液
により洗浄する。固定化物２．５９ （使用酵素４゜２
■に相当）を、３０°Ｇで６０分間６０％蔗糖溶液５０
ｍ１と共に保温する。変化率を旋光針を用いて測定する
と６０％である。これは遊離酵素の対応量に対し７０％
の残存活性に相当する。
実施例２
乾燥酵母５ｇを０．９３食塩溶液５０ｍ１中に懸濁して
１時間放置する。次いで遠心分離し、上相を傾斜により
分別する。湿潤酵母を、Ｎ、Ｎ′−メチレンビスアクリ
ルアミド、エタノールアミン及ヒエチレンジアミン（モ
ル比８’：４：１）の付加生成物の４０％水溶液２５ｇ
及びポリエチレンイミン（分子量３００００；塩酸によ
りｐＨ６，０に調整）の２５％水溶液２５ｇと混合し、
室温に３日間放置する。得られた固形ゲルを粉砕する（
粒子の大きさく５００μｍ）。このゲル１６．２．９（
乾燥酵母１．２５ 、！９に相当）をカラムに充填し、
酢酸ナトリウム０．０２モル／２でｐＨ５，６に調整し
た６５％蔗糖液を、２０ｍ１／時間の流下速度をもって
３０℃で導通する。変化の程度を旋光計を用いて測定す
ると、２日後に８８．５％、１６日後に８７％そして２
８日後に８４．５％である。
１時間放置する。次いで遠心分離し、上相を傾斜により
分別する。湿潤酵母を、Ｎ、Ｎ′−メチレンビスアクリ
ルアミド、エタノールアミン及ヒエチレンジアミン（モ
ル比８’：４：１）の付加生成物の４０％水溶液２５ｇ
及びポリエチレンイミン（分子量３００００；塩酸によ
りｐＨ６，０に調整）の２５％水溶液２５ｇと混合し、
室温に３日間放置する。得られた固形ゲルを粉砕する（
粒子の大きさく５００μｍ）。このゲル１６．２．９（
乾燥酵母１．２５ 、！９に相当）をカラムに充填し、
酢酸ナトリウム０．０２モル／２でｐＨ５，６に調整し
た６５％蔗糖液を、２０ｍ１／時間の流下速度をもって
３０℃で導通する。変化の程度を旋光計を用いて測定す
ると、２日後に８８．５％、１６日後に８７％そして２
８日後に８４．５％である。
実施例６
乾燥酵母１ｇを０．９％食塩溶液１０ｍｅに１時間懸濁
し、次いで遠心分離し、上相を傾斜する。
し、次いで遠心分離し、上相を傾斜する。
湿潤酵母（３，０、！９ ）を、Ｎ、Ｎ’−メチレンビ
スアクリルアミド、エタノールアミン及びエチレン、−
１０− ジアミン（モル比８：４：１）の付加生成物の４０％水
溶液５ｇ及びポリエチレンイミン（分子量３００００
；塩酸によりｐＨ６，０に調整）の２５％水溶液５ｇと
混合する。こうして得られた混合物をシクロヘキサン１
００ｍ１に懸濁しく懸濁助剤はドイツ特許出願公開２６
３４４８６号明細書に記載の保護コロイドＡ１００ｍ９
）、室温で６日間攪拌する。次いで１別し、固形化した
触媒を、０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，３
） １沼を用いて洗浄する。
スアクリルアミド、エタノールアミン及びエチレン、−
１０− ジアミン（モル比８：４：１）の付加生成物の４０％水
溶液５ｇ及びポリエチレンイミン（分子量３００００
；塩酸によりｐＨ６，０に調整）の２５％水溶液５ｇと
混合する。こうして得られた混合物をシクロヘキサン１
００ｍ１に懸濁しく懸濁助剤はドイツ特許出願公開２６
３４４８６号明細書に記載の保護コロイドＡ１００ｍ９
）、室温で６日間攪拌する。次いで１別し、固形化した
触媒を、０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，３
） １沼を用いて洗浄する。
インベルターゼ活性を試験するため、この触媒２．６９
（乾燥酵母０．２ｇに相当）を、６０％蔗糖溶液（ｐ
Ｈ５Ｊ） ５０ｍｌ中で６０℃で９０分間振とうする。
（乾燥酵母０．２ｇに相当）を、６０％蔗糖溶液（ｐ
Ｈ５Ｊ） ５０ｍｌ中で６０℃で９０分間振とうする。
変化率を旋光計を用いて測定す実施例４
α−アミラーゼ（１６０単位／ｍ？）４■を、４．７．
１０−１−ジオキサトリデカン−１，１６−ジアミンと
Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの付加生成物（
モル比１：４）の２０％水溶液２ｇに溶解し、得られた
溶液をポリエチレンイミンの２５％溶液（分子量３００
００；塩酸によりｐＨ６，０に調整）２ｇと混合する。
１０−１−ジオキサトリデカン−１，１６−ジアミンと
Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの付加生成物（
モル比１：４）の２０％水溶液２ｇに溶解し、得られた
溶液をポリエチレンイミンの２５％溶液（分子量３００
００；塩酸によりｐＨ６，０に調整）２ｇと混合する。
室温で６日間放置したのち、生じたゲルをふるい（メツ
シュ幅５００μｍ）を通し、次いで０．０５Ｍ酢酸ナト
リウム緩衝水溶液（ｐＨ６，ｏ） １００ｍｌを用いて
洗浄する。
シュ幅５００μｍ）を通し、次いで０．０５Ｍ酢酸ナト
リウム緩衝水溶液（ｐＨ６，ｏ） １００ｍｌを用いて
洗浄する。
活性を測定するため、このゲル１ｇを０．０１６Ｍ酢酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０）中のズルコウスキーに
よる殿粉（メルク社）５ｇの溶液５０ ｍｌ中で、３０
℃で６０分間振とうする。生成したオリゴサツカライド
を、ベーレンフエルト法により３，５−ジニトロサリチ
ル酸を用いて定量する（メソツズ・イン拳エンチモロジ
ーＩ巻１４９頁、アカデミツク出版社１９５５年参照）
。ゲルの活性は５７．２単位／９ （固定化収率４４％
）である。
ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０）中のズルコウスキーに
よる殿粉（メルク社）５ｇの溶液５０ ｍｌ中で、３０
℃で６０分間振とうする。生成したオリゴサツカライド
を、ベーレンフエルト法により３，５−ジニトロサリチ
ル酸を用いて定量する（メソツズ・イン拳エンチモロジ
ーＩ巻１４９頁、アカデミツク出版社１９５５年参照）
。ゲルの活性は５７．２単位／９ （固定化収率４４％
）である。
実施例５
実施例４と同様にしてβ−アミラーゼ８Ｔｎ９（−２０
＝ ２８単位／ｍｑ’）をゲル４ｇ中で固定化する。破砕し
たゲルを、０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，
６）１００ｍｌを用いて洗浄する。活性測定のため、こ
のゲル１ｇを０．０５ Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
４，８）中のズルコウスキーによる殿粉（メルク社）５
ｇの溶液５０ｍｅ中で振と５−１゜生成したマルトース
を、ベーレンフエルト法により３，５−ジニトロサリチ
ル酸を用いて定量する。ゲルの活性は６８．６単位／ｇ
（固定化収率６９％）である。
＝ ２８単位／ｍｑ’）をゲル４ｇ中で固定化する。破砕し
たゲルを、０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，
６）１００ｍｌを用いて洗浄する。活性測定のため、こ
のゲル１ｇを０．０５ Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
４，８）中のズルコウスキーによる殿粉（メルク社）５
ｇの溶液５０ｍｅ中で振と５−１゜生成したマルトース
を、ベーレンフエルト法により３，５−ジニトロサリチ
ル酸を用いて定量する。ゲルの活性は６８．６単位／ｇ
（固定化収率６９％）である。
実施例６
実施例５と同様にしてアミログルコシダーゼを固定化す
ると、固定化収率は３８％である。
ると、固定化収率は３８％である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、 次の成分 Ａ）生物学的に活性な物質すなわち酵素、細胞又は細胞
破片、 Ｂ）少なくとも２個のアクリルアミド基又はメタクリル
アミド基を有する少な（とも１種の水溶性化合物及び Ｃ）アミン窒素に結合する少な（とも２個の水素原子を
有する、少なくとも１種の水溶性脂肪族アミン を、水溶液又は水性懸濁液中で、成分Ｂのアクリル（又
はメタクリル）アミド基の平均数と成分Ｃのアミン窒素
に結合する水素原子の平均数との合計が、それぞれ１分
子当り４以上である割合で混合し、そして１時間ないし
４日間に１５℃以」二の温度で生じたゲルを粉砕するか
、あるいは水性混合物を小滴状に固化するまで水と混和
しない溶剤中に懸濁させて保持し、生成した微粒状触媒
を溶剤から分別することを特徴とする、合成相体材料及
び強固にそれに結合された生物学的に活性な物質からの
不溶性生体触媒の製法。 ２、特許請求の範囲第１項に記載の方法により製造され
た不溶性生体触媒を不均一酵素反応のために使用して、
有機化合物を製造する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19823222912 DE3222912A1 (de) | 1982-06-18 | 1982-06-18 | Unloeslicher biokatalysator |
| DE32229127 | 1982-06-18 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS596885A true JPS596885A (ja) | 1984-01-13 |
Family
ID=6166350
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58106014A Pending JPS596885A (ja) | 1982-06-18 | 1983-06-15 | 不溶性生体触媒の製法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4764467A (ja) |
| EP (1) | EP0097281B1 (ja) |
| JP (1) | JPS596885A (ja) |
| DE (2) | DE3222912A1 (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3408299A1 (de) * | 1984-03-07 | 1985-09-12 | Bayer Ag, 5090 Leverkusen | Verfahren zur immobilisierung von zellen und enzymen |
| US4929552A (en) * | 1987-08-17 | 1990-05-29 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Chemical and enzymatic process for the denitration of diethyleneglycol dinitrate, nitroglycerin and other nitrate esters |
| WO1991000346A1 (en) * | 1989-07-03 | 1991-01-10 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Polynucleotide phosphorylase immobilized on tris(hydroxymethyl)methylacrylamide polymer beads |
| DK0446826T3 (da) * | 1990-03-16 | 1996-02-12 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Fremgangsmåde til enzymatisk fremstilling af optisk aktive cyanhydriner |
| US5981719A (en) | 1993-03-09 | 1999-11-09 | Epic Therapeutics, Inc. | Macromolecular microparticles and methods of production and use |
| US6090925A (en) | 1993-03-09 | 2000-07-18 | Epic Therapeutics, Inc. | Macromolecular microparticles and methods of production and use |
| CN1972895B (zh) * | 2004-06-23 | 2010-08-18 | 旭硝子株式会社 | 聚合性液晶化合物、液晶组合物、光学各向异性材料及光学元件 |
| KR101385280B1 (ko) * | 2012-05-23 | 2014-04-16 | 한국과학기술원 | 역상 현탁중합과 전구체를 이용한 가교된 하이퍼브랜치 폴리아미도아민 입자의 제조 방법 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1400468A (en) * | 1972-07-22 | 1975-07-16 | Beecham Group Ltd | Enzyme preparation and use thereof |
| JPS5247038B2 (ja) * | 1973-03-24 | 1977-11-29 | ||
| DE2612138C2 (de) * | 1975-06-10 | 1986-09-11 | W.R. Grace & Co., New York, N.Y. | Verfahren zur Herstellung von gebundenes Protein enthaltendem Polyurethanschaum |
| DE2625544C2 (de) * | 1975-06-10 | 1986-09-11 | W.R. Grace & Co., New York, N.Y. | Verfahren zur Immobilisierung eines biologischen Materials und Zusammensetzung zur Durchführung des Verfahrens |
| GB1479097A (en) * | 1975-06-18 | 1977-07-06 | Ceskoslovenska Akademie Ved | Method of linking active substances to be enzyme released to polymers |
| JPS536483A (en) * | 1976-07-02 | 1978-01-20 | Tanabe Seiyaku Co Ltd | Composition having enzymatic activity and its preparation |
| US4288562A (en) * | 1978-03-27 | 1981-09-08 | The Dow Chemical Co. | Initiators for isocyanate reactions |
| DK146942C (da) * | 1978-04-19 | 1984-07-30 | Novo Industri As | Fremgangsmaade til fremstilling af et immobiliseret enzymprodukt |
| JPS5835077B2 (ja) * | 1979-05-02 | 1983-07-30 | 日東化学工業株式会社 | 微生物によるアクリルアミドまたはメタアクリルアミドの連続製造法 |
| US4334027A (en) * | 1980-02-25 | 1982-06-08 | Joachim Klein | Preparation of immobilized enzymatically-active substance |
| US4337313A (en) * | 1980-12-08 | 1982-06-29 | Miles Laboratories, Inc. | Immobilization of biocatalysts |
| JPS5923791B2 (ja) * | 1980-12-23 | 1984-06-05 | 旭化成株式会社 | 固定化微生物の製造法 |
-
1982
- 1982-06-18 DE DE19823222912 patent/DE3222912A1/de not_active Withdrawn
-
1983
- 1983-06-08 DE DE8383105611T patent/DE3360089D1/de not_active Expired
- 1983-06-08 EP EP83105611A patent/EP0097281B1/de not_active Expired
- 1983-06-15 JP JP58106014A patent/JPS596885A/ja active Pending
-
1987
- 1987-04-28 US US07/045,759 patent/US4764467A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3360089D1 (en) | 1985-05-09 |
| US4764467A (en) | 1988-08-16 |
| EP0097281A1 (de) | 1984-01-04 |
| DE3222912A1 (de) | 1983-12-22 |
| EP0097281B1 (de) | 1985-04-03 |
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