JPS5939291A - 生物学的物質の固定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は生物学Ｅｌ’Ｊ！ｉ！Ｉ質を固定する方法に関
する。

より詳細に１本発明はひる石（バーミキュライトノ粒状
体にエリ吸収さｆ″Ｌ穴生物学Ｂ′］′Ｊｌ／）質を、
久にポリマーで被ＢＩＴる前記物質の固定に関する。

酵素、酵素生成微生物または細胞のＬつな生物学的物質
はしばしば合成反応ならびに分析技法用の触媒として用
いられる。この稙の触媒は一般に穏やかな反応条件下で
著るしい特異性お工び高い効率をもって作用するので望
ましいものである。

酵素お工び他の生体触媒は一般に水溶性なので、これら
はバッチ式反応系に用いるのにガｊしている。

この種の酵素および他の生体触媒の再使用は、これらの
物質をその費消反応媒体から活性１７！：は使用可能な
形態で回収することが困難なので、制限を受けるもので
ある。更（、これらの物質は不純物として調製された生
成物中忙残貿する傾向がある。これらの問題“な回避す
るために、不溶性固体担体に対しても触媒活性を示す生
物学的物質を固定する目的で各種の方法が開発さｎて米
た。固定は、安定化さｆＬ、た生物学的物質であって１
反覆１穴は連続的使用による強直に耐え得るものの生成
を意図している。

生物学的物質についての数種類の固定系が報告されてい
る。酵素は不溶性物質、たとえば木炭。

ガラス、セルロース、リン酸カルシウムゲル、モンモリ
ロナイト、そしてとりわけ有機イオン交換樹脂上への吸
収にエリ固定さｎて米た。艷に固定は殿粉おＬびアクリ
ルアミドゲル中への取込み。

酵素と不溶性有機重合体間の共有結合による取付け（ｃ
ｏｖａｌｅｎｔ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）、ならびに酵
素分子自体間の共有結合取付けにエリ行わｎて米た。

先行技術てよるこ扛らの方法は、対応する非結合の生物
学的物質の活性と比べて低い生物学的活性を示す生成物
をしばしば％Ｉ’ｆｅらすｔのである。

これらの生物学的物質は熱的お工び化学的質性または失
活に対し敏感であることが知ら扛ている。

生物学的活性の損失は、固定操作が過酷な条件下で行わ
れる際に生じ、これは重合体の縮合反応を伴う場合に特
に問題となり得ることである。史に、先行技術の方法に
Ｌり得られた生成物はその親水性、強度、耐久性お工び
多孔性に関してしばしば４損５合がある。

従って１本発明の目的は生成物の生物学的活性な減少さ
せない生物学的物質の固定方法を開発することにある。

更に本発明の目的は、得られた生成物が優れた強度、耐
久性、多孔性および生物学的安定性を示す生物学的物質
の固定方法を開発することＫある。

本発明の他の目的は、最終担体の単位容量当り大量の生
物学的物質（高密度）を固定する方法を提供することに
ある。

そして、ここに生物学的物質を簡単かつ非常に経済的な
方法で固定することができ、−刀高度の触媒活性を維持
し得るものが見出された。本発明の方法に二って、ポリ
マーにエリ被覆されたひる石粒状体内に取込１れた生物
学的Ｌ＠質を含有する不溶性圧した生物学Ｂ’］物質の
複合体が生成される。

選択されたポリマーおよびひる６円に取込１れに生物学
的物質の性状によって、ポリマーを架橋または縮合させ
るのが好都合かも知扛ない。重合体を調製する際、非常
に軽度の活性喪失が生ずるが。

この稀の横合体は優れた強度および耐久性を示す。

更にポリマーを架橋１には縮合する場合には、これらの
物質の親水性は架橋もしくは縮合の程度を変化させるこ
とによって副面することがａＪ能である。本発明の方法
にエリ、簡単な濾過によって反応混合物から分離できる
横合体、もしくは反応基質が充填塔反応装置を通過する
ような連続的反応工程中で用い得る横合体が生成される
。

本発明の方法に工ｎば、ひる石粒状体ケ生物学的物質、
７ｔとえば醗酵肉汁から得らｎπ全湿潤細胞と接触させ
る。この生物学的物質はひる石粒状体中に吸収される。

高分子塗被拐料がこの粒状体を被覆する工うにひる石に
添加さｎる。仄に各種の架橋剤、縮合剤お工びゲル化剤
ケ加えてポリマーおＬび／ブたは生物学的物質を架橋お
よび強化させることができ、そして硬い通気性塗１１！
’に形成する。このポリマーは、ひる石と混合させるの
に先立って、場合にエリポリカルボン酸と一緒にして水
溶性プレポリマー乞形成さゼて％ＪＣい０この方法に工
って生物学的物質の横合体の生成か行わｒＬ、この場合
生物学的物質はポリマー被覆ひる石中に固定さ才する。

ひる石中の生物学的′＠質の固定は、架橋剤１には縮合
剤ならびに該生物学的物質に対する反応基を利用するポ
リマーの共有結合による。あるいは適当な架橋用物質な
使用してひる石粒状体内で架橋させることによる物理的
取込みによって行うことができる。たとえば、ポリマー
がポリアルキレンイミンである場合、生物学的物質は共
有結合によって固定することができる。そｆ′Ｌ、は生
物学的物質のアミン基およびカルボキシル基がポリアル
キレンイミン上のアミン基１には被覆ひる石に添加する
ことができるポリカルボン酸上のカルボキシル基な置換
することが可能だからである。ポリマーに対する共有結
合は結局縮合剤によって生ずる。

本発明の１５法は広い範囲の生物学的物質複合体の調製
な可能とするものである。

生物学的物質は酵素、微生物細胞、抗原、抗体、抗生物
質、補酵素、植物細胞、動物細胞、ノくクチリア、酵母
、カビ類、組織培養物、１次はそれらの混合物を包含す
ることができる。生物学的物質はひる石に水性形態で添
加するのが好ましい。

ひる石は生物学的物′Ｊ［？：固足するπめの優れた担
体を生み出すことが認められている。ひる石粒状体は非
常に大量の生物学的物質を吸収することができ、その結
果高密度の光項が行われる。また、ひる石は非常に安価
で容易に入手可能であり、従って製品の大量生産に際し
て担体として用いるのは非常に有利である。最後に、生
物学的物質を泥足する重力法に工って得られた泥足化相
体は強固であり、１７を非常に活性である。

本発明の泥足方法において用いらｎるひる石の粒径は可
成り変動し得るものである。たとえば。

ひる石の粒径は微粉末から約１ｃｒｎ！で、好１しくは
約０゜５乃至１■で変動可能である。ひる石に添加され
る生物学的物質の量は生物学的物／Ｊｊ楡合体の特足の
最終用途によって質動し得るものである。

一般に、それは用いられるひる石のダラム当り約０．０
０１乃至２２（乾量基準）、好１しくはひる石のダラム
当り約０．０１乃至約１２の範囲にある。

本発明方法にＬり調製される生物学的物質被合体は親水
性、強度、耐久性および多孔性に関して非常に異なつ７
ｔものと成り得る。ひる石を被覆するために用いられる
ポリマーを架橋もしくは縮合させる程度を減少させるに
つれて、親水性がより大きくなっり複合体を得ることが
できる。多官能架橋剤の添加に１って、ポリマー−ひる
石−生物学的物質被合体の強度お＝び耐久性を増大させ
ることができ、この場合付加的な官能基が史にポリマー
を縮合し、その結果より疎水性の複合体を生成する。

マトリックスの全多孔率はポリマー混合物が完全に縮合
する前にそｎに対し水溶性粒状物質を添加することによ
って増加させることができる。縮合後、引続いて水な添
加することにエリ、この水が固形物を溶解して乾燥物は
排除さ扛る。複合体の以前固形物で置き換えられていπ
部分は窒洞の１１残り、その結果このマｉ　リックスの
多孔率が増加する。ポリマー、ひる石または生物学的物
質に著るしく患影譬を及はさない、凡ゆる水溶性粒状物
質はマトリックスの多孔率を増大させるために利用する
ことができる。未縮合ポリマーと反応した水溶性ポリカ
ルボン酸はマトリックスの多孔率を増り口させるのに特
に通している。それに多孔率を増加させるために用いら
ｎる過剰量が実質的圧縮台反応な妨げないからである。

一般に１本発明の方法お工び複合体において用いられる
ポリマーは反応条件によって分子蓋が異なり、そして分
枝鎖構造１に：有するものか好ましい。

５釉の重合性物質を本発明７ｊ法中で用いることができ
、そｎらにはポリアルキレンイミン類、多糖類、ポリア
クリルアミド、ポリウレタン、アルギン酸塩、お工びキ
ャラジーナン（ｃａｒａｇｅｅｎａｎＪがある。好まし
いポリマーはポリアルキレンイミン類である。

ポリアルキレンイミン類はアルキレンイミンモノマーの
酸触媒付加重合によって合成することができる。好まし
いポリアルキレンイミンはポリエチレンイミン（ＰＥＩ
）である。それは現在、比較的低価格で容易に入手可能
であり、そして本発明方法において利用される縮合成心
に際して良好に機能するからである。ポリエチレンイミ
ンは触媒、たとえば鉱酸の存在下、エチレンイミンの開
環重合に工って生成される。このポリマーは非常に枝分
ｎしており、そして第１．第２お工び第３７ミノ基な含
んでいる。ＰＥＩは水溶性であり。

そしてポリマー鎖の架橋または縮合に工って、非水溶性
生成物を生成する。

ポリエチレンイミンはアミン架橋剤によって架橋させる
ことができ、そして付加的な安定性および強度な付与す
ることができる。この処置がポリアルキレンイミンと生
物学的物質の遊離アミン基との間の若干の架橋な伴う、
取込１ｆＬ７を生物学的物質をもたらす。架橋剤には、
グルタルジアルデヒド、ジイソシアネート、ポリイソシ
アネート。

２．４．６−）リクロロー８−トリアジン、ビスオキシ
ラン、ビスイミテート、ジビニルスルホン。

１．５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等があ
る。グルタルジアルデヒドが本目的のためには好ましい
。

選択されたポリマーは通常、実質的にひる石粒状体を被
覆するに足る量をもって複合体に＠加され、そしてこの
童はひる石の粒径、生物学的物質の性質および所望の物
性に実質的に依存するものである。通常、ポリマーは複
合体の約０．５乃至約２５重量％の範囲、そして好１し
くに約２チ乃至約１５重量％の範囲とすることができる
。用いられる架橋剤おＬび／１πは縮合剤の轍は以下に
論述する工うに、ポリマーの量に関連する。

ポリマーがポリエチレンイミンである場合、縮合につい
て非常に有効な方法ではポリカルボン酸（ＰＣＡ）が用
いられて隣接ＰＥＩ鎖のアミン基を架橋する。縮合剤、
好１しくにカルボジイミドは容易に縮合２行う。本発明
の組合ポリエチレンイミンケ生成するのに際して関係す
る反応な以下に示す。

Ｎ　　　　　　　　Ｌ　ＣＨ２Ｃ１（２ＮＨＪｎ”　−
Ｌ：Ｍ　２Ｌ：Ｈ２Ｎｔ１２（ＰＨＩ　）　　　　　　
　　　　　　　　　　（ＰＥＩ　）反応＋１１はエチレ
ンイミンを重合して分枝鎖構造ヲ有するＰＥＩ（但し、
ｎお↓びｎｌは０を超える整数、そしてｎ″は０　（（
ＣＩ（２Ｃ１２ＮＩ−（）基が存在しないことを示す）
１次は０を超えるものであれば工い）を生成することｔ
例示している。反応１２１はポリカルボン酸とＰＥＩの
アミン基との塩（但し、Ｒは置換１Ｊ能、あるいは炭化
水・素基であるンの生成ケ示し、反応曲お↓び（４）は
カルボジイミド縮合剤を用いるＰＥＩとポリカルボン酸
との縮合を表わしている。Ｒお工びＲは炭化水素基であ
り。

これらについては例示した反応の他の反応体お工び条件
と共和以下にＬり詳細に説明する。

一般に１本発明において使用するのに適したポリカルボ
ン酸は、少なくとも２個のカルボキシル基を有する置換
１穴は非置換カルボン酸である。

ポリカルボン酸は水溶性であるのが好１しく、そうであ
ればそれらのポリ−カルボンＷ１は複合体の多孔率な増
加させると共にポリアルキレンイミンを縮合するために
利用する仁とができる。本発明の方法および被合体にお
いて使用し得るポリカルボン酸の具体例には、アジピン
酸、アゼライン酸。

１．１１−ウンデカンジオン酸、１．１２−ドデカンジ
オン酸、トラウマチン酸、ペンタデカンジオン酸、ヘキ
サデカンジオン＃、セバシン酸、スペリン酸、グルタル
酸、マロン酸、ピメリン酸。

コハク酸、りんご酸、マレイン酸、グルタミン酸。

アスパラギン酸、しゆう酸、フマル酸、ポリアスパラギ
ン酸等がある。ジカルボンｒａｗ本発８Ａにおいて用い
るのが好１しく、そしてそｎらにはマレイン酸、コハク
酸、グルタル酸おＬびアジピン酸がある。高級ポリカル
ボン酸は、２以上のカルボン酸基を有する如伺なる物質
でも工く、そしてそれらには高分子重合性物質、たとえ
ば分子量５ρＯＯ乃至５０，０００を有するポリアスパ
ラギン酸がある。

縮合反応は通常発熱反応なので、反応混合−゛を。

固定される生物学的物質に害を及はさない温度。

たとえば約３７以下に冷却することが有利である。

反応体の分子量に賀動があるので、ポリカルボン酸対ポ
リアルキレンイミン（ＰＣＡ：ＰＡＩ）のモル比は広い
範囲で変化し得るものである。一般に。

この種の比率は１：２０乃至１：０．０００５の範囲に
亘っている。ポリカルボン酸が本発明祷合体の多孔率を
増加させるために松加さｎる場合は、しばしば可成リモ
ル過剰のポリカルボン酸が用いられる。

ポリカルボン酸は予備１合的条件下で、縮合量をもって
ポリアルキレ／イミ／に対し１１玩加して水溶性プレポ
リマーを生成させることができる。通常プレポリマーは
粘稠な液体であり、これに対し固定した生物学的物質を
含有するひる石２都合良く添加することができ、そして
縮合反応の間懸濁液で保持することが可能である。次に
、縮合剤を添加してプレポリマー−ひる石榴合体の縮合
と固化を行う。反応混合物のｐＨは、生物学的物質を実
質的に不活性とはせず、あるいはこ扛に悪影響を及はさ
ないレベルに維持する。このｐ　ＩＩは約２乃至約１２
の範囲、好１しくに約５乃至約１０の範囲に及ぶことが
可能である。

上記しπ工うに、ポリアルキレンイミン鎖の縮合なポリ
カルボン酸で行うために、縮合剤を用いることが有利で
ある。通常、アミンとカルボン酸の反応を触媒し乃至容
易にするものであｎばどんな物質でも利用することがで
きる。この神の縮合剤の具体例には、Ｎ−エチル−５−
フェニル−イソアゾリウム−３−スルホネート、ｎ−エ
トキシカルポニ）ｖ−２−エトキシ−１，２−ジヒドロ
キノリン、およびも桟のカルボジイミドかある。本発明
の配合物中で用いることのできるカルボジイミド縮合剤
は式Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ”（但し、Ｒ′おＬびＲは炭
素数３乃至約２０．好１しくに約５乃至約１２を有する
ヒドロカルビル基であるンで表わされる。この種の縮合
剤には、１−エチル−３，３−ジメチルアミノグロビル
ヵルボジイミド。

ジシクロへキシルカルボジイミド、１−シクロへキシル
−３−（２−モルホリノエチルンカルボジイミドメトー
ｐ−トルエンスルホネート、またはそれらの塩がある。

カルボジイミド縮合剤は反応混合物忙対し、縮合量をも
って１通常これは実質的忙化学蓋論的量、７２：とえば
化学１論量の約０．２乃至３倍、好１しくに約０．５乃
至１．５倍の１をもって添加される。名カルボジイミド
分子はポリカルボン酸の単一の酸基と反応する。たとえ
ば、カルボジイミド対ジカルボン酸のモル比約２：１が
本発明７ｊ法中で用いられる。両温における縮合剤の賂
加の結果、容易に目につく重合が３０秒以内に起り、そ
して通常約２時間以ＦＰ３に完了する。

縮合剤の添加に工ってポリエチレンイミンが固足された
場合の任意の後処理工程は、上記のようにアミン架橋剤
、たとえばグルタルジアルデヒドで、縮合、被覆したひ
る石を架橋して付加的な強度および安定性な最終祷合体
に付与するものである。

選択されたポリマーのタイプに１って、各種の縮合剤お
よび架橋剤を当該技術分野で周知のものから選んで、被
合体を強化することができる。本発明の前記した方法を
利用することにＬって、広゛い範囲にわたる種々の生物
学的物質を固足して新規な生体触媒的複合体を生成する
ことが可能である。以下の実施例において、固定手順な
エリ詳細に説明する。これらの実施例は本発明？実流す
るやり方ならびに方法、また本発明の利用について説明
するものであるが、限定として解釈されるべきではない
。

〔実施例Ｉ〕

約７５重量％の水を含むアスパルターゼ含有エシェリヒ
アコリ細胞ペースト８０グラムを新鮮なアスパルターゼ
含有エシェリヒアコリから調製した。ペーストを作るた
めに、水１リットル中に酵母抽出物２４９．７マルｒＲ
３０？、炭酸すｔｌつム２ｔ、硫酸マグネシウム２　ｍ
Ｍ、お工び塩イヒカルシウム０．１　ｍＭを溶解するこ
とによって醗酵培地を調製し、そしてこのｐＨを水酸化
アンモニウムで約７．２に調節し穴。この培地に、エシ
ェリヒアコリ（ＡＴＣＣＮａ３１９７６　）の培養物１
ｍｌ接種したが、この培養物ｕ　Ｏ，５ノく一セントの
グルタミン酸モノナトリウムを含有するペプトン培地中
。

３７℃で１２〜１６時間培養しｋものであっに０接種し
π培地は３７℃で１２〜１４時間培養し穴。

これらの細胞は５０００　ｒｐｍで３０分間遠１む分離
することにエリ採取した。

アスパルターゼ含有エシエリヒヤコリ８０グラムをひる
石粒状体２０２に添加しに０細胞ペーストケひる５中に
吸収させた後、ポリエチレンイミン１０グラムを混合物
に添加し、そして一様に分布する１で攪拌した。仄に、
グルタルジアルデヒド（水中２５％溶液Ｙ２０グラム）
を添加し、そして硬い粒子が得られる１で混合した。第
２ノくツチの物質も同じ方法で調製した。両ノ（ツチの
′Ｊａ質を一晩中乾燥させた。

この物質は最終層容量３５３ｃｃ　　？：もってカラム
中に充填した。次にこのカラムを、フマル酸アンモニウ
ムなＬ−アスパラギン酸に転化させるために用いた。フ
マル酸アンモニウムの１．５Ｍ溶液ｋ　１　ｍＭの硫酸
マグネシウムと共に、ｐＨ８，５゜−１ ３７℃でカラム中＆３６０ｃｃ／時間（１，Ｏ８Ｖ　　
）の割合で通過させた。溶出液については、２４０ｎｍ
　の分光光度計上のフマ／ｌ／酸の消失な測定すること
［ぶってアスパラターゼ活性を監視しに０このカラムは
１５１日間の連続操作に供しに０この期間中、力２ム溶
出液の試料は、基質の転化率チな測定するために分析し
た。その結果は第１表中に示す。

第１表 １．５Ｍフマル酸アンモニウム の転化率チ 〔実施例■〕 細胞ペースト１２０１およびポリエチレンイミン１５Ｐ
’に用いて実施例Ｉの一般的な手順に従った。固定した
物質の１バツチＹ１７３ｃｃ　　の層容量カラム反応器
中に充填した。このカラムは３６０ｃｃ／時間（２，０
８ＳＶ　ｈ−１）で、１．８Ｍフでル酸アンモニウム溶
液９９チを転化するのに成功した。

このカラムの生産性は％３７℃で、生成さｆ′Ｌｙｃア
スパラギン酸４９３　ｆ／固定さｎｆｃ細胞の層容量リ
ットル／時間（３，７モル／１／時間ンと計算される。

〔実施倒置〕

固定したエシェリヒアコリ細胞の１０ノ（ツチ（ひる石
１００　ｆ／バッチ）な実施例Ｕの一般手順に工って調
製した。

仄に、この生体触媒な１２．５リットル層容量カラム中
に充填した。フマル酸アンモニウム（１，８Ｍ）を３７
℃において、各種の流速なもってカラム中を通過させ、
そして溶出液を実施例ＩｌＣおける工うに、フマル酸ア
ンモニウムの転化について分析した。第■表はその試験
の結果な示す。

第　　■　　表 流　速　　　転化率チ　　　　Ｋ９／９ノ　　　　　モ
ル１ｔ４１Ａ１２．５０　　９９．１　　　　　　２．
９７　　　　　　１．７９１８．７５　　９７．５　　
　　　　４．３Ｂ　　　　　　　２．６３２５．００　
　　９５．０　　　　　　　　５．６９　　　　　　　
　３．４２６２．５０　　　５６．００　　　　　　　
８．３８　　　　　　　　５．０４〔実施例■〕 前述のパッチエリ％２９％高い活性を有する新鮮なエシ
ェリヒアコリ細胞を用いた以外は実施例Ｉの一般的な手
順な、この新鮮な細胞から成るバッチによって反覆した
。この基質なカラム中に６２．５ｔ／時間（実施例Ｉに
おけるようにンで通過させると、生成するアスパラギン
酸のｉｔは１０．５６Ｋｆ／時間（６，３５モル／１／
時間）であった。これは実施例１の生産性に対し２７ｑ
６の増加である。

〔実施例■〕

酵素、トリプトファンシンテターゼは本発明方法中で使
用してインドールおよびセリンからトリブトファンへの
転化を触媒させることができる。

ひる石粒状体（２グラム）お工びエシェリヒアコリ細胞
からの粗トリプトファンシンテクーゼ抽出物４−を−緒
に混合した。この抽出物をひる６中に吸収させた。次に
、ポリエチレンイミン（１グラム）を混合物に添加して
ひる石粒状体？１１′破覆した。仄いで、グルタルジア
ルデヒド（水中２５％溶液２−）２添加し、そして硬い
被覆粒状体が得らｎる１で混合した。仄に、物質の全１
ｔｈヲカラム中に配置し、そしてｐ　Ｈ７，８に調節し
た。セリフ０．０５Ｍ、インドール０．０５Ｍ、グ／Ｉ
／タチオン０．００５Ｍ、第ニリン酸カリウム０．００
５ＭおＬびピリドオキサ−ルー５−ホスフェート２００
〜／ｌから成る基質溶液で洗浄した。仄に、このカラム
をバッチ再循環系で反覆的に用いて、２４時間でＬ−ト
リプトファン８０■を生成しｋ。

〔実施例Ｖｌ　） 酵素、フェニルアラニンアンモニア−リアーゼを含有す
る酵母細胞Ｒ，ルブラ（Ｒ、ｒｕｂｒａＪ　９グラム全
部をひる石粒状体３グラムに混合してその中に吸収させ
、そして粒状体を充分に被覆させ。

仄いで１０′ｃＫ冷却した。８０℃で脱イオン水１０〇
−中に「ケルコ（Ｋｅｌｃｏ　）　Ｊ多糖類（Ｋ９Ａ５
０）粉末０．８グラムを添加し、そして１０分間攪拌す
ることに工り多糖類塗被溶液を調製した。

粉末は溶解し、そして塩化カリウム１グラムをこの溶液
に添加した。溶液は５０℃に冷却させた（溶液の１１で
ある］。仄にこの温溶液を混合しながら冷ひる石材料に
注入し穴。多糖類は非常に迅速にゲルを形成し、そして
Ｒ，ルブラ欠含有したひる石粒状体を被覆する。この粒
状体＆、ｐＨ７，０の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液１
００　ｍｌ中に配置し、そして十分に攪拌洗浄した。粒
状体を緩衝液から除去し穴。この溶液は濁り乃至曇りの
徴候な全く示さず、！ｆｃ実質的に°酵母細胞を含１ず
、置市が成功であったことを示している。この粒状体を
ｐ　Ｈ９，３の０．１Ｍけい皮酸アンモニウム５０ｔｎ
ｔ中に配置し、そしてこの溶液について、Ｌ−フェニル
アラニンの生成を監視することにエリＰＡＬ活性を試験
しｋ。Ｌ−フェニルアラニンの生成に関して、置市した
細胞物質は成功であり、そしてＬ−フェニルアラニンの
量の増加かその期間中１反応溶液中で認められた。

時計出願人　　　ジエネックス・コーポレイション＝４
１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （３１（ａ）生物学的物質の水性媒体にひる石粒状体を
   ｆＵ瓢加する工程と （ｂ）前記生物学的物質の水性媒体を前記ひる石中に吸
   収させる工程と。 （ｅ）前記ひる石をポリマーで被覆する工程とを含んで
   成ることな特徴とする固足した生物学的物質複合体の謔
   製による生物学的物質の固定方法。 （２１工程（ｅ）の被覆したひる石が、架橋剤にエリ架
   橋されるか、あるいは縮合剤にエリ縮合されるものであ
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ＋３１ポリマーが、ポリアルキレンイミン、多糖類、ポ
   リアクリルアミド、ポリウレタン、アルギン酸塩お工び
   キャラジーナ７　（ｃａｒａｇｅｅｎａｎ　）から成る
   群から選択される特許請求の範囲第１項ｉ′ｆｃは第２
   項記載の方法。 ＋４１　（ａ）生物学的物質の水性媒体にひる石粒状体
   を添加する工程と。 （ｂ）前記生物学的物質の水性媒体を前記ひる石中に吸
   収させる工程と。 （Ｃ）前記ひる石をポリマーで被覆する工程と。 （ｄ）前記被覆し穴ひる石なアミン架橋剤で架橋させる
   か、あるいは縮合剤で縮合させる工程とを含んで成るこ
   とを特徴とする固足した生物学的物質複合体の調製によ
   る生物学的物質の固定方法。 （５）前記ポリマー被覆ひる石な架橋量のアミン架橋剤
   と混合して、生物学的物質を前記被覆ひる石中和固定す
   る特許請求の範囲第４項記載の方法。 （６）前記ポリアルキレンイミンポリマーを縮合量のポ
   リカルボン酸と混合して、部分的に重合させた予備縮合
   水溶性ポリマーな、それが前記ひる石と混合される前に
   生成する特許請求の範囲第４項記載の方法。 （７）前記被覆ひる石な、縮合条件下で縮合量のカルボ
   ジイミド縮合剤ｖ　ＩＩＡ／ＩＩＩすることにエリ縮合
   させる特許請求の範囲第４項記載の方法。 １８１前記被覆ひる石な１ｍ合条件下で縮合量のカルポ
   ジイミド縮合剤を添加することにエリ縮合させる特許ｉ
   Ｉ′ｉｌ求の範囲第６項記載の方法。 （９）更にアミン架橋剤を用いる後処理によって不溶化
   した生物学的物質複合体’Ｙｆ性する工程を含んで成る
   特許請求の範囲第７項または第８項記載の方法。 Ｇ（Ｉポリアルキレンイミンポリマーが、ポリエチレン
   イミイ、ポリプロピレンイミン、ポリブチレンイミンお
   よびポリベンチレンイミンから成る群から選択される特
   許請求の範囲第４．第５．第６、第７または第８項記載
   の方法。 ０υポリアルキレンイミンポリマーがポリエチレンイミ
   ンである特許請求の範囲第４．第５．第６゜第’７’ｘ
   ｙｅは第８項記載の方法。 ａ３ポリカルボン酸が、マレイン１凱コハク酸お工びア
   ジピン酸から成る群からｉｓ択される特ｒ＋、ｒ−ｓＸ
   の範囲第６または第８項記載の方法。 ０３力ルボジイミド幅合剤が、ｌ−エチル−３゜３−ジ
   メチルアミンプロピルカルボジイミドヒドロクロリド、
   ジシクロへキシルカルボジイミド。 おＬび１−シクロヘキシル３−　（２−モルホリノエチ
   ルンカルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホネートな
   らびにそれらの塩から成る群から選択される特許請求の
   範囲第７項’Ｊ７？は第８、項記載の方法。 α荀前記アミン架橋剤が、グルタルジアルデヒド。 ジイソシアネート、ポリイソシアネート、２，４゜６−
   ドリクロロー５−トリアジン、ビスオキシラン、ビスイ
   ミデート、ジビニルスルポン、および１．５−ジフルオ
   ロ−２，４−ジニトロベンゼンから成る群から選択され
   る特許請求の範囲第４項１には第５項記載の方法。 ａ！９前記ひる石に、隙加される前記生物学的物質の童
   が、ひる石のグラム拍り乾量基準で約０．００１乃至約
   ２２である９肝請求の範囲第１項１′ｆｃは第４項記載
   の方法。 ＋Ｉ［９ポリアルキレンイミン対ポリカルボン酸のモル
   比が約１：２ｏ乃至１　：　ｏ、ｏｏｏｓ”ｃ”ある特
   ′ｒＦ趙求の範囲第６項記載の方法。 ａＤカルボジイミドが、ポリカルボン酸に対し化学童論
   的に約０．２乃至３倍の範囲の量で用いられる特許請求
   の範囲第１６項記載の方法。 ａ０カルボジイミドが、ポリカルボン酸に対し化学量論
   的に約０．５乃至１．５倍の範囲の量で用いられる特許
   請求の範囲第１６項記載の方法。 ａｌｌ泥足れた生物学的物質が酵素、微生物細胞。 抗原、抗体、抗生物質、補酵素、バクテリア、酵母、カ
   ビ類、植物細胞、動物細胞および組織培養物から成る群
   から選択される特許請求の範囲第１項’！７（は第４項
   記載の方法。 翰生物学的物質が微生物的に生成さｆ１７ｉｃアスパル
   ターゼである特許請求の範囲第１項’Ｊｆｃは第４項記
   載の方法。 （２り酵素がトリプトファンシンテターゼである特許請
   求の範囲第１項１次は第４項記載の方法。 （２リボリマー内に固定されるひる石粒状体中に吸着さ
   ｎる生物学的に活性な物質を言んで成ることを特徴とす
   る不溶化し次生物学的物５１！、抜合体。 （２５）ポリマー内に固定さｎるひる石粒状体中に吸着
   さ扛る生物学的に活性な物５１を含んで成り。 この場合前記ポリマーが架橋剤によって架橋されること
   を特徴とする不溶化した生物学的物質複合体。 （２リボリマーはポリアルキレンイミンであり。 そして架橋剤がアミン架橋剤である特許請求の範囲第２
   ３項記載の不溶化した生物学的物質複合体。 （２リアミン架橋剤が、グルタルジアルデヒド。 ジイソシアネート、ポリイソシアネート、２，４゜６−
   　トＩＪクロローｓ−トリアジン、ビスオキシラン、ビ
   スイミテート、ジビニルスルホン、お工ヒ１．５−ジフ
   ルオｏ−２ｔ４−ジニトロベンゼンから成る群から選択
   さｎる特許請求の範囲第２４項記載の複合体。 （２リアミン架橋剤がグルタルジアルデヒドである特許
   請求の範囲第２４項記載の複合体。 （２７）ポリマー内に固定されるひる石粒状体中に吸着
   される生物学的に活性な物質を含んで成り。 この場合前記ポリマーが縮合剤ＫＬって縮合さｎること
   を特徴とする不溶化した生物学的物質複合体。 （２８）ポリマーがポリアルキレンイミンであり。 そして縮合剤がカルボジイミド縮合剤である特許請求の
   範囲第２７項記載の年齢化した生物学的物質複合体。 （２つ）縮合剤が、ｌ−エチル−３，３−ジメチルアミ
   ノプロピルカルポジイミドヒドロクロリド。 ジシクロへキシルカルボジイミド、お工び１−シクロへ
   キシル−３（２−モルホリノエテル）カルホシイミドー
   メトーｐ−トルエンスルホネートナらびにそｎらの鳩か
   ら成る群から選択さｒＬる特許請求の範囲第２８項記載
   の相合体。 （５０）ポリアルキレンイミンポリマーが、ポリエチレ
   ンイミン、ポリプロピレンイミン、ボ、リプチレンイミ
   ンお工びボリベンチレンイミンから成る群から選択さｎ
   る特許請求の範囲第２４項１には第２６項記載の相合体
   。 （ラリ生物学的に活性な物質が、酵素、微生物細胞、抗
   原、抗体、抗生物質、補酵素、植物細胞。 動物細胞、バクテリア、酵母、カビ類および組織培養物
   から成る群から選択さｎる特許請求の範囲第２２項、第
   ２３．第２４．第２７または第２８項記載の複合体。 （３り生物学的に活性な物質がアスパルターゼである特
   許請求の範囲第２２項、第２３．ｍ２４゜第２７２７Ｃ
   は第２８項記載の複合体。 （５υ生物学的に油性な物質がトリプトファンシンテタ
   ーゼである特許請求の範囲第２２項、第２３゜第２４、
   第２７Ｆｆｆは第２８項記載の複合体。 （５リアスパラギン酸生成条件下に、７マル酸アンモニ
   ウムを含有する基質な、アスパルターゼケ固足した生物
   学的物質複合体と接触させるか、あるいはアスパラター
   ゼ會有微生唆細胞をひる石粒状体中に吸収させ、そして
   ポリマー内に固定したものと接触させる工程を含んで成
   るが、この場合固定し穴ひる石が架橋剤で架橋さｎるが
   、縮合剤で縮合さｎることを特徴とするアスパラギン酸
   の生成方法。 （５５）　ｌ’リプトファン生成条件下に、インドール
   お１びセリンを含有する基質ヲ、トリグトファンシンテ
   ターゼを固定した生物学的物質複合体と接触させるか、
   あるいはトリプトファンシンテターゼ含有微生物細胞な
   ひる石粒状体中に吸収させ。 そしてポリマー内に固定し７ｔ％のと接触させる工程を
   含んで成るが、この場合固定したひる石が架橋剤で架橋
   されるか、縮合剤で縮合されることを特徴とするトリプ
   トファンの生成方法。 （３６Ｊ　ｌ、−フェニルアラニン生成条件下に、ケイ
   皮酸アンモニウムを含有する基質を、フェニルアラニン
   アンモニアリアーゼを固定し大生物学的物質禎合体と接
   触させるか、あるいはフェニルアラニンアンモニアリア
   ーゼ含有微生物細胞なひる石粒状体中に吸収させ、そし
   てポリマー内に固定したものと接触させる工程を含んで
   成ることを特徴とするし一フェニルアラニンの生成力法
   。