SU664468A1 - Способ получени активированных носителей - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКТИВИРОВАННЫХ НОСИТЕЛЕЙ

Изобретение относитс  к.способу получени  активированных йодонерастворимых носителей дл  иммобилизации белков. Иммобилизованные на таких сорбентах ферменты могут быть применены как химические реактивы и йро- мьшшенные катализаторы дл т прОВёде- ни  ферментативных реакций в химической , фармацевтической и пищевой отрасл х промышленности. Иммобилизаци  ферментов путем их присоединени  к нерастворимым НО Сйтел м . вл етс  одним из наиболее известных способ улучшени  технологических показателей этих биокатализаторов . Метод иммобилизации ферментов заключаетс  в-присоединении их к активированным нрсите;п м, причем сво ства получаемых катализаторов во мно гом завис т от способа получени  и активации носител . В качестве, носителей часто используют органомине- ральные материалы, в частности, покрытые полимерами пористые кремне- земные материалы. Носители такого типа характеризуютс  Хбреминй гидродинамическими свойствами и достаточной стабильностью получаемых препа- ратов,. свойства которых во многом- завис т от метода внесени  и активаций полимерного сло  на носителе. Известен способ получени  модифицированных твердых носителей путем покрыти  поверхности носител  полимером , в качестве которого исполь-ззтот полиакроттейн р. Слой полимера образуетс  на поверхности носител  в результате пропитывани  носител  мономером, содержащим свободные альдегидные группировки. Полимеризаци  происходит на поверхности носител . Иммобилизаци  фермента производитс  по реатсцйи между альдегидными группами носител  и,аминогруппами фермента. Такой способ позвол ет получить иммобилизованные на органоминеральных носител х ферменты, однако он

Ограничивает модификацию носител  только альде идсодёржгащидаГ полимерами . Св эьшание ферментов через альде .гиды не всегда позвол ет получить активнь1е препараты. Кроме того, получаемые лин ейные полимеры обладают значительной раствортимостью и не скрепл ют неорганическую структуру носител .

Известен также способ получени  активиройанного твердого носител , пригодного дл  приготовлени  водонерастворимых ферментных перпаратов. На поверхности носител  в результате полимеризации образуетс  слой полимера 2, в качестве которого используют полиакролеин. Носитель (фарфор, измельченное стекло) пропитывают мономером, содержаашм свободные альдегидные группировки. Полимеризаци  происходит на поверхности носител .

В результате модификйции носител  таким способом получают носитель со свободными альдегидными группами. Иммобилизаци  фермента (трипсина, папаина) производитс  чер1ез реакцию альдегидных групп носител  е аминогруппами фермента.

Недостатком этого способа  вл етс  мала  операционна  стабильнбс ь получаемых активированных йосйтелей . Покрытие неорганического материала линейными полимерами, образуюпщмйс  при полимеризации виниЛыйпс полимеров, не обеспечивает доСтаточйую нерастворимость и, ёйёдовательно , стабильность получаеиъкферментнь1х препаратов. Такой способ Oihpaнигчива ет модификацию носител  только альдегидсодержащими полимерами, а св зывание ферментов через альдегидные группы не всегда Дает возможност получить активные препараты. Кроме того, способ не обеспечивает высокого содержани  белка на едииицу носител . При иммобилизации трипсина достигаетс  св зыванием 0,2 мг белка на 1 мл носител .

Цель изобретени  - повышение операционной етабильности носителей дл  иммобилизации биоактивных веществ .Это достига1етс  известщ.1м способо пдлучёнйй актйвйрО ваннь1Х носителей дл  иммобилизации белков путем покрыти  пористого неорганического gaтериала с диаметром пор 200-2000 А

пленкообразующим веществом, в ка-чёстве которого используют эпоксидную смолу И отверждают ее на носителе полиэтиленполиамином или 1,6-гексаметилендиамином в соотношении эквивалентов эпоксидной смолы и амина 1:0,25 при 100-120°С в течение не менее 1ч.

Способ осутцествл ют следующим образом . 5 вес. ч. силохрома или силикагел  смачивают 9 вес. ч. 1,7% эпоксидной смолы в ацетоне. После выпаривани  растворител  при 100С провод т затвердение полиэтиленполиамином или 1,6-гексаметиллендиамином посредством кип чени  в их водных растворах ВТ течение I ч (соотношение, эквивалентов эпоксидной смолы и амина 1:0,25). Носитель фильтруют, промывают водой и высушивают в термостате при . Получают носитель, содержащий на поверхности пор пленку С активными эпоксидными группами, способными к непосредственному присоединению биоактивных и еще с тв.

При таком способе можно провести

полимеризацию при повышенной температуре , :способству  этим образованию поперечных св зей между молекулами полимера, а также св зей между полимером и йОверхностью носител . Образование в порах носител  полимерной пленки закрепл ет структуру носител: , уменьшает нежелательное адсорбционное воздействие молекул фермента с носителем, и предотвращает вымывание фермента с носител  из-за растворимости кремнезема при рН 7 и выше. .

Пример 1, Получение носител , активированного эпоксидной смолой с последующим затвердением полиэтиленполиамином.

Дл  получени  носител  провод т пропитывание кремнеземного материала раствором ЭПОКСИДНОЙ смолы и затем затвердение водным раствором полиэтиленполиамина , который беретс  в количестве 25% от эквивалентного количества эпоксидной смолы.

5 г силохрома или силикагел  смачивают 9 мл раствора 1,7% эпоксидной смолы в ацетоне. После вьтаривани  растворител  при 100°С провод т затвердение 15 мл водным раствором прл1{этиленполиамина кип чением при lOO-c в течение 1 ч. Затем

носитель фильтруют, промьшают водой и высушивают в терйЬстатё при 100° С..

Способность используемой эпоксидной смолы к прив зыванию амина составл ет 2500 мк экв./г (определена кип чением смеси смолы с избытком амина при в течение 1ч и обратным титрованием непрореагировавшего амина кислотой). 5 г носител  покрываетс  0,153 г (90,017) смолы, способность к прив зыванию амина которой составл ет 383мкэкв/г. (о,1532500), и необходимое количество полиэтиленполиамина, содержащеес  в 15 мл раствора, составл ет 7,2 мл (0,25383-75).

Получают активированный носитель, содержащий на поверхности эпоксидные группы в количестве 65 мк экв на i г носител  (определено по способу, описанному в данном примере).

Пример 2. Получение носител , активированного эпоксидной смолой с последуницим затверденией 1,6-гексаметилендиамином .

Дл  получени  носител  провод т пропитывание кремнезёййого материала раствором эпоксидной смолы и зачтем затвердение водным раствором 1,6-гексаметллендиамина , который беретс  в количестве 25% от эквивалентното количества эпоксидной смолы.

5 г силохрома Или силикагёл  смачивают 9 мл раствора 1,7% эпоксидной смолы в ацетоне. После вьтаривани  растворител  при провод т затвердение 15 мл водным раствором I,6-гексаметилендиамина кип чением при в течение 1 ч. Затем носитель фильтруют, промывают водой и высушивают в термостате при 100 С.

При использовании эпоксидной смолы со способностью к прив зьтанию амина 2500 мк экв/г необходимое количество 1,6-гексаметилендиамина, содержащеес  в 15 мл раствора, составл ет 5,6 мг (0,25-383 58).

Получают активированный носитель, содержащий на поверхности эпкосидные группы в количестве 50 мк экв на 1 г носител .

Пример 3. Получение нерастворимого ферментного препарата с использованием носител , акФивированного эпоксидной смолой с последующим затвердением полиэтиленполиамИном.

5 г активированного эпоксидной смолой носител  (пример О смачивают 8 мл боратным буфером с рН 8,0. Смесь педемешивают и вакуумируют 15 мин дл  удалени  воздуха из пор. Затем добавл ют 5 мл раствора химотрипсина с концентрацией 40 мг/мл в боратном буфере с рН 8,0, перемешивают и выдерживают при в течение 2 ч. После инкубации препарат промывают в воронке Бюхнера боратным буфером рН 8,0, 1 М раствором хлористого и затем еще боратным буфером, добавл   эти растворы порци ми. Объем промывных вод состал ет 100 мл. Полученный иммобилизованный препарат хран т в боратном буфере в холодильнике.

Ферментативную активность пре-. парата определ ли на 2% раствора казеина. Активность равн лась 39,7 Е/г. Стабильность препарата оценивали по остаточной активности после проведени  промьшки препарата 100 мл 2%-ным раствором казеина рН 8,О в колонке с диаметром 6 мм и высотой столба препарата 70 мм в течение 24 ч. После такой промывки сохран лось 29% от исходной активности .

Пример 4. Получение нерастворимого ферментного препарата с использованием йосител , активированного эпоксйдной смолой с последующим затвердением 1,6-гексамет,иледиамином .

5 г активированного эпоксидной смолой носител  (пример 2) смачивают 8 МП боратным буфером с рН 8,0. Смесь перемешивают и вакуумируют 15 мин дл  удалени  воздуха из пор. Иммобилизацию фермента провод т как описано в прийерё 3. Получают препа химотрипсина с активностью на 2% каина 36,7 Е/г. После промывки препарата 2%-ным раствором Казеина сохран лось 20% исходной активности.

Claims (2)

1. Йредлагаемый способ позвол ет получать носители дл  иммобилизации биоактивных веществ с повышенной операционной стабильностью, в которых внутренн   поверхность пор покрыта слоем нерастворимого полимера содержащего эпоксидные группы, дающие возможность иммобилизации ферментов в укрупненнолабораторном масштабе, в том числе и ферментов, нуждающихс  в высоких значени х рН. . 7 Такой способ дает возможность получить препараты XHMOtpHnaHHa, сохран ющие активность при 4С в течение 1-2 мес цев, что  вл етс  предпосьшкой дл  достижени  высокой операционной стабильности препара овТ Данный способ позвол ет по срав .нетшю с известным способом св зыва ть в Т0-2б раз больше белка на единицу носител , Формула изобретени  . Способ получени  активированных нЬсителей дл  иммобилизации белков путем пропитки пористого неорганического материала органическим пленкообразующим вёществом, содёржащим реакционноспособные группы, . . . - -- : 8 отличаю; щийс  тем, что, с целью повышени  оп ерационной стабильности получаемых материалов, при покрытии пористого неорганического материала с диаметром пор 200-2000 А в качестве пленкообразующего вещества используют эпоксидную смолу и отверждают ее на носителе по иэтиленполиамином или 1,6-гекс .аметилендиамином в соотношении эквивалентов эпоксидной смолы и амина 1:0,25 при 100-120 0 в течение не менее 1ч. Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе 1, Патент № 2229298, кл. С 07 G 7/02, опублик. 1974.
2. 2. Патент Великобритании № 1342186, кл. С 08 Н 1/02, опублик. 1973 (прототип).