JPS59112260A - クロマトグラフイ−の担体材料 - Google Patents

クロマトグラフイ−の担体材料

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JPS59112260A
JPS59112260A JP58228305A JP22830583A JPS59112260A JP S59112260 A JPS59112260 A JP S59112260A JP 58228305 A JP58228305 A JP 58228305A JP 22830583 A JP22830583 A JP 22830583A JP S59112260 A JPS59112260 A JP S59112260A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明分野 本発明は液体クロマトグラフィーに有用な被覆された担
体材料およびこの材料の製造方法に関する。より詳細に
は、本発明は、高速液体クロマトグラフィーに適した担
体材料に関する。
発明の背景 イオン交換はたん白質混合物の分離に用いうる最も有用
な技術の一つである。大部分のたん白質は等電点が６よ
りも低いので、通常陽イオン交換よりも陰イオン交換が
より有用である。しかしながら、陽イオン交換によって
最良に分離される多数のたん白質混合物がある。
たん白質の陽イオン交換に最も広く用いられる材料は、
カルボキンメチル基を’［るセルロースまたはデキスト
ランである。これらの材料は親水性σク一般的要件およ
び通常のたん白質クロマトグラフィーに必要な高い能力
な示す。
広い表面積を有する微細なカラム充填材の使用を含む最
近のクロマトグラフィーにおける発展によって、高速液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）として知られている
技術が開発された。現代のＨＰＬＣにおいては、クロマ
トグラフィーカラム内で数千ｔｂ／ｉｎ　　の圧力がし
ばしば生じる。このことは、カラム充填材が剛く、つぶ
れないものであることを必要とする。今まで、たん白質
陽イオン交換に用いられてきた炭水化物を主体とする材
料は、結果として伴う高圧力に耐えることができないの
でＨＰＬＣ中での使用には適さない。この要求を満たす
材料を得るため、これまで多孔性の無機材料が、たとえ
ばシリカおよびアルミナが、この表面上の有機固定相を
有する担体材料として利用されて穏々のクロマトグラフ
ィーカラム充填材料が得られている。最近この目的のた
めに親水性の有機担体が開発されている。しかし、これ
らの充填材の圧力限界が無機物を主体とする材料のそれ
よりもまだ多少低いので、それらの応用は制限される。
更に、これらの材料では、無機担体材料に比べて孔径お
よび粒径を広い範囲で手に入れることができない。
たん白質のＨＰＬＣＫ用いるための無機担体に必要とさ
れることは、その材料が微細粒子、親水性および粗大孔
であるとい５ことである。陰イオン交換物質ではこれら
の要求を満たすものを入手しつるが、このような場イオ
ン交換物質を最近まで入手できなかった。ガラスは本来
陰イオン性であり、多孔性ガラス玉はたん白質の陽イオ
ン交換に用いられてきた。しかしながら、ガラスは多く
のたん白質と不可逆的に結合するので、完全に受は入れ
られ得る物質ではな贋。陽イオン交換は、無機担体表面
上の親水性有機被覆中の陰イオン性基によって最もよく
行われる。このような材料は米国特許第４，１０８，６
０３号明細書に開示されている。
この材料は製造するのに数段階を要し、また再生するの
が困難であるといういくつかの欠点をもっている。ポリ
エチレンイミン−ジグリコール酸無水物を主体としたよ
り有望な被覆体が開発され、この材料を主体とした担体
材料を市場で入手することができる。
短いポリマーを用いて無機クロマトグラフィー担体用の
被覆を製造するのが有利であることが研究によってわか
った。担体表面とはよく反応するけれどもそれ自体とは
反応しないポリマーは、自己形成性被覆となるであろう
。このような被穆は再生可能であり、無機表面を均一に
覆う。また被覆は孔を塞がないし、無機の粒子を互いに
接合させない。
本発明により、再生性が高くかつ高速液体クロマトグラ
フィーに必要とされる要件を満たす自己形成性被覆がつ
くられる。
発明の概要 本発明により、被覆された担体材料の製造方法が提供さ
れる。その方法は、表面にアミン官能基を有する基体を
用意する工程、アミノ基および基体とポリマーとの反応
を促進させるような条件下でスクシンイミド単位を持つ
ポリマーと基体とを接触させる工程からなる。ポリマー
は基体との反応前または反応後に誘導体化して種々のク
ロマトグラフィー担体材料とすることができる。また本
発明は、スクシンイミド単位またはこれらの単位の誘導
体を有するポリマーで被覆された基体よりなる担体材料
をも提供する。
全般的説明 本発明は、基体を液体クロマトグラフィー用の担体材料
に変換させる自己形成性被覆についてである。本発明は
、たん白質のための陽イオン交換物質を製造するのに用
いると特に有利である。担体材料はスフクンイミド（無
水アスノぐラギン酸）単位を含むポリマーで基体を被堕
することによって製造される。スクシンイミド単位は、
これを加水分解してたん白質用の陽イオン交換物質をつ
くることもできるし、あるいは誘導体化して他の種々の
液体クロマトグラフィー技術への利用性を有する担体材
料を製造することもできる。
ポリスクシンイミド（ポリ無水アスノぐラギン酸）は、
陽イオン交換被覆に理想的な材料である。ポリスクシン
イミドを、表面のアミノ基との反応によって表面に固定
することができる。あるいは、アミノ−７ランのような
カップリング剤がまずポリマーと反応し、その反応生成
物が基体と反応してもよい。しかしながら、最初にカッ
プリング剤が基体と反応することが好ましい。陽イオン
交換の可能性のある基はポリスクシンイミドの一部であ
るから、陽イオン交換物質を製造するために、さらに反
応を必要としない。材料のこの特性によって再生性が高
められる。かくしてポリマー中の残余スクシンイミド基
の加水分解によって、固定されたボリアスノクラギン酸
が製＠される。この被覆は、親水性ポリペプチドマトリ
ックス中に多くのカルホキノル基を含んでいるので、た
ん白質のクロマトグラフィーに有用である。
固定ポリアスノセラギン酸は、たん白質のＨＰＬＣ用陽
イオン父換物質として非常に有望である。担体材料の製
造は簡単であり、高品質の物質を均一に再生し得る。こ
の材料を充填したカラムは、容置、選択性、酵素活性の
回復およびピーク形状の点で優れた性能を示す。
有機被覆は、反応性のカップリング剤を使用することに
よって基体に固定される。適当な無機基体には、ガラス
、ノリ力、アルミナおよびチタニアで作られた基体があ
る。有機基体もまた選択し得ル。ポリスチレン、ポリメ
タクリレートおよびポリアクリレートのような物質を剛
いることができる。無機基体の場合のカップリング剤と
してはアミノーンランが代表的である。しかしながら、
基体および有機被覆の両方に結合できる物質であれば何
でもこの目的に使用することができる。適当なカップリ
ング剤の代表的な例は３−アミノプロピルトリエトキジ
シランである。
ぽリアスノぐラギン酸はおそらく１分子につき数ケ所で
基体表面と結合しているであろう。これは６島”型被覆
であろう。なぜなら個々のポリマー分子は、架橋して連
続的な網状構造にはなっていないからである。それにも
かかわらず、表面は、均一に覆われていると考えられ、
被覆は非常に丈夫である。被覆の高いイオン交換能力と
吸着したたん白質の離脱の容易性は、その親水性、ポリ
ペプチドの特性および固体表面から離れている分岐端部
位にイオン化基が位置しているという点に帰因するだろ
う。このよ５な゛毛羽立ち”被覆は広い表面積を持ち、
たん白質クロマトグラフィーにおいて良好に作用する。
このヘモグロビンイオン交換能力（ＩＥＣ）は、上記で
参照したポリエチレンイミン−２グリコール酸無水物の
それよりも数倍高い。これは、おそらく基体表面から孔
の中央に十分突き出たポリアス・ξラギン酸の長いねじ
れた枝によるものであろう。この構造は、表面により配
向した他の被覆よりもはるかに広い表面積を持つのであ
ろう。
ポリアスパラギン酸被覆は、ノ々ツチ操作で無機基体上
に形成せしめることもできるし、あるいは、前もってカ
ップリング剤で処理した無機基体のカラムを介してポリ
スクシンイミド尋液を循環させることによって、同時に
形成せしめることもできる。どちらの場合も、ポリアス
パラギン酸は、固定ポリスクシンイミドを加水分解溶液
で処理することによって製造される。同時形成の場合は
、カラムを通して溶液を循環する。両方の製造方法の例
をあとで述べる。同時形成された被覆で製造したカラム
は、パッチ法で製造した材料を充填したカラムよりも能
力および分離度がわずかに低いことが見い出された。
ポリスクシンイミドは、陽イオン交換体のほかに種々の
クロマトグラフィー担体を製造するのにも使用すること
ができる。ポリスクシンイミド−シリカの反応性は、ポ
リアスパラギン酸−シリカ以外の誘導体への便利な経路
を提供する。中性の双性イオンであるポリ−２−アミノ
エチルアスパラギン酸アミＰ−シリカは、たとえば立体
選択的クロマトグラフィーに用いることができる。アミ
ｙ’ｂ３がＮ　、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
　溶液中で容易に付加してポリーα、β−Ｄ、Ｌ−アス
ノξラギン酸アミドとなるので、そのような誘導体は容
易に調製されろ。アミン含有化合物を、固定前または固
定後のいずれかにおいてスクシンイミド残基と反応させ
ることができる。小さな分子の場合には、固定前に反応
させる力がより再生性のよい生成物を得る。固定後の反
応によって、ポリペゾチドマトリックス上に固定化酵累
の手段が提供される。また種々の配位子をポリスフノン
イミド被覆に付加し、親和性クロマトグラフィーに有用
である物質に変換することもできる。被覆のポリペプチ
ドの特性によって、この利用には良好な性能が与えられ
るはずである。この物質について一つの問題は、見たと
ころ被覆中にいく分かのアス、ｅルチル基が存在するの
を避けることができないということである。この基の影
響は、親和性配位子または酵累と共に、被覆にエチレン
ジアミンを加えることによっておそらく中和され得る。
ポリスフノンイミド被覆中にスルホネート基またはホス
ホネート基を組み入れることによって強い陽イオン交換
物質が生成する。このものは２−アミノエチルホスホ／
酸またはタウリンを、固定化されたポリスクシンイミド
と反応させることによって得ることができる。他の基を
組み入れることによってクロマトグラフィーに有用な物
質が得られるはずである。
第１図はアス・ξラギン酸からポリスクシンイミドへの
変換を示す。ポリスクシンイミドは、アスパラギン酸を
濃縮するような条件下で加熱することによってほとんど
定量的に形成される。
第２図はポリアスパラギン酸−７リカを製造するのに採
用される方法を示す。大部分のたん白質を自由に孔内部
に入れるに十分な広い孔を有する微粒子のシリカゲルを
選択した。シリカゲルにアミノプロピル基が共有結合し
た被覆を形成した。
次いで、ポリスクシンイミドはアミノ基と反応した。こ
のことによって、ポリマーがアミド結合を介して表面に
固定されたポリスクシンイミド−シリカが製造される。
次いで、未反応のスククンイミド環を塩基触媒で加水分
解処理することによってポリアスパラギン酸被覆が生じ
る。
■ アミノプロピル−シリカの製造 パイダック（ｖｙｄａｃ、商標）シリカ４．０９を秤量
して大きい試験管に入れ、３−アミノゾロビルトリエト
キ７ノランの５％（Ｗ／Ｖ））ルエン溶液３０祷で覆っ
た。混合物を渦発生器上で混合し、次いで側枕間真空下
（小さなポンプに接続した一個のホールストツノξ−に
よる）において、シリカの孔から空気を除去した。混合
物を、沸騰水浴中で時々かきまぜながら２時間加熱した
。生成物を中位の多孔性焼結ガラスのじょうごに集め、
トルエンとアセトンで充分洗浄した後、連続吸引で乾燥
した。
ポリスクシ／イミドの製造 り、Ｌ−アスノξラギン酸５０＆　（０−３８モル）を
結晶皿上に薄層状にのせ、オーブン中、１９０℃で力時
間加熱した。得られた淡黄かっ色粉末は３７．９９（生
成物の単位分子量が９７と仮定すると、脱水が実質的に
定量的に行われたことを示す）であった。粉末は、少量
の白色物質を除いてはＤＭＦ１５０Ｍ中に加熱下で溶解
した。この物質を遠心分離で除いて茶色の溶液が残った
。ＤＭＦ溶液を４倍量のジエチルエーテル中に激しく攪
拌しながら注ぎ込み、沈殿生成物を遠心分離で集めるこ
とによってポリスクシ／イミドな得た。ノエチルエーテ
ルのかわりに水な用いてポリスクシ／イミドを沈殿させ
ることも可能である。沈殿は数回沈殿溶媒を用いて振り
、次いで再沈降させることによってＤＭＦを除去する。
次いで沈殿物を残液性化して完全にＤＭＦに溶解する淡
黄かっ色粉末を得た。この生成物の分子量はほぼ１３，
０００と測定された。水を用いてもエーテルを用いても
本発明の目的に許容できる生成物が得られるが、エーテ
ルからの方がすばやく沈殿し、またエーテルを使用する
とスクシンイミド環の一部が加水分解する可能性が排除
される。
ポリスクシ／イミド−シリカの製造 アミノゾロビル−クリ力４．０ｇを、ポリスクシ／イミ
ドの５％（Ｗ／Ｖ）ＤＭＦ溶液２０祷中で上記のように
して攪拌し、脱ガスした。混合物を時々攪拌しながら室
温で別時間放置した。黄かつ色の生成物をじょうごに集
めてＤＭＦおよびアセトンで洗った。
ポリスクシ／イミドと表面のアミノプロピル基との反応
によって遊離アミノ基がなくなる。消失速度はピクリン
酸を用いた分析で測定することができる。この分析によ
って、ピクリン酸との可逆的イオン対の形成による固体
表面上の反応しうるアミノ基の定置をすることができる
。この分析の詳細は、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏ
ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、　１８５　（１９７９）３７５
−３９２に記述されている。アミノプロピル−シリカの
試料をポリスクシンイミドの５％溶液中に浸し、反応時
間を最適なものとするために種々の時間で分析に供した
。第３図では、その反応が０．５時間以内にほぼ完結す
ることを示している。
表面全体の被覆は、２４時間反応を継続することによっ
て達成され得る。
アミノゾロビル−シリカとの反応に用いるべきプリスク
シンイミド浴液の濃度もまた最適なものにする。何種類
かの濃度の浴液を用い、２４時間の反応でポリスクシン
イミド−クリ力を製造し、生成物を後述の如く加水分解
してポリアスパラギン酸−シリカとした。ヘモグロビン
に対するイオン交換能力（ＩＥＣ）を利用して生成物の
性質とポリスクシンイミド被覆の品質との関連を明らか
にした。第４図は、ポリスクシンイミド濃度を１％から
２％に高めた時は被覆にいく分か違いがあるが、濃度を
２％から５％に高めた時にはほとんど違わないことを示
している。従って再生性のある被拶を比較的短かい時間
で生成させるためには５％溶液が適切である。
ポリアスノξラギン酸−７リカの製造 ＤＭＦ　１５成、水［Ｏ祷、β−アラニ／　０．８２５
　ｇ（９、３ｍｍｏｌ　）およびトリエチルアミ１０．
６２５＋ｄ（４，５ｍｍｏりを含む溶液中でポリスクシ
ンイミド−ノリ力４．０．９を前述のよ５にして攪拌し
、脱ガスした。混合物を時々かきまぜながら室温でｕ時
間放置した。この処理によって、処理前の材料の黄かつ
色の色彩がほとんどなくなる。淡黄かっ色生成物をじょ
うごに集め、水、０．０５モルのＨＣｌ。
水およびアセトンで洗浄した。次いで生成物を連続的吸
引で乾燥した。
β−アラニンはポリスクシンイミドと反応してポリ−２
−カルボキ７エチルアスパラギン酸アミドとなることが
報告されている。未反応のス、クシ：ンイミド残基の次
の加水分解は、塩基性のトリエチルアミンで触媒される
。この反応は陽イオン交換物質への可能性のある経路と
して研究されてきた。表１はポリスクノンイミドーノリ
カから製造される伺種類かの生成物のヘモグロビンＩＥ
Ｃを示づ−。β−アラニンとスクシンイミド残基との反
応は、トリエチルアミ／の存在下におけるそれらの加水
分解よりもはるかに緩慢であり、かくしてここで生成し
た被覆は生としてポリアスパラギン酸であってポリ−２
−カルボキクエチルアスパラギン械アミドではない。ト
リエチルアミ／溶液中にβ−アラニンを含ませろとＩＥ
Ｃがわずかに高くなった生成物が得られるので、加水分
解溶液にはβアラニンを一定の手順で加える。触媒がな
い場合には被覆の加水分解が緩慢であることは表１から
明らかであり、この加水分解は水のみの中で行うよりも
ＤＭＦ／水系中で行う方が緩慢である。しかしながら、
触媒を存在させた加水分解の場合にはＤＭＦ／水啓液中
の方が早い。表１かられかるように、未処理のポリスク
ノンイミドークリカは控えめなヘモグロビンＩＥＣを有
する。このことはアス、ｏルチル基がＣ−末端と共にポ
リマー中央にも存在することを反映しているのかも知れ
ない。
表　　　　１ ポリスクツ／イミド−シリカから製造される陽イオン交
換物質に対する添加物の影響 １２ｏｒｎ９−ｆつのポリスク７／イミドーノ々イダツ
ク（Ｖｙｄａｃ）を溶媒４，４嶋中で攪拌し、脱ガスし
た。溶媒は水、またはＤ■’２．５ｍＪ＋水１．８縦で
あった。前記したように、β−アラニ／１４７ダおよび
（または）トリエチルアミ７１１１ｍｇを溶媒中に存在
させた。混合物を時々攪拌しながｂ室温で１５時間放置
した。？り了スノξラギン酸−ノリカの場合のようにし
て生成物をろ別し、洗浄した（例参照ン。
十　　　　　　　　＋　　　　　　　　３８２ＤＭＦ　
　　　＋　　　　　　　　　　　　　９５＋ −＋　　　　　３６５ 水 ＋　　　　　　　　＋　　　　　　　　３７０＋　　　
　　　　　　　　　　　　　１５８水 −−）−３０５ ポリスクシノイミド被覆をポリアスノぐラギ／酸被覆に
加水分解すると多くのカルボキシル基が生ずる。加水分
解に必要な時間を決定するためにはこれらのカルボキシ
ル基の濃度を知ることが有用である。不都合にも、ピク
リン酸分析でアミノ基を定量するような方法で簡便にカ
ルボキシル基を定量できる分析法はない。もともと存在
するシリカ中のンラノール基が、水溶液滴定によるカル
ボキシル基の定量を妨害するのである。
被覆中のカルボキシル基の濃度は、間接的な方法で算定
することができる。ポリスクシ／イミド−シリカとエチ
レンジアミンとの反応によってアミノエチル基な有する
被覆が生じる。これらはピクリン酸分析で定量すること
ができる。ただ一つのアミノ残基のみと反応して両方の
アミノ残基とは反応しないようにするため（この場合に
は単にアミド結合によって被覆を架橋するだけでビクリ
／酸対イオン化能力（ＩＰＣ）は変化しない）、エチレ
ンジアミ／−塩酸塩が用いられる。
第５Ａ図は反応の進行度対時間を示す。反応は２４　時
間ｉに、ポリスククンイミドーゾリカ１ｇについてエチ
レンジアミン０　、２６　ｍ　ｍｏｌが付加してほぼ完
結する。これは加水分解しつるスクシンイミド残基の下
限を示している。なぜなら、この方法では次の型の残基
は測定されないからである。
（ａ）　　エチレンジアミンと架橋反応をし、先端が離
れた付加はしない残基 （ｂ）　　反応前に存在するアスパルチル基（Ｃ１ｍ基
性のエチレンジアミンによって触謀されてアス・ξルチ
ル基に加水分解される残基生成物であるポリ−２−アミ
ノエチルアスノぐラギンアミドー／リカはヘモグロビン
ＩＥＣがほとんどない（後の表２参照）。このことシま
、被覆中には充分なカルボキシル基があって生成物に中
性の双性イオノ的性質を与えてＶ）ることを示している
。
ポリアスパラギ／酸−７リカ中のカルボキシル基の６度
はおそらく約帆４ｍｍｏｌ／ｌ／材料である。これはｖ
ｙｄａＣＴＰ（ここでは７リカが用いられる）をベース
として単一層のポリエチレンイミノ被覆を有する陰イオ
／交換物質中に存在するイオン交換部の濃度とほぼ同じ
である。このことはボリアス・ぐラギン酸被俊が非常に
薄いことを示している。
被徨の加水分解速度は、加水分解が進行するにつれてヘ
モグロビンＩＥＣが増大するとい５箇二の間接的方法に
よって追跡し得る。第５Ｂ図は加水分解溶液中の二種類
の異なったトリエチルアミン濃度における加水分解の時
間進行度を示す。速度は８倍分だけ異なり、かつ溶液中
のヒドロキシル基の濃度の相違に直接比例する。高いｐ
Ｈにおいては、加水分解はＵ時間で完結すると考えられ
る。
しかしながら陰イオン交換７リカについての研究では、
−たん表面のイオン交換部がある濃度に達するとヘモグ
ロビｙ　ＩＥＣは一定になり、更に濃度が増加してもほ
とんど影響をつげないことがわかった。かくして加水分
解速度は第５Ｂ図で示した速度よりも緩慢たり得る。他
方、塩基に艮時間さらしておくと７リカが宕解する原因
となり得る。
それ故、加水分解は調時間行うのが反応の完全性に対す
る要求と、担体σ〕保全に対する要求との間の適切な妥
協点であると考えられる。
ポリスクノンイミドー／リカの誘導体 ポリスククノイミドークリ力の反応性によって多種類の
官能基が被覆中に組み込まれ得る。表２はエタノールア
ミンとの反応生成物（後述するエチレンジアミン塩酸塩
との反応の場合と同様にして製造される〕、エチレンジ
アミン塩酸塩との反応生成物およびポリエチレノイミン
６　（ＰＥＩ６、分子量がほぼ６００のポリエチレ／イ
ミ／）との反応生成物の各イオン交換特性を示す。ポ！
Ｊ　ＰＥＩアス・ξラギンアミドークリカは低分子およ
びたん白質の両方についての陰イオノ交換物質であり、
ヘモグロビンに対するイオノ又換能力（ＩＥＣ）は、Ｐ
ＥＩを薄膜状に被覆した陰イオ／交換ンリカのＩＥＣの
たった５８％に丁ぎなＶ）。このことは被櫟中にカルボ
キシル基が存在することを反映している。
同様に、中性であるべきポリ−２−ヒドロキ７エチルア
スノξラギンアミドーシリカは多少のヘモグロビン＠イ
オ／父換能力を有している。ポリ−２−アミノエチルア
スパラギ／アミドーノリカはカルボキシル基に釣り合う
のに充分なアミン基を有していると考えられ、前述した
ように中性の双性イオノ的被覆が得られる。
担体材料に官能基を加える別の方法は、ポリスフフンイ
ミドの固定に先だって官能基を組み入れる方法である。
これはある場合には、固定後に組み込んだ時よりもより
再生性のよい生成物が得られるであろう。固定前紡導体
化はポリマーと架欄してはならず、かつ固定化できるに
十分な遊離のスクシンイミド残基な残していなければな
らない。
この方、去はポリスフフンイミドにエタノールアミンお
よびトリス（ヒドロキクルメチル）アミノメタン（トリ
ス〕を付加させて実験した。得られたポリマーは、陰イ
オン性となる可能性のある残基な使って生じる中性で親
水性の残基をいくらか含む。表３はこれらの誘導体化さ
れたポリマーを用いて製造したポリアスパラギンアミド
−７リカのＩＥＣを示す。予想される如く、付加物はヘ
モグロビンＩＥＣを減少させるが、その効果は付加物の
割合が５％を越えると著しくなくなった。これらの誘導
体の製造方法は後述する。
表　　　　３ ポリスクシ／イミド誘導体について製 造した生成物 付加％　　　　０　　　５１０　　　５１０２０ポリ−
２−アミノエチルアスパラギンアミド−シリカは、溶液
がエチレンジアミン帆２ＦＭＪ（３，７ｍｍｏｆ）、エ
チレンジアミンニ塩酸塩帆５０．９（３，７ｍｍｏｌ　
）　、　ＤＭＦ　’ＸＪｍｌおよび水４祷よりなるもの
である点を除いてはポリアスノぐラギン酸−７リカの製
造方法と同様の方法を用いて製造した。生成物は、　０
．０５ＭのＨＣｔのかわりにトリエチルアミンの飽和水
溶液で洗浄した。
ポリ１）ＥＩアスノぐラギンアミドー７υ力は、ＤＭＦ
　：水が１：１である溶媒中におけるＰＥＩ　６の５％
（Ｗ／Ｖ）浴液よりなる溶液である点を除いてはポリア
スパラギ／酸−７リカの製造方法と同様の方法を用いて
製造した。混合物は４６時間反応させ、生成物は０．０
５　ＭのＨＣｔのかわりにトリエチルアミ／の飽和水溶
液で洗浄した。
固定化に先立ってポリスフフンイミドを誘導体化する場
合を例示するため、エタノールアミンおよびトリスをそ
れぞれＤＭＦ２．５祷に溶解してスクシンイミド残基を
０．５．１０および加モル肖量％含む溶液を製造した。
ポリスクツ／イミド溶液および付加物溶液の両方を５°
Ｃに冷却した。次いで付加物溶液を攪拌中のポリスクツ
／イミド溶液に滴下し、室温で３時間放置した。溶液は
、存在する付加物の鼠に比例してほとんどただちに黒変
した。付加物のない溶液にはＤＭＦ２．５ｍＡだけが入
っていた。アミノゾロビル−ｖｙｄａＣの試ｆｉ４１４
０ｍ９を誘導体化したポリスクツ／イミド溶液の一つの
中でそれぞれ脱ガスし、攪拌した。それらを１２時間後
には攪拌をしながら室温で調時間放置した。
次いで中間生成物をろ別し、Ｄ■゛およびアセト／で洗
浄した後、連続吸引で乾燥した。残余スクシンイミド残
基は、前のポリアスパラギン酸−７リカの製造において
述べたようにβ−アラニ／およびトリエチルアミン溶液
で加水分解した。
応用 たん白質混合物は、カルボキンメチル型４ＨＨＣついて
採用される勾配に類似の勾配を用いてポリアスノξラギ
／酸−ンリカのカラム上で良好に分離される。カラムは
高い能力と選択性を示す。第６図は等電点が４．７から
１１を越える範囲の何種類かの標準たん白質の分離を示
す。ピークは鋭く、テーリングは最小である。
実際のヘモグロビン試料はしばしば陽イオン交換カラム
によって分析される。ポリアスパラギン酸−７リカの機
能はこの応用に特に良好である。
第７図はＡＦＳＣヘモグロビン標孕のプロフィルである
。第８図は第７図におげろよりも浅い勾配を用いて生じ
させたノーマルへモグロビ；／　ノ形状−ｃ−ある。第
９図および第１０図は赤血球鋸状形成傾向に対してそれ
ぞれへテロ接合性およびホモ接合性ＣＤ、個体ヘモグロ
ビンのプロフィルである。ヘモグロビンＡ。、Ａ２およ
びＳの領域においては優れた選択性が認められ、５ミク
ロン充填のカラムを用いるとさらに良好な分析結果が得
られる。臨床的に意義深いいくつかの突然変異体へモグ
ロビ／形の分析にとってこのことは重要である。たとえ
ば、ヘモグロビンＥおよびＡ２は他のイオノ交換物質で
は分離されないが、ポリアスパラギン酸−シリカで分離
される。
ポリアス・ξラギン酸被覆は非常に安定である。
カラムは数百時間使用を継続しても有効性と能力は減少
しない。ある場合には、カラムのたん白質保持力は使用
の最初の１００時間の間に５％だけ増大する。これは残
余スタフ／イミド残基の加水分解が進行していることを
反映している。あるいは、被覆の外側に向けて分校末端
部の向きかえがおこり、その表面積が増大するのかも知
れない。この過程はカラムを強い緩衝液で数時間溶出さ
せることによって促進される。
ポＩ７７スパラギ／酸−７リカのカラムは酵素活性の高
い回復を示す。いくつかの酵素がぼりアスパラギン酸−
シリカのカラムに適用され、カルホキツメチル−セルロ
ースにおいて用いられる勾配と同様の勾配で溶出されろ
。アデニルコハク酸塩ン／セターゼ、チオラーゼエ、お
よびβ−ヒドロキシアンルー〇ｏＡデヒドロゲナーゼは
適用活性を定量的に回復して溶出された。この高い回復
性は被Ｇのポリペプチド特性を反映しており、この特性
は、変性の原因となることなく被覆を酵素との相互作用
に適したものとしている。
前記した発明は特定の態様によって例示されてきたが、
本発明の範囲をこれに限定する意図はない。当業者にと
って本発明の修正および変形は明白であろ５゜特許請求
の範囲に記載した事項は、本発明の真の精神および範囲
に該当するよ５な等価な修正および変形をすべて含むも
のと考えられる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、アスパラギン酸からポリスクン／イミドへの
変換を示す説明図である。 第２図は、ポリスク／ノイミドとアミノプロビルクリ力
との反応および残余スフノンイミド単位のその後の加水
分解を示す説明図である。 第３図は、ピクリン酸との対イオン化容量（ＩＰＣ）Ｋ
よって決定した、ポリスクンンイミトとアミノプロピル
−シリカとの反応速度を示す線図である。 第４図は、ヘモグロビンイオノ又換能力（ＩＥＣ）によ
って測定した、ボリスク７／イミド浴液濃度を変化させ
ることによるポリアスノξラギ／酸−７リカ材料の品質
に対する影響を示す線図であ７：＋。 第５Ａ図は、ポリスフノンイミド−シリカとエチレンジ
アミンとの反応速度（ｐＨ＝　９．３Ｊ　ヲ示ｊ線図で
ある。 第５Ｂ図は、ポリスク／ノイミドーノリ力からポリアス
パラギ／酸−７リカへの加水分解速度を示す線図である
。 第６図は、たん白質標準の陽イオン−交換クロマトグラ
フィーを示す線図である。カラム：ホ１）アスパラギン
酸−Ｖｙｄａｃ　（１０ミクロン）、加×０．４６α。 試料：オノ々ルプミ／１２．５μｇおよび他のたん白質
をそれぞれ５μｇ含む弱緩衝液δμｔ０流速：１ｍ６／
分。溶出＝８０分。直線勾配ｏ　−ｉｏ。 ９強緩衝液。検出：　Ａ２２０＝１．０ａ、ｕ、ｆ、ｓ
−０弱緩衝液：　５０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ＝　６
−００強緩衝液：５０ｍＭ　＋　０．６　Ｍ　ＮａＣｌ
　。 第６図中のビークとそσ〕同定。 ピーク　　　　　　同　　　定 ａ　　　オパルブミ／ ｂ　　　パシトラミン Ｃミオグロビ／（マツコラクジラ） ｄ　　　キモトリプシノーゲンＡ ｅ　　　還元型ブトクロームＣ（ＥＱＵＩＮＥ）ｆ　　
　リボヌクレアーゼＡ ｇ　　　酸化型チトクロームＣ（ＥＱＵＩＮＥ）ｈ　　
　リゾチーム 第７図は、ＡＦＳＣヘモグロビン標準の陽イオン交換ク
ロマトグラフィーを示す線図である。試料：１４倍に希
釈した標準ＡＦＳＣ溶液るμｔｏ　浴出：３２分。直線
勾配、２２−１００％強緩衝液。検出二Ａ４□５＝０．
２ａ、ｕ、ｆ、ｓ、。カラム：ポリアスパラギン酸−ノ
リ力、１０ミクロ／、２０Ｘ０．４６ｃＩｒＬ０弱緩衝
液：４０ｍＭビス−トリス−ＣＩ　＋４０ｍＭ　ＫＣＮ
、　ｐＨ＝　６．５゜強緩衝液：同上＋０．２Ｍ　Ｎａ
Ｃ１，ｐＨ：＝５．８゜第７図中のピークとその同定。 ピーク　　　同　定 ａ　　　　ＨｂＡ□。（？） ｂ　　　　ＨｂＦ Ｃ未　　知 ｄ　　ＨｂＡ。 ｅ　　ＨｂＡ２ 　　ＨｂＳ 　　ＨｂＣ 第８図は、ノーマルヘモグロビンのクロマトグラフィー
を示す線図である。試料：３７倍に希釈したヘモグロビ
ン溶液５μｔｏ俗出：１４０分。直線勾配、２５−１０
０％強緩衝液。その他の条件は第７図と同じ。 第８図中のピークとその同定。 ａ、ｂ　　　　　ＨｂＦ ＣＡ。 ｄ　　　　Ａ２ 第９図は、赤血球錐状形成傾向に対してペテロ接合性の
個体からのヘモグロビンのクロマトグラフィーを示す線
図である。試料：２３倍に希釈したヘモグロビン溶液乙
μｔ０条件：第８図参照。 第９図中のピークとその同定。 ピーク　　同定 ａ、ｂ　　　ＨｂＦ ｃ　　　ＨｂＡ□ ｄ、　ｆ　　　　副ＨｂＳ型 ｅ　　　ａｂＡ２ ｇ　　　ＨｂＳ 第１０図は赤血球錐状形成傾向に対してホモ接合性の個
体からのへモグロピ／のクロマトグラフィーを示す線図
である。試料：３４倍に希釈したヘモグロビ／溶液５μ
ｔ０条件：第８図参照。 第【０図中のピークとその同定。 ピーク　　　　同　定 ａ、ｂ　　　　ＨｂＦ ｃ％ｄ％ｆ　　　副ＨｂＳ型 ｅ　　　　　ＨｂＡ　２ ｇ　　　　　ＨｂＳ 出願人代理人　　　猪　　股　　　　　清アスグぐ−＞
−Ｉ−し自責　　　　　　　　　　不０ソλ２↓Ｓイミ
ド尿ん・叫間 木°フス７５、ンＣ：）２八’−２Ｊ −２で５ βにす関 今・５ 晴間（分） ２←δ 時間（分） 晴間（介ン ！＋！１間　（ダ戸〕

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、下記（ａ）および（ｂ）の工程を含む、基体上に被
    覆をつくる方法。 （ａ）　　第一アミン、第二アミンまたはこれらの両方
    であるアミン官能基を表面に有する基体材料を用意する
    工程 （ｔｔｊ　　スクシンイミド単位を有するポリマーと前
    記基体材料を、前記基体の前記アミン基と前記ポリマー
    との反応を促進させる条件下で接触させて、前記基体上
    に前記ポリマーを固定する工程 ２、ポリマーがポリスフクンイミドである、特許請求の
    範囲第１項記載の方法。 ３、？リマーがポリスクシ／イミド誘導体である、特許
    請求の範囲第１項記載の方法。 ４、ポリマーがスクシンイミド単位を含む共重合体であ
    る、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、固定化されたポリマー中のスクシンイミド単位をア
    スパルチル残基に変換させる、特許請求の範囲第１項記
    載の方法。 ６、固定化されたポリマー中のスクシンイミド単位を、
    −個または二個以上の第１級または第２級アミン官能基
    を含む物質と反応させる、特許請求の範囲第１項記載の
    方法。 ７、固定化されたポリマー中のスクシンイミド単位を反
    応させてホスホネート基またはスルホネート基を特徴す
    る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ８、基体材料がシリカ、ガラス、アルミナおよびチタニ
    アよりなる群から選択される無機基体である。特許請求
    の範囲第１項記載の方法。 ９、ポリマーをパッチ調製法で基体上に固定する、特許
    請求の範囲第１項記載の方法。 １０、基体材料を、カラムに充填し、同時にポリマーと
    反応させる、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ｉｌ、７体と、スクシンイミド単位を含むポリマーを基
    体と反応させることによって形成されて基体上に固定化
    された被徨と、かもなる被覆担体材料。 １２、ポリマーがポリスクシ／イミｒである、特許請求
    の範囲第１１項記載の担体材料。 １３、ポリマーがポリスクシンイミド誘導体である、特
    許請求の範囲第１１項記載の担体材料。 １４、ポリマーがスクシンイミド単位を含む共重合体で
    ある、特許請求の範囲第１１項記載の担体材料。 １５、基体が、ガラス、アルミナ、ノリ力およびチタニ
    アよりなる群から選択される多孔性無機担体材料である
    、特許請求の範囲第１１項記載の相体材料。 １６、基体が、直径５〜［０ミクロンの粒子よりなる、
    特許請求の範囲第１５項記載の担体材料。 １７、基体が、ポリスチレン、ポリアクリレートおよび
    ポリメタクリレートよりなる群から選択される有機材料
    である、特許請求の範囲第【１項記載の担体材料。 １８、下記（ａ）および（ｂ）の工程を含む、基体上に
    被覆をつくる方法。 （ａ）　　基体材料を用意する工程 （ｂ）　　スクシンイミド単位を有しかつ前記基体材料
    との反応可能な官能基を有するポリマーと前記基体材料
    を、前記官能基と前記基体材料との反応を促進する条件
    下で接触させる工程
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