JPH0441305B2 - - Google Patents

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JPH0441305B2
JPH0441305B2 JP58228305A JP22830583A JPH0441305B2 JP H0441305 B2 JPH0441305 B2 JP H0441305B2 JP 58228305 A JP58228305 A JP 58228305A JP 22830583 A JP22830583 A JP 22830583A JP H0441305 B2 JPH0441305 B2 JP H0441305B2
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JP
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polymer
substrate
polysuccinimide
silica
groups
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Description

【発明の詳細な説明】
発明分野 本発明は液体クロマトグラフイーに有用な被覆
された担体材料およびこの材料の製造方法に関す
る。より詳細には、本発明は、高速液体クロマト
グラフイーに適した担体材料に関する。 発明の背景 イオン交換はたん白質混合物の分離に用いうる
最も有用な技術の一つである。大部分のたん白質
は等電点が６よりも低いので、通常陽イオン交換
よりも陰イオン交換がより有用である。しかしな
がら、陽イオン交換によつて最良に分離される多
数のたん白質混合物がある。 たん白質の陽イオン交換に最も広く用いられる
材料は、カルボキシメチル基を有するセルロース
またはデキストランである。これらの材料は親水
性の一般的要件および通常のたん白質クロマトグ
ラフイーに必要な高い能力を示す。 広い表面積を有する微細なカラム充填材の使用
を含む最近のクロマトグラフイーにおける発展に
よつて、高速液体クロマトグラフイー（HPLC）
として知られている技術が開発された。現代の
HPLCにおいては、クロマトグラフイーカラム内
で数千lb／in2の圧力がしばしば生じる。このこ
とは、カラム充填材が剛く、つぶれないものであ
ることを必要とする。今まで、たん白質陽イオン
交換に用いられてきた炭水化物を主体とする材料
は、結果として伴う高圧力に耐えることができな
いのでHPLC中での使用には適さない。この要求
を満たす材料を得るため、これまで多孔性の無機
材料が、たとえばシリカおよびアルミナが、この
表面上の有機固定相を有する担体材料として利用
されて種々のクロマトグラフイーカラム充填材料
が得られている。最近この目的のために親水性の
有機担体が開発されている。しかし、これらの充
填材の圧力限界が無機物を主体とする材料のそれ
よりもまだ多少低いので、それらの応用は制限さ
れる。更に、これらの材料では、無機担体材料に
比べて孔径および粒径を広い範囲で手に入れるこ
とができない。 たん白質のHPLCに用いるための無機担体に必
要とされることは、その材料が微細粒子、親水性
および粗大孔であるということである。陰イオン
交換物質ではこれらの要求を満たすものを入手し
うるが、このような陽イオン交換物質を最近まで
入手できなかつた。ガラスは本来陰イオン性であ
り、多孔性ガラス玉はたん白質の陽イオン交換に
用いられてきた。しかしながら、ガラスは多くの
たん白質と不可逆的に結合するので、完全に受け
入れられ得る物質ではない。陽イオン交換は、無
機担体表面上の親水性有機被覆中の陰イオン性基
によつて最もよく行われる。このような材料は米
国特許第4108603号明細書に開示されている。こ
の材料は製造するのに数段階を要し、また再生す
るのが困難であるといういくつかの欠点をもつて
いる。ポリエチレンイミン−ジグリコール酸無水
物を主体としたより有望な被覆体が開発され、こ
の材料を主体とした担体材料を市場で入手するこ
とができる。 短いポリマーを用いて無機クロマトグラフイー
担体用の被覆を製造するのが有利であることが研
究によつてわかつた。担体表面とはよく反応する
けれどもそれ自体とは反応しないポリマーは、自
己形成性被覆となるであろう。このような被覆は
再生可能であり、無機表面を均一に覆う。また被
覆は孔を塞がないし、無機の粒子を互いに接合さ
せない。 本発明により、再生性が高くかつ高速液体クロ
マトグラフイーに必要とされる要件を満たす自己
形成性被覆がつくられる。 発明の概要 本発明により、被覆された担体材料の製造方法
が提供される。その方法は、表面にアミン官能基
を有する基体を用意する工程、アミノ基および基
体とポリマーとの反応を促進させるような条件下
でスクシンイミド単位を持つポリマーと基体とを
接触させる工程からなる。ポリマーは基体との反
応前または反応後に誘導体化して種々のクロマト
グラフイー担体材料とすることができる。また本
発明は、スクシンイミド単位またはこれらの単位
の誘導体を有するポリマーで被覆された基体より
なる担体材料をも提供する。 全般的説明 本発明は、基体を液体クロマトグラフイー用の
担体材料に変換させる自己形成性被覆についてで
ある。本発明は、たん白質のための陽イオン交換
物質を製造するのに用いると特に有利である。担
体材料はスクシンイミド（無水アスパラギン酸）
単位を含むポリマーで基体を被覆することによつ
て製造される。スクシンイミド単位は、これを加
水分解してたん白質用の陽イオン交換物質をつく
ることもできるし、あるいは誘導体化して他の
種々の液体クロマトグラフイー技術への利用性を
有する担体材料を製造することもできる。 ポリスクシンイミド（ポリ無水アスパラギン
酸）は、陽イオン交換被覆に理想的な材料であ
る。ポリスクシンイミドを、表面のアミノ基との
反応によつて表面に固定することができる。ある
いは、アミノ−シランのようなカツプリング剤が
まずポリマーと反応し、その反応生成物が基体と
反応してもよい。しかしながら、最初にカツプリ
ング剤が基体と反応することが好ましい。陽イオ
ン交換の可能性のある基はポリスクシンイミドの
一部であるから、陽イオン交換物質を製造するた
めに、さらに反応を必要としない。材料のこの特
性によつて再生性が高められる。かくしてポリマ
ー中の残余スクシンイミド基の加水分解によつ
て、固定されたポリアスパラギン酸が製造され
る。この被覆は、親水性ポリペプチドマトリツク
ス中に多くのカルボキシル基を含んでいるので、
たん白質のクロマトグラフイーに有用である。 固定ポリアスパラギン酸は、たん白質のHPLC
用陽イオン交換物質として非常に有望である。担
体材料の製造は簡単であり、高品質の物質を均一
に再生し得る。この材料を充填したカラムは、容
量、選択性、酵素活性の回復およびピーク形状の
点で優れた性能を示す。 有機被覆は、反応性のカツプリング剤を使用す
ることによつて基体に固定される。適当な無機基
体には、ガラス、シリカ、アルミナおよびチタニ
アで作られた基体がある。有機基体もまた選択し
て得る。ポリスチレン、ポリメタクリレートおよ
びポリアクリレートのような物質を用いることが
できる。無機基体の場合のカツプリング剤として
はアミノ−シランが代表的である。しかしなが
ら、基体および有機被覆の両方に結合できる物質
であれば何でもこの目的に使用することができ
る。適当なカツプリング剤の代表的な例は３−ア
ミノプロピルトリエトキシシランである。 ポリアスパラギン酸はおそらく１分子につき数
ケ所で基体表面と結合しているであろう。これは
“島”型被覆であろう。なぜなら個々のポリマー
分子は、架橋して連続的な網状構造にはなつてい
ないからである。それにもかかわらず、表面は、
均一に覆われていると考えられ、被覆は非常に丈
夫である。被覆の高いイオン交換能力と吸着した
たん白質の離脱の容易性は、その親水性、ポリペ
プチドの特性および固定表面から離れている文枝
端部位にイオン化基が位置しているという点に帰
因するだろう。このような“毛羽立ち”被覆は広
い表面積を持ち、たん白質クロマトグラフイーに
おいて良好に作用する。このヘモグロビンイオン
交換能力（IEC）は、上記で参照したポリエチレ
ンイミン−ジグリコール酸無水物のそれよりも数
倍高い。これは、おそらく基体表面から孔の中央
に十分突き出たポリアスパラギン酸の長いねじれ
た枝によるものであろう。この構造は、表面によ
り配向した他の被覆よりもはるかに広い表面積を
持つのであろう。 ポリアスパラギン酸被覆は、バツチ操作で無機
基体上に形成せしめることもできるし、あるい
は、前もつてカツプリング剤で処理した無機基体
のカラムを介してポリスクシンイミド溶液を循環
させることによつて、同時に形成せしめることも
できる。どちらの場合も、ポリアスパラギン酸
は、固定ポリスクシンイミドを加水分解溶液で処
理することによつて製造される。同時形成の場合
は、カラムを通して溶液を循環する。両方の製造
方法の例をあとで述べる。同時形成された被覆で
製造したカラムは、バツチ法で製造した材料を充
填したカラムよりも能力および分離度がわずかに
低いことが見い出された。 ポリスクシンイミドは、陽イオン交換体のほか
に種々のクロマトグラフイー担体を製造するのに
も使用することができる。ポリスクシンイミド−
シリカの反応は、ポリアスパラギン酸−シリカ以
外の誘導体への便利な経路を提供する。中性の双
性イオンであるポリ−２−アミノエチルアスパラ
ギン酸アミド−シリカは、たとえば立体選択的ク
ロマトグラフイーに用いることができる。アミン
類がＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（DMF）溶
液中で容易に付加してポリ−α、β−Ｄ、Ｌ−ア
スパラギン酸アミドとなるので、そのような誘導
体は容易に調製される。アミン含有化合物を、固
定前または固定後のいずれかにおいてスクシンイ
ミド残基と反応させることができる。小さな分子
の場合には、固定前に反応させる方がより再生性
のよい生成物を得る。固定後の反応によつて、ポ
リペプチドマトリツクス上に固定化酵素の手段が
提供される。また種々の配位子をポリスクシンイ
ミド被覆に付加し、親和性クロマトグラフイーに
有用である物質に変換することもできる。被覆の
ポリペプチドの特性によつて、この利用には良好
な性能が与えられるはずである。この物質につい
て一つの問題は、見たところ被覆中にいく分かの
アスパルチル基が存在するのを避けることができ
ないということである。この基の影響は、親和性
配位子または酵素と共に、被覆にエチレンジアミ
ンを加えることによつておそらく中和され得る。 ポリスクシンイミド被覆中にスルホネート基ま
たはホスホネート基を組み入れることによつて強
い陽イオン交換物質が生成する。このものは２−
アミノエチルホスホン酸またはタウリンを、固定
化されたポリスクシンイミドと反応させることに
よつて得ることができる。他の基を組み入れるこ
とによつてクロマトフオカシングに有用な物質が
得られるはずである。 第１図はアスパラギン酸からポリスクシンイミ
ドへの変換を示す。ポリスクシンイミドは、アス
パラギン酸を濃縮するような条件下で加熱するこ
とによつてほとんど定量的に形成される。 第２図はポリアスパラギン酸−シリカを製造す
るのに採用される方法を示す。大部分のたん白質
を自由に孔内部に入れるに十分な広い孔を有する
微粒子のシリカゲルを選択した。シリカルにアミ
ノプロピル基が共有結合した被覆を形成した。次
いで、ポリスクシンイミドはアミノ基と反応し
た。このことによつて、ポリマーがアミド結合を
介して表面に固定されたポリスクシンイミド−シ
リカが製造される。次いで、未反応のスクシンイ
ミド環を塩基触媒で加水分解処理することによつ
てポリアスパラギン酸被覆が生じる。 例 アミノプロピル−シリカの製造 バイダツク（Vydac、商標）シリカ4.0ｇを秤
量して大きい試験管に入れ、３−アミノプロピル
トリエトキシシランの５％（Ｗ／Ｖ）トルエン溶
液30mlで覆つた。混合物を過熱発生器上で混合
し、次いで30秒間真空下（小さなポンプに接続し
た一個のホールストツパーによる）において、シ
リカの孔から空気を除去した。混合物を、沸騰水
浴中で時々かきまぜながら２時間加熱した。生成
物を中位の多孔性焼結ガラスのじようごに集め、
トルエンとアセトンで充分洗浄した後、連続吸引
で乾燥した。 ポリスクシンイミドの製造 Ｄ，Ｌ−アスパラギン酸50ｇ（0.38モル）を結
晶皿上に薄層状にのせ、オーブン中、190℃で50
時間加熱した。得られた淡黄かつ色粉末は37.9ｇ
（生成物の単位分子量が97と仮定すると、脱水が
実質的に定量的に行われたことを示す）であつ
た。粉末は、少量の白色物質を除いてはDMF150
ml中に加熱下で溶解した。この物質を遠心分離で
除いて茶色の溶液が残つた。DMF溶液を４倍量
のジエチルエーテル中に激しく撹拌しながら注ぎ
込み、沈殿生成物を遠心分離で集めることによつ
てポリスクシンイミドを得た。ジエチルエーテル
のかわりに水を用いてポリスクシンイミドを沈殿
させることも可能である。沈殿は数回沈殿溶媒を
用いて振り、次いで再沈降させることによつて
DMFを除去する。次いで沈殿物を親液性化して
完全にDMFに溶解する淡黄かつ色粉末を得た。
この生成物の分子量はほぼ13000と測定された。
水を用いてもエーテルを用いても本発明の目的に
許容できる生成物が得られるが、エーテルからの
方がすばやく沈殿し、またエーテルを使用すると
スクシンイミド環の一部が加水分解する可能性が
排除される。 ポリスクシンイミド−シリカの製造 アミノプロピル−シリカ4.0ｇ、ポリスクシン
イミドの５％（Ｗ／Ｖ）DMF溶液20ml中で上記
のようにして撹拌し、脱ガスした。混合物を時々
撹拌しながら室温で24時間放置した。黄かつ色の
生成物をじようごに集めてDMFおよびアセトン
で洗つた。 ポリスクシンイミドと表面のアミノプロピル基
との反応によつて遊離アミノ基がなくなる。消失
速度はピクリン酸を用いた分析で測定することが
できる。この分析によつて、ピクリン酸との可逆
的イオン対の形成による固体表面上の反応しうる
アミノ基の定量をすることができる。この分析の
詳細は、Journal of Chromatography，185
（1979）375−392に記述されている。アミノプロ
ピル−シリカの試料をポリスクシンイミドの５％
溶液中に浸し、反応時間を最適なものとするため
に種々の時間で分析に供した。第３図では、その
反応が0.5時間以内にほぼ完結することを示して
いる。表面全体の被覆は、24時間反応を継続する
ことによつて達成され得る。 アミノプロピル−シリカとの反応に用いるべき
ポリスクシンイミド溶液の濃度もまた最適なもの
にする。何種類かの濃度の溶液を用い、24時間の
反応でポリスクシンイミド−シリカを製造し、生
成物を後述の如く加水分解してポリアスパラギン
酸−シリカとした。ヘモグロビンに対するイオン
交換能力（IEC）を利用して生成物の性質とポリ
スクシンイミド被覆の品質との関連を明らかにし
た。第４図は、ポリスクシンイミド濃度を１％か
ら２％に高めた時は被覆にいく分か違いがある
が、濃度を２％から５％に高めた時にはほとんど
違わないことを示している。従つて再生性のある
被覆を比較的短かい時間で生成させるためには５
％溶液が適切である。 ポリアスパラギン酸−シリカの製造 DMF15ml、水10ml、β−アラニン0.825ｇ（9.3
ｍmol）およびトリエチルアミン0.625ml（4.5ｍ
mol）を含む溶液中でポリスクシンイミド−シリ
カ4.0ｇを前述のようにして撹拌し、脱ガスした。
混合物を時々かきまぜながら室温で24時間放置し
た。この処理によつて、処理前の材料の黄かつ色
の色彩がほとんどなくなる。淡黄かつ色生成物を
じようごに集め、水、0.05モルのHCl、水および
アセトンで洗浄した。次いで生成物を連続的吸引
で乾燥した。 β−アラニンはポリスクシンイミドと反応して
ポリ−２−カルボキシエチルアスパラギン酸アミ
ドとなることが報告されている。未反応のスクシ
ンイミド残基の次の加水分解は、塩基性のトリエ
チルアミンで触媒される。この反応は陽イオン交
換物質への可能性のある経路として研究されてき
た。表１はポリスクシンイミド−シリカから製造
される何種類かの生成物のヘモグロビンIECを示
す。β−アラニンとスクシンイミド残基との反応
は、トリエチルアミンの存在下におけるそれらの
加水分解よりもはるかに緩慢であり、かくしてこ
こで生成した被覆は主としてポリアスパラギン酸
であつてポリ−２−カルボキシエチルアスパラギ
ン酸アミドではない。トリエチルアミン溶液中に
β−アラニンを含ませるとIECがわずかに高くな
つた生成物が得られるので、加水分解溶液にはβ
−アラニンを一定の手順で加える。触媒がない場
合には被覆の加水分解が緩慢であることは表１か
ら明らかであり、この加水分解は水のみの中で行
うよりもDMF／水系中で行う方が緩慢である。
しかしながら、触媒を存在させた加水分解の場合
にはDMF／水溶液中の方が早い。表１からわか
るように、未処理のポリスクシンイミド−シリカ
は控えめなヘモグロビンIECを有する。このこと
はアスパルチル基がＣ−末端と共にポリマー中央
にも存在することを反映しているのかも知れな
い。 表 １ ポリスクシンイミド−シリカから製造される陽イ
オン交換物質に対する添加物の影響 120mgずつのポリスクシンイミド−バイダツク
（Vydac）を溶媒4.4ml中で撹拌し、脱ガスした。
溶媒は水、またDMF2.6ml＋水1.8mlであつた。前
記したように、β−アラニン147mgおよび（また
は）トリエチルアミン111mgを溶媒中に存在させ
た。混合物を時々撹拌しながら室温で15時間放置
した。ポリアスパラギン酸−シリカの場合のよう
にして生成物をろ別し、洗浄した（例参照）。
【表】 ポリスクシンイミド被覆をポリアスパラギン酸
被覆に加水分解すると多くのカルボキシル基が生
ずる。加水分解に必要な時間を決定するためには
これらのカルボキシル基の濃度を知ることが有用
である。不都合にも、ピクリン酸分析でアミノ基
を定量するような方法で簡便にカルボキシル基を
定量できる分析法はない。もともと存在するシリ
カ中のシラノール基が、水溶液滴定によるカルボ
キシル基の定量を妨害するのである。 被覆中のカルボキシル基の濃度は、間接的な方
法で算定することができる。ポリスクシンイミド
−シリカとエチレンジアミンとの反応によつてア
ミノエチル基を有する被覆が生じる。これらはピ
クリン酸分析で定量することができる。ただ一つ
のアミノ残基のみと反応して両方のアミノ残基と
は反応しないようにするため（この場合には単に
アミド結合によつて被覆を架橋するだけでピクリ
ン酸対イオン化能力（IPC）は変化しない）、エ
チレンジアミン−塩酸塩が用いられる。 第５Ａ図は反応の進行度対時間を示す。反応は
24時間後に、ポリスクシンイミド−シリカ１ｇに
ついてエチレンジアミン0.26ｍmolが付加してほ
ぼ完結する。これは加水分解しうるスクシンイミ
ド残基の下限を示している。なぜなら、この方法
では次の型の残基は測定されないからである。 (a) エチレンジアミンと架橋反応をし、先端が離
れた付加はしない残基 (b) 反応前に存在するアスパルチル基 (c) 塩基性のエチレンジアミンによつて触媒され
てアスパルチル基に加水分解される残基 生成物であるポリ−２−アミノエチルアスパラ
ギンアミド−シリカはヘモグロビンIECがほとん
どない（後の表２参照）。このことは、被覆中に
は充分なカルボキシル基があつて生成物中に中性
の双性イオン的性質を与えていることを示してい
る。ポリアスパラギン酸−シリカ中のカルボキシ
ル基の濃度はおそらく約0.4ｍmol／ｇ材料であ
る。これはVydac TP（ここではシリカが用いら
れる）をベースとして単一層のポリエチレンイミ
ン被覆を有する陰イオン交換物質中に存在するイ
オン交換部の濃度とほぼ同じである。このことは
ポリアスパラギン酸被覆が非常に薄いことを示し
ている。 被覆の加水分解速度は、加水分解が進行するに
つれてヘモグロビンIECが増大するという第二の
間接的方法によつて追跡し得る。第５Ｂ図は加水
分解溶液中の二種類の異なつたトリエチルアミン
濃度における加水分解の時間進行度を示す。速度
は８倍分だけ異なり、かつ溶液中のヒドロキシル
基の濃度の相違に直接比例する。高いPHにおいて
は、加水分解は24時間で完結すると考えられる。
しかしながら陰イオン交換シリカについての研究
では、一たん表面のイオン交換部がある濃度に達
するとヘモグロビンIECは一定になり、更に濃度
が増加してもほとんど影響をうけないことがわか
つた。かくして加水分解速度は第５Ｂ図で示した
速度よりも緩慢たり得る。他方、塩基に長時間さ
らしておくとシリカが溶解する原因となり得る。
それ故、加水分解は24時間行うのが反応の完全性
に対する要求と、単体の保全に対する要求との間
の適切な妥協点であると考えられる。 ポリスクシンイミド−シリカの誘導体 ポリスクシンイミド−シリカの反応性によつて
多種類の官能基が被覆中に組み込まれ得る。表２
はエタノールアミンとの反応生成物（後述するエ
チレンジアミン塩酸塩との反応の場合と同様にし
て製造される）、エチレンジアミン塩酸塩との反
応生成物およびポリエチレンイミン６（FEI6、分
子量がほぼ600のポリエチレンイミン）との反応
生成物の各イオン交換特性を示す。ポリPEIアス
パラギンアミド−シリカは低分子およびたん白質
の両方についての陰イオン交換物質であり、ヘモ
グロビンに対するイオン交換能力（IEC）は、
PEIを薄膜状に被覆した陰イオン交換シリカの
IECのたつた58％にすぎない。このことは被覆中
にカルボキシル基が存在することを反映してい
る。同様に、中性であるべきポリ−２−ヒドロキ
シエチルアスパラギンアミド−シリカは多少のヘ
モグロビン陽イオン交換能力を有している。ポリ
−２−アミノエチルアスパラギンアミド−シリカ
はカルボキシル基に釣り合うのに充分なアミノ基
を有していると考えられ、前述したように中性の
双性イオン的被覆が得られる。
【表】 た。
担体材料に官能基を加える別の方法は、ポリス
クシンイミドの固定に先だつて官能基を組み入れ
る方法である。これはある場合には、固定後に組
み込んだ時よりも再生性のよい生成物が得られる
であろう。固定前誘導体化はポリマーと架橋して
はならず、かつ固定化できるに十分な遊離のスク
シンイミド残基を残していなければならない。こ
の方法はポリスクシンイミドにエタノールアミン
およびトリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタ
ン（トリス）を付加させて実験した。得られたポ
リマーは、陰イオン性となる可能性のある残基を
使つて生じる中性で親水性の残基をいくらか含
む。表３はこれらの誘導体化されたポリマーを用
いて製造したポリアスパラギンアミド−シリカの
IECを示す。予想される如く、付加物はヘモグロ
ビンIECを減少させるが、その効果は付加物の割
合が５％を越えると著しくなくなつた。これらの
誘導体の製造方法は後述する。
【表】 ポリ−２−アミノエチルアスパラギンアミド−
シリカは、溶液がエチレンジアミン0.25ml（3.7
ｍmol）、エチレンジアミン二塩酸塩0.50ｇ（3.7
ｍmol）、DMF20mlおよび４mlよりなるものであ
る点を除いてはポリアスパラギン酸−シリカの製
造方法と同様の方法を用いて製造した。生成物
は、0.05MのHClのかわりにトリエチルアミンの
飽和水溶液で洗浄した。 ポリPEIアスパラギンアミド−シリカは、
DMF：水が１：１である溶媒中におけるPEI6の
５％（Ｗ／Ｖ）溶液よりなる溶液である点を除い
てはポリアスパラギン酸−シリカの製造方法と同
様の方法を用いて製造した。混合物は46時間反応
させ、生成物は0.05MのHClのかわりにトリエチ
ルアミンの飽和水溶液で洗浄した。 固定化に先立つてポリスクシンイミドを誘導体
化する場合を例示するため、エタノールアミンお
よびトリスをそれぞれDMF2.5mlに溶解してスク
シンイミド残基を０、５、10および20モル当量％
含む溶液を製造した。ポリスクシンイミド溶液お
よび付加物溶液の両方を５℃に冷却した。次いで
付加物溶液を撹拌中のポリスクシンイミド溶液に
滴下し、室温で３時間放置した。溶液は、存在す
る付加物の量に比例してほとんどただちに黒変し
た。付加物のない溶液にはDMF2.5mlだけが入つ
ていた。アミノプロピル−Vydacの試料140mgを
誘導体化したポリスクシンイミド溶液の一つの中
でそれぞれ脱ガスし、撹拌した。それらを12時間
後には撹拌をしながら室温で24時間放置した。次
いで中間生成物をろ別し、DMFおよびアセトン
で洗浄した後、連続吸引で乾燥した。残余スクシ
ンイミド残基は、前のポリアスパラギン酸−シリ
カの製造において述べたようにβ−アラニンおよ
びトリエチルアミン溶液で加水分解した。 応 用 たん白質混合物は、カルボキシメチル型物質に
ついて採用される勾配に類似の勾配を用いてポリ
アスパラギン酸−シリカのカラム上で良好に分離
される。カラムは高い能力と選択性を示す。第６
図は等電点が4.7から11を越える範囲の何種類か
の標準たん白質の分離を示す。ピークは鋭く、テ
ーリングは最小である。 実際のヘモグロビン試料はしばしば陽イオン交
換カラムによつて分析される。ポリアスパラギン
酸−シリカの機能はこの応用に特に良好である。
第７図はAFSCヘモグロビン標準のプロフイルで
ある。第８図は第７図におけるよりも浅い勾配を
用いて生じさせたノーマルヘモグロビンの形状で
ある。第９図および第１０図は赤血球鎌状形成傾
向に対してそれぞれヘテロ接合性およびホモ接合
性の、個体ヘモグロビンのプロフイルである。ヘ
モグロビンA0、A2およびＳの領域においては優
れた選択性が認められ、５ミクロン充填のカラム
を用いるとさらに良好な分析結果が得られる。臨
床的に意義深いいくつかの突然変異体ヘモグロビ
ン形の分析にとつてこのことは重要である。たと
えば、ヘモグロビンＥおよびA2は他のイオン交
換物質では分離されないが、ポリアスパラギン酸
−シリカで分離される。 ポリアスパラギン酸被覆は非常に安定である。
カラムは数百時間使用を継続しても有効性と能力
は減少しない。ある場合には、カラムのたん白質
保持力は使用の最初の100時間の間に５％だけ増
大する。これは残余スクシンイミド残基の加水分
解が進行していることを反映している。あるい
は、被覆の外側に向けて分枝末端部の向きかえが
おこり、その表面積が増大するのかも知れない。
この過程はカラムを強い緩衝液で数時間溶出させ
ることによつて促進される。 ポリアスパラギン酸−シリカのカラムは酵素活
性の高い回復を示す。いくつかの酵素がポリアス
パラギン酸−シリカのカラムに適用され、カルボ
キシメチル−セルロースにおいて用いられる勾配
と同様の勾配で溶出される。アデニルコハク酸塩
シンセターゼ、チオラーゼ、およびβ−ヒドロ
キシアシル−C0Aデヒドロゲナーゼは適用活性を
定量的に回復して溶出された。この高い回復性は
被覆のポリペプチド特性を反映しており、この特
性は、変性の原因となることなく被覆を酵素との
相互作用に適したものとしている。 前記した発明は特定の態様によつて例示されて
きたが、本発明の範囲をこれに限定する意図はな
い。当業者にとつて本発明の修正および変形は明
白であろう。特許請求の範囲に記載した事項は、
本発明の真の精神および範囲に該当するような等
価な修正および変形をすべて含むものと考えられ
る。
【図面の簡単な説明】
第１図は、アスパラギン酸からポリスクシンイ
ミドへの変換を示す説明図である。 第２図は、ポリスクシンイミドとアミノプロピ
ルシリカとの反応および残余スクシンイミド単位
のその後の加水分解を示す説明図である。 第３図は、ピクリン酸との対イオン化容量
（IPC）によつて決定した、ポリスクシンイミド
とアミノプロピル−シリカとの反応速度を示す線
図である。 第４図は、ヘモグロビンイオン交換能力
（IEC）によつて測定した、ポリスクシンイミド
溶液濃度を変化させることによるポリアスパラギ
ン酸−シリカ材料の品質に対する影響を示す線図
である。 第５Ａ図は、ポリスクシンイミド−シリカとエ
チレンジアミンとの反応速度（PH＝9.3）を示す
線図である。 第５Ｂ図は、ポリスクシンイミド−シリカから
ポリアスパラギン酸−シリカへの加水分解速度を
示す線図である。 第６図は、たん白質標準の陽イオン−交換クロ
マトグラフイーを示す線図である。カラム：ポリ
アスパラギン酸−Vydac（10ミクロン）、20×0.46
cm。試料：オバルブミン12.5μｇおよび他のたん
白質をそれぞれ25μｇ含む弱緩衝液25μ。流
速：１ml／分。溶出：80分。直線勾配０−100％
強緩衝液。検出：A220＝1.0a.u.f.s.。弱緩衝液：
50ｍMKH2PO4、PH＝6.0。強緩衝液：50ｍＭ＋
0.6M NaCl。 第６図中のピークとその同定。ピーク 同 定 ａ　 オバルブミン ｂ　 バシトラミン ｃ　 ミオグロビン（マツコウクジラ） ｄ　 キモトプシノーゲンＡ ｅ　 還元型チトクロームＣ（EQUINE） ｆ　 リボヌクレアーゼＡ ｇ　 酸化型チトクロームＣ（EQUINE） ｈ　 リゾチーム 第７図は、AFSCヘモグロビン標準の陽イオン
交換クロマトグラフイーを示す線図である。試
料：14倍に希釈した標準AFSC溶液25μ。溶
出：32分。直線勾配、22−100％強緩衝液。検
出：A415＝0.2a.u.f.s.。カラム：ポリアスパラギ
ン酸−シリカ、10ミクロン、20×0.46cm。弱緩衝
液：40ｍＭビス−トリス・Cl＋40ｍＭ KCN、
PH＝6.5。強緩衝液：同上＋0.2M NaCl、PH＝
6.8。 第７図中のピークとその同定。ピーク 同 定 ａ HbA1C（？） ｂ HbF ｃ 未知 ｄ HbA0 ｅ HbA2 ｆ HbS ｇ HbC 第８図は、ノーマルヘモグロビンのクロマトグ
ラフイーを示す線図である。試料：37倍に希釈し
たヘモグロビン溶液25μ。溶出：140分。直線
勾配、25−100％強緩衝液。その他の条件は第７
図と同じ。 第８図中のピークとその同定。ピーク 同 定 ａ、ｂ HbF ｃ A0 ｄ A2 第９図は、赤血球鎌状形成傾向に対してヘテロ
接合性の個体からのヘモグロビンのクロマトグラ
フイーを示す線図である。試料：23倍に希釈した
ヘモグロビン溶液25μ。条件：第８図参照。 第９図中のピークとその同定。ピーク 同 定 ａ、ｂ HbF ｃ HbA0 ｄ、ｆ 副HbS型 ｅ HbA2 ｇ HbS 第１０図は赤血球鎌状形成傾向に対してホモ接
合性の個体からのヘモグロビンのクロマトグラフ
イーを示す線図である。試料：34倍に希釈したヘ
モグロビン溶液25μ。条件：第８図参照。 第１０図中のピークとその同定。ピーク 同 定 ａ、ｂ HbF ｃ、ｄ、ｆ 副HbS型 ｅ HbA2 ｇ HbS

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 下記(a)および(b)の工程を含む、クロマトグラ
    フイーの担体材料をつくる方法。 (a) 第一アミン、第二アミンまたはこれらの両方
    であるアミン官能基を表面に有する基体材料を
    用意する工程 (b) スクシンイミド単位を有するポリマーと前記
    基体材料を、前記基体の前記アミン基と前記ポ
    リマーとの反応を促進させる条件下で接触させ
    て、前記基体上に前記ポリマーを固定する工程 ２ ポリマーがポリスクシンイミドである、特許
    請求の範囲第１項記載の方法。 ３ ポリマーがポリスクシンイミド誘導体であ
    る、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ ポリマーがスクシンイミド単位を含む共重合
    体である、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５ 固定化されたポリマー中のスクシンイミド単
    位をアスパル残基に変換させる、特許請求の範囲
    第１項記載の方法。 ６ 固定化されたポリマー中のスクシンイミド単
    位を、一個または二個以上の第１級または第２級
    アミン官能基を含む物質と反応させる、特許請求
    の範囲第１項記載の方法。 ７ 固定化されたポリマー中のスクシンイミド単
    位を反応させてホスホネート基またはスルホネー
    ト基を導入する、特許請求の範囲第１項記載の方
    法。 ８ 基体材料が、シリカ、ガラス、アルミナおよ
    びチタニアよりなる群から選択される無機基体で
    ある、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ９ ポリマーをバツチ調製法で基体上に固定す
    る、特許請求の範囲第１項記載の方法。 １０ 基体材料を、カラムに充填し、カラム内で
    ポリマーと反応させる、特許請求の範囲第１項記
    載の方法。 １１ 基体と、スクシンイミド単位を含むポリマ
    ーとを反応させることによつて形成されて基体上
    に固定化された被覆と、からなるクロマトグラフ
    イーの担体材料。 １２ ポリマーがポリスクシンイミドである、特
    許請求の範囲第１１項記載の担体材料。 １３ ポリマーがポリスクシンイミド誘導体であ
    る、特許請求の範囲第１１項記載の担体材料。 １４ ポリマーがスクシンイミド単位を含む共重
    合体である、特許請求の範囲第１１項記載の担体
    材料。 １５ 基体材料が、ガラス、アルミ、ナシリカお
    よびチタニアよりなる群から選択される多孔性無
    機担体である、特許請求の範囲第１１項記載の担
    体材料。 １６ 基体が、直径５〜10ミクロンの粒子よりな
    る、特許請求の範囲第１５項記載の担体材料。 １７ 基体が、ポリスチレン、ポリアクリレート
    およびポリメタクリレートよりなる群から選択さ
    れる有機材料である、特許請求の範囲第１１項記
    載の担体材料。 １８ 下記(a)および(b)の工程を含む、クロマトグ
    ラフイーの担体材料をつくる方法。 (a) 基体材料を用意する工程 (b) 前記基体材料を、スクシンアミド単位を有
    し、かつ、第一アミン、第二アミンまたはこれ
    らの両方であるアミン官能基を有するポリマー
    と、前記アミン官能基と前記基体材料との反応
    を促進させる条件下で接触させる工程
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