CN111013557A - 一种疏水层析介质及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种疏水层析介质及其制备方法和应用,包括固体基质以及包覆在固体基质表面的中性亲水包覆层;其中,所述中性亲水包覆层上通过‑OC(O)‑NH‑化学键合有疏水基团。本发明提供的疏水层析介质具有中性亲水包覆层,包覆层将硅胶表面硅羟基基团有效包覆,进而避免了硅羟基与生物大分子(例如蛋白质)之间的相互作用;同时本发明选择利用异氰酸酯引入疏水基团,避免了在碱性环境下引入疏水基团而因为碱性环境导致固体基质不稳定的缺点。
Description
技术领域
本发明属于蛋白层析分离技术领域,涉及一种疏水层析介质及其制备方法和应用。
背景技术
疏水作用层析(HIC)是一种通用的液相色谱技术,通常与离子交换层析和凝胶过滤层析结合使用,作为蛋白质分离纯化或分析的工具。HIC的独特之处在于其可以与蛋白质在高盐浓度下结合而在低盐浓度下洗脱;这以反向盐梯度体现,直接表明正在使用HIC技术。
HIC有时被理解为是反向层析(RPC)的一种较温和的形式。但HIC利用了较温和的结合和洗脱条件,通常可保留目标蛋白的生物学活性。HIC可以适用于最低限度的样品预处理,因此可以有效地与传统的蛋白质沉淀技术结合使用。适度高浓度的抗离液盐可促进蛋白质与HIC介质的结合,而盐也可以稳定蛋白质结构。HIC洗脱可通过线性或逐步降低吸附缓冲液中盐的浓度来实现获得满意的回收率;因此,HIC在研究和工业实验室中广泛用于纯化各种生物分子,例如血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、细胞或重组蛋白。
HIC介质通常具有亲水性表面,只有亲水性表面的小部分被疏水性配体修饰以提供疏水相互作用位点。HIC所使用的固体载体可以是硅胶,交联的琼脂糖或合成共聚物材料;在HIC对蛋白质进行分离时,固体载体表面通常需要具有没有离子交换特性的亲水表面,其对蛋白质的分离极其重要,因为对于分离蛋白质而言,除了主要的疏水作用,离子交换作用也会对分离蛋白质产生不利影响。虽然目前现有技术中有利用有机聚合物或交联的琼脂糖基质材料制备疏水层析介质,但是考虑到二氧化硅基基材具有更优异的机械稳定性,以及具有可控的孔径和可选择的粒径范围广,因此,选择二氧化硅基基材制备疏水性层析介质具有显著的优越性。
CN107876017A公开了一种具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质,其包括层析基质和配基,所述的层析基质为带有羟基的亲水性多孔微球,所述的配体为3-吡咯羧酸的羧基和4-氨基-2-羰基嘧啶的胺基反应后形成的双功能配基。CN1041461C公开了一种端酯基硅胶高效疏水色谱填料及合成方法,合成方法为端羟基硅胶基质化合物在有机碱催化下与酸酐或酰氯反应,或含环氧基的硅胶与二元醇的酯在三氟化硼催化下反应。上述方法(CN1041461C)虽然制备得到疏水色谱填料,但是一方面由于表面键合覆盖率不高,有部分裸露的硅羟基会影响蛋白质的分离和分离填料的稳定性;另一方面分离介质中存在脂基官能团的连接点,其耐酸和碱的能力不高,会导致固体基质的不稳定。
因此,我们希望开发一种具有优良的化学稳定性和物理稳定性的高性能硅胶基质的疏水层析介质和色谱柱。
发明内容
本发明的目的在于提供一种疏水层析介质及其制备方法和应用。本发明提供的疏水层析介质具有中性亲水包覆层,包覆层将硅胶介质表面未键合的硅羟基基团有效包覆,进而避免了硅羟基与生物大分子(例如蛋白质)之间的相互作用;同时本发明选择利用异氰酸酯引入适量的疏水基团,避免了在碱性环境下引入疏水基团而因为碱性环境导致固体基质不稳定的缺点。
为达此目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供了一种疏水层析介质,包括固体基质以及包覆在固体基质表面的中性亲水包覆层;
其中,所述中性亲水包覆层上通过-OC(O)-NH-化学键合有疏水基团。
本发明通过在固体基质表面引入中性亲水包覆层,使固体基质本身带有的硅羟基被有效地包覆在包覆层内,因此,本发明提供的疏水层析介质可避免硅羟基对待分离蛋白质的影响以及改善了分离介质的化学稳定性。
所述中性亲水包覆层指的是电中性的亲水的包覆层,例如C-OH并不电离,具有电中性的同时,-OH具有亲水性,因此,本发明所述的中性亲水包覆层可以是带有C-OH的包覆层。
在本发明中,所述固体基质为带有Si-OH基团的固体基质,选自二氧化硅微球和/或二氧化硅/有机杂化物微球。
优选地,所述固体基质的平均粒径为1.5-50μm,例如3μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm等。
优选地,所述固体基质的比表面积为0.5-300m2/g,例如1m2/g、5m2/g、10m2/g、25m2/g、50m2/g、100m2/g、150m2/g、200m2/g、250m2/g等。
在本发明中,所述固体基质也可以为无孔材料。
在本发明中,所述固体基质可以为颗粒状、块状、片层状等目前现有技术中常用的各种形状。
在本发明中,所述固体基质可为球状、方形、或不规则形状。
第二方面,本发明提供了根据第一方面所述的疏水层析介质的制备方法,所述制备方法包括如下步骤:
(1)带有环氧基的固体基质与多元醇进行交联反应,形成中性亲水包覆层;
(2)将步骤(1)的产物与异氰酸酯进行反应,得到所述疏水层析介质。
本发明选择的固体基质不耐碱,本发明通过异氰酸酯引入疏水基团,异氰酸酯与羟基可以在温和的条件下发生反应。此反应为加成反应,无副产物生成,并且反应平稳,可控性好。与用酯化反应偶联的方式相比,本发明的制备方法具有更好的化学稳定性;与用醚键偶联的方式相比,本发明的制备方法可以避免由于使用强碱而对固体基质的损坏。
本发明对所能引入疏水基团的化合物进行了特异性选择,引入的疏水基团通常为C1-C8的烷基或芳香类的基团,其C1-C4和苯基官能团最常见。若疏水性能过强,则会导致待测物(蛋白)的非特异性吸附,影响分离结果。
在本发明中,所述步骤(1)的产物与所述异氰酸酯的质量比为10:(0.1-1.5),例如10:0.2、10:0.4、10:0.6、10:0.8、10:1、10:1.1、10:1.2、10:1.3、10:1.4等。
在本发明的制备方法中,异氰酸酯的用量不能过多,过多则会导致由疏水性过强引起的非特异性吸附;也不能过低,否则起不到疏水保留的作用。
优选地,所述异氰酸酯选自C1-C8的异氰酸酯,进一步优选C1-C6的异氰酸酯,再进一步优选异氰酸丁酯、异氰酸辛酯或异氰酸苯酯中的任意一种或至少两种的组合。
本发明所述的C1-C8可以是C2、C3、C4、C5、C6、C7等,本发明所述的C1不包括异氰酸酯中的碳原子数,即异氰酸甲酯为C1的异氰酸酯。
同时,异氰酸酯的碳原子数目(不包括异氰酸酯基在内的碳原子数)不得超过8个,若超过8个,则会在实际应用过程中导致非特异性吸附,影响分离效果。
优选地,步骤(2)所述反应的温度为0-100℃,例如10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃等,时间为1-24小时,例如2小时、5小时、10小时、12小时、15小时、20小时等。
优选地,步骤(1)所述多元醇包括乙二醇、二乙二醇或三乙二醇中的任意一种或至少两种的组合。
本发明通过引入多元醇与环氧基发生反应交联,在固体基质表面形成致密的中性亲水膜(中性亲水包覆层),进而可以避免硅羟基的裸露,从而避免硅羟基对待分离蛋白质的影响。
优选地,所述带有环氧基的固体基质与多元醇的质量比为(1-10):(10-1),例如10:1、8:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:8、1:10等。
优选地,步骤(1)所述交联反应的催化剂为三氟化硼醚化物类催化剂,选自三氟化硼乙醚。
优选地,所述交联反应在溶剂中进行,所述溶剂为四氢呋喃和/或1,4-二氧六环。
优选地,所述交联反应的温度为0-120℃(例如10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、80℃、100℃、110℃等)或溶剂的回流温度,时间为1-24小时,例如2小时、5小时、8小时、10小时、12小时、15小时、18小时、20小时等,优选8小时。
优选地,所述带有环氧基的固体基质的制备方法包括如下步骤:
(A)、将固体基质与带有环氧基的硅烷化试剂进行反应,得到所述带有环氧基的固体基质。
优选地,所述固体基质与所述带有环氧基的硅烷化试剂的质量比为(1-5):(5-1),例如1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1等。
优选地,所述带有环氧基的硅烷化试剂选自3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷。
优选地,步骤(A)中所述反应在溶剂中进行,所述溶剂为甲苯、二甲苯或1,4-二氧六环中的任意一种或至少两种的组合。
优选地,步骤(A)中所述反应的温度为0-140℃,例如10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、120℃、130℃等,时间为8-48小时,例如10小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时等。
第三方面,本发明提供了根据第一方面所述的疏水层析介质在蛋白分离或单抗分离中的应用。
本发明提供的疏水层析介质具有生物相容性,并且可选择的中性亲水包覆层以及包覆层上化学键合的疏水基团具有多样性,因此可得到具有不同选择性的层析介质。
相对于现有技术,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明通过在固体基质表面引入中性亲水包覆层,使固体基质本身带有的硅羟基被有效地包覆在包覆层内,因此,本发明提供的疏水层析介质可避免硅羟基对待分离蛋白质的影响以及改善了分离介质的化学稳定性;
(2)本发明通过异氰酸酯引入疏水基团,异氰酸酯与羟基可以在温和的条件下发生反应;此反应为加成反应,无副产物生成,并且反应平稳,可控性好;与用酯化反应偶联的方式相比,本发明的制备方法具有更好的化学稳定性;与用醚键偶联的方式相比,本发明的制备方法可以避免由于使用强碱而对固体基质的损坏;
(3)本发明提供的疏水层析介质对蛋白(单抗类)分子具有优越的分离效果。
附图说明
图1是采用实施例1提供的疏水层析介质进行核糖核酸酶A、溶菌酶和胰凝乳蛋白酶的分离结果图。
图2是采用实施例2提供的疏水层析介质进行核糖核酸酶A、溶菌酶和胰凝乳蛋白酶的分离结果图。
图3是采用实施例1提供的疏水层析介质进行单克隆抗体IgG1的分离结果图。
图4是采用实施例9提供的疏水层析介质进行单克隆抗体IgG1的分离结果图。
图5是采用实施例1提供的疏水层析介质进行单克隆抗体IgG4的分离结果图。
图6是采用实施例2提供的疏水层析介质进行单克隆抗体IgG4的分离结果图。
图7是采用实施例9提供的疏水层析介质进行单克隆抗体IgG4的分离结果图。
图8是采用实施例1提供的疏水层析介质进行抗体-药物-偶联物(ADC)的分离结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了,所述实施例仅仅是帮助理解本发明,不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例和对比例所涉及的部分材料及厂家信息如下
实施例1
一种疏水层析介质,制备方法如下:
(1)制备带有环氧基的固体基质:
在干燥氮气保护下,将50g 3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷添加到50g硅胶A-1的甲苯(300mL中)分散液中,在100℃下搅拌24小时后,将反应混合物过滤,依次用甲苯、1,4-二氧六环和丙酮洗涤,然后在50℃的真空中干燥8小时,得到中间体I-a;
(2)制备带有中性亲水包覆层的中间体
在干燥氮气保护下,将40g乙二醇添加到50g中间体I-a的四氢呋喃(300mL)分散液中,在室温下搅拌15分钟后,将2mL三氟化硼乙醚加入到反应混合物中,然后将反应混合物加热至回流温度,继续搅拌8小时。反应结束后将反应混合物过滤并依次用丙酮、去离子水和丙酮洗涤;滤饼在50℃的真空中干燥8小时,得到中间体II-a;
(3)引入疏水基团
在干燥氮气保护下,将10g中间体II-a分散于30mL甲苯中,室温下继续搅拌分散液;向上述分散液中滴加1.0g异氰酸丁酯的10mL甲苯溶液;在100℃下搅拌8小时;反应结束后将反应混合物过滤并依次用丙酮、去离子水和丙酮洗涤;滤饼在50℃的真空中干燥8小时,得到疏水层析介质1A。
实施例2
与实施例1的区别仅在于,将步骤(3)中的1.0g异氰酸丁酯替换为0.5g异氰酸苯酯,得到疏水层析介质2。
实施例3
与实施例1的区别仅在于,将步骤(3)中的1.0g异氰酸丁酯替换为0.2g异氰酸辛酯,得到疏水层析介质3。
实施例4
一种疏水层析介质,制备方法如下:
与实施例1的区别仅在于,将步骤(1)中的硅胶A-1替换为硅胶A-2,得到疏水层析4。
实施例5
与实施例1的区别仅在于,将步骤(1)中的硅胶A-1替换为硅胶A-3,得到疏水层析介质5。
实施例6
与实施例2的区别仅在于,将步骤(1)中的硅胶A-1替换为硅胶A-3,得到疏水层析介质6。
实施例7
与实施例3的区别仅在于,将步骤(1)中的硅胶A-1替换为硅胶A-3,得到疏水层析介质7。
实施例8
与实施例1的区别仅在于,将步骤(1)中的硅胶A-1替换为硅胶A-4,得到疏水层析介质8。
实施例9
与实施例1的区别仅在于,将步骤(1)中的硅胶A-1替换为硅胶A-5,得到疏水层析介质9。
实施例10
与实施例1的区别仅在于,将步骤(2)中的乙二醇替换为二乙二醇,得到疏水层析介质1B。
实施例11
与实施例1的区别仅在于,将步骤(2)中的乙二醇替换为三乙二醇,得到疏水层析介质1C。
实施例12
与实施例1的区别仅在于,将步骤(3)中的1.0g异氰酸丁酯替换为0.5g异氰酸丁酯,得到疏水层析介质1D。
实施例13
与实施例1的区别仅在于,将步骤(3)中的1.0g异氰酸丁酯替换为0.2g异氰酸丁酯,得到疏水层析介质1E。
对比例1
与实施例1的区别仅在于,将步骤(2)中的40g乙二醇替换为40g正丁醇,并省略步骤(3),得到疏水层析介质11。
对比例2
与实施例1的区别仅在于,将步骤(3)中的1.0g异氰酸丁酯替换为10g异氰酸丁酯,得到疏水层析介质12。
对比例3
与实施例1的区别仅在于,将步骤(3)中的1.0g异氰酸丁酯替换为1.0g异氰酸十八烷酯,得到疏水层析介质13。
性能测试
对实施例和对比例提供的疏水层析介质进行性能测试,将待测试的疏水层析介质利用传统的高压浆料技术填充到4.6×100mm不锈钢柱中,然后进行测试,方法如下:
a、测试核糖核酸酶A、溶菌酶和胰凝乳蛋白酶的分离效率
测试条件:洗脱液,A:1.5M(NH4)2SO4的75mM磷酸盐缓冲液,pH=6.8;B:75mM磷酸盐缓冲液,pH6.8;C:异丙醇;
梯度洗脱:先用洗脱液A平衡10分钟后注入样品,0-1分钟,100%A,1-15分钟,100-0%A,0-80%B和0-20%C,然后再保持5分钟;流速,1mL/min;进样量,10μL;温度30℃;检测波长280nm。
样品:核糖核酸酶A(1mg/mL,峰1)、溶菌酶(1mg/mL,峰2)和胰凝乳蛋白酶(1mg/mL,峰3)。
图1是采用实施例1提供的疏水层析介质1A进行核糖核酸酶A、溶菌酶和胰凝乳蛋白酶的分离结果图。由图可知,随着硫酸铵浓度的降低,蛋白质按其疏水性由弱到强的顺序洗脱,这是典型的HIC行为,表明本发明成功制备得到了疏水层析介质。
图2是采用实施例2提供的疏水层析介质2进行核糖核酸酶A、溶菌酶和胰凝乳蛋白酶的分离结果图。由图可知,随着硫酸铵浓度的降低,蛋白质按其疏水性由弱到强的顺序洗脱,这是典型的HIC行为,表明本发明成功制备得到了疏水层析介质。
用对比例1中的疏水层析介质进行核糖核酸酶A、溶菌酶和胰凝乳蛋白酶的分离时,三个蛋白的保留时间明显比实施例1和2中的疏水层析介质短,而且峰形明显变宽。
用对比例2和3中的疏水层析介质进行核糖核酸酶A、溶菌酶和胰凝乳蛋白酶的分离时,三个蛋白的保留时间明显比实施例1和2中的疏水层析介质要强,并显现显著的非特异性吸附。
b、测试单克隆抗体IgG1的分离
测试条件:洗脱液,A:1.5M(NH4)2SO4的75mM磷酸盐缓冲液,pH=6.8;B:75mM磷酸盐缓冲液,pH6.8;C:异丙醇;
梯度洗脱:先用洗脱液A平衡10分钟后注入样品,0-1分钟,100%A,1-15分钟,100-0%A,0-80%B和0-20%C,然后再保持5分钟;流速,1mL/min;进样量,10μL;温度30℃;检测波长280nm。
样品:单克隆抗体IgG1(1mg/mL)。
图3是采用实施例1提供的疏水层析介质进行IgG1的分离结果图。在图中,IgG1洗脱为尖峰,其中一些变体也得到分离,表明本发明提供的疏水层析介质适用于单克隆抗体分离。
图4是采用实施例9提供的疏水层析介质进行IgG1的分离结果图。在图中,IgG1洗脱为尖峰,其中一些变体也得到分离,表明本发明提供的疏水层析介质适用于单克隆抗体分离。
相比之下,使用对比例2和3中的疏水层析介质时,IgG1均未流出(吸附在分离介质上),显现出显著的非特异性吸附。
c、单克隆抗体IgG4的分离
测试条件:洗脱液,A:1.5M(NH4)2SO4的75mM磷酸盐缓冲液,pH=6.8;B:75mM磷酸盐缓冲液,pH=6.8;C:异丙醇;
梯度洗脱:先用洗脱液A平衡10分钟后注入样品,0-1分钟,100%A,1-15分钟,100-0%A,0-80%B和0-20%C,然后再保持5分钟;流速,1mL/min;进样量,10μL;温度30℃;检测波长280nm。
样品:单克隆抗体IgG4(1mg/mL)。
图5是采用实施例1提供的疏水层析介质进行IgG4的分离结果图。在图中,IgG4洗脱为尖峰,其中一些变体也得到分离,表明本发明提供的疏水层析介质适用于单克隆抗体分离。
图6是采用实施例2提供的疏水层析介质进行IgG4的分离结果图。在图中,IgG4洗脱为尖峰,其中一些变体也得到分离,表明本发明提供的疏水层析介质适用于单克隆抗体分离。
图7是采用实施例9提供的疏水层析介质进行IgG4的分离结果图。在图中,IgG4洗脱为尖峰,其中一些变体也得到分离,表明本发明提供的疏水层析介质适用于单克隆抗体分离。
d、抗体-药物-偶联物(ADC)的分离
测试条件:洗脱液,A:1.5M(NH4)2SO4的75mM磷酸盐缓冲液,pH=6.8;B:75mM磷酸盐缓冲液,pH=6.8;C:异丙醇;
梯度洗脱:先用洗脱液A平衡10分钟后注入样品,0-1分钟,100%A,1-15分钟,100-20%A,0-65%B和0-15%C,然后再保持5分钟;流速,1mL/min;进样量,10μL;温度30℃;检测波长280nm。
样品:抗体-药物-偶联物ADC(1mg/mL)。
图8是采用实施例1提供的疏水层析介质进行抗体-药物-偶联物(ADC)的分离结果图。由图可知,一个ADC以载药量的顺序洗脱出一系列峰,载药量较低的ADC的洗脱时间要早于载药量较高的ADC的洗脱时间,这表明本发明提供的疏水层析介质适用于ADC的DAR(药物-抗体比率)测定。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的疏水层析介质及其制备方法和应用,但本发明并不局限于上述工艺步骤,即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种疏水层析介质,其特征在于,包括固体基质以及包覆在固体基质表面的中性亲水包覆层;
其中,所述中性亲水包覆层上通过-OC(O)-NH-化学键合有疏水基团。
3.根据权利要求1或2所述的疏水层析介质的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括如下步骤:
(1)带有环氧基的固体基质与多元醇进行交联反应,形成中性亲水包覆层;
(2)将步骤(1)的产物与异氰酸酯进行反应,得到所述疏水层析介质。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)的产物与所述异氰酸酯的质量比为10:(0.1-1.5);
优选地,所述异氰酸酯选自C1-C8的异氰酸酯,进一步优选C1-C6的异氰酸酯,再进一步优选异氰酸丁酯、异氰酸辛酯或异氰酸苯酯中的任意一种或至少两种的组合。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)所述反应的温度为0-100℃,时间为1-24小时。
6.根据权利要求3-5中的任一项所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述多元醇包括乙二醇、二乙二醇或三乙二醇中的任意一种或至少两种的组合;
优选地,所述带有环氧基的固体基质与多元醇的质量比为(1-10):(10-1)。
7.根据权利要求3-6中的任一项所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述交联反应的催化剂为三氟化硼醚化物类催化剂,选自三氟化硼乙醚;
优选地,所述交联反应在溶剂中进行,所述溶剂为四氢呋喃和/或1,4-二氧六环;
优选地,所述交联反应的温度为0-120℃或溶剂的回流温度,时间为1-24小时。
8.根据权利要求3-7中的任一项所述的制备方法,其特征在于,所述带有环氧基的固体基质的制备方法包括如下步骤:
(A)将固体基质与带有环氧基的硅烷化试剂进行反应,得到所述带有环氧基的固体基质。
9.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,所述固体基质与所述带有环氧基的硅烷化试剂的质量比为(1-5):(5-1);
优选地,所述带有环氧基的硅烷化试剂选自3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷;
优选地,步骤(A)中所述反应在溶剂中进行,所述溶剂为甲苯、二甲苯或1,4-二氧六环中的任意一种或至少两种的组合;
优选地,步骤(A)中所述反应的温度为0-140℃,时间为8-48小时。
10.根据权利要求1或2所述的疏水层析介质在蛋白分离或单抗分离中的应用。
Priority Applications (1)
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