CN115814773A - 改性硅胶微球及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种改性硅胶微球及其制备方法和应用。所述改性硅胶微球包括：硅胶母球，所述硅胶母球表面具有羟基；经所述羟基接枝于所述硅胶母球的环氧基化合物，所述环氧基化合物具有环氧基；经所述环氧基接枝于所述环氧基化合物的第一修饰化合物和第二修饰化合物，所述第一修饰化合物具有羟基，所述第二修饰化合物具有仲胺基团、叔胺的质子化离子基团和季胺离子基团中的一种或多种。上述改性硅胶微球能够作为分离介质对单抗和双抗的分离发挥独特的分离选择性。
Description
技术领域
本申请涉及色谱技术领域，特别是涉及一种改性硅胶微球及其制备方法和应用。
背景技术
抗体治疗是诊断和治疗广泛疾病的有效方法，包括自身免疫性疾病、心血管疾病、传染病、癌症和炎症等领域均有应用。因此抗体类生物大分子是快速增长的生物药市场的重要组成部分，近年来发展迅猛。在生物药物的开发和生产过程中，必须检测、表征和量化杂质以及结构变异和修饰，并监测产品的稳定性，这是证明其安全性和有效性的关键。
然而，由于翻译后修饰(PTMs)的原因，单克隆抗体(mAbs)通常表现出复杂的微观异质性，包括糖基化(glycosylation)、末端修饰(modifications on the termini)、氧化(oxidation)，脱酰胺(deamidation)、异构化(isomerization)、二硫键的还原(reductionof disulfide bond)、聚体形成(aggregation)等。因此，抗体类生物药的检测质量控制和稳定性评价是一项极具挑战性的任务。
发明内容
基于此，本申请提供一种改性硅胶微球及其制备方法和应用。
本申请的第一方面，提供一种改性硅胶微球，包括：
硅胶母球，所述硅胶母球表面具有羟基；
经所述羟基接枝于所述硅胶母球的环氧基化合物，所述环氧基化合物具有环氧基；
经所述环氧基接枝于所述环氧基化合物的第一修饰化合物和第二修饰化合物，所述第一修饰化合物具有羟基，所述第二修饰化合物具有仲胺基团、叔胺的质子化离子基团和季胺离子基团中的一种或多种。
本申请的第二方面，提供第一方面所述的改性硅胶微球的制备方法，包括如下步骤：
将所述环氧基化合物与所述硅胶母球进行接枝反应，制备第一物料；
将所述第一物料与所述第一修饰化合物和第二修饰化合物进行接枝反应。
本申请的第三方面，提供一种色谱填料，包括如第一方面所述的改性硅胶微球。
本申请的第四方面，提供一种色谱柱，包括柱管以及填充于所述柱管内的填料，所述填料包括第三方面所述的色谱填料。
本申请的第五方面，提供一种色谱检测方法，包括采用第三方面所述的色谱填料或第四方面所述的色谱柱进行检测的步骤。
本申请的第六方面，提供一种色谱和质谱联用检测方法，包括采用第三方面所述的色谱填料或第四方面所述的色谱柱进行检测的步骤以及进行质谱检测的步骤。
本申请的第七方面，提供第三方面所述的色谱填料或第四方面所述的色谱柱在蛋白类生物大分子的分离或检测中的应用。
上述改性硅胶微球，其分子结构具有体积排阻和阴离子交换混合模式，能够作为分离介质对单抗和双抗的分离发挥独特的分离选择性，进而较好地进行蛋白类生物大分子，如抗体类生物药的检测质量控制和稳定性评价。
附图说明
图1为本申请一示例中改性硅胶微球的制备方法的反应过程示意图；
图2为本申请实施例中涉及的材料结构；
图3为采用实施例1提供的分离介质3a和对比例1提供的分离介质4分离IgG单抗的结果对比图；
图4为采用实施例1提供的分离介质3a和对比例1提供的分离介质4分离双抗的结果对比图；
图5为采用实施例1提供的分离介质3a和对比例1提供的分离介质4分离ADC的结果对比图；
图6为采用实施例1提供的分离介质3a和对比例1提供的分离介质4在挥发性流动相(乙酸铵)中分离IgG单抗的结果对比图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本申请的改性硅胶微球及其制备方法和应用作进一步详细的说明。本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本申请公开内容理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。
本文中，“一种或多种”指所列项目的任一种、任两种或任两种以上。
本申请中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本申请中，涉及到数值区间，如无特别说明，上述数值区间内视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本申请中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。
本申请中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
本申请中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
本申请中的室温一般指4℃～30℃，较佳地指20±5℃。
本申请中，术语“烷基”是指包含伯(正)碳原子、或仲碳原子、或叔碳原子、或季碳原子、或其组合的饱和烃失去一个氢原子生成的一价残基。包含该术语的短语，例如，“C1～10烷基”是指包含1～9个碳原子的烷基，每次出现时，可以互相独立地为C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基、C6烷基、C7烷基、C8烷基、C9烷基或C10烷基。合适的实例包括但不限于：甲基(Me、-CH3)、乙基(Et、-CH2CH3)、1-丙基(n-Pr、n-丙基、-CH2CH2CH3)、2-丙基(i-Pr、i-丙基、-CH(CH3)2)、1-丁基(n-Bu、n-丁基、-CH2CH2CH2CH3)、2-甲基-1-丙基(i-Bu、i-丁基、-CH2CH(CH3)2)、2-丁基(s-Bu、s-丁基、-CH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-丙基(t-Bu、t-丁基、-C(CH3)3)、1-戊基(n-戊基、-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、1-己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3和辛基(-(CH2)7CH3)。
术语“烷氧基”是指结构为-O-烷基的基团，即如上所定义的烷基经由氧原子连接至相邻基团。包含该术语的短语，例如，“C1～C10烷氧基”是指烷基部分包含1～10个碳原子，每次出现时，可以互相独立地为C1烷氧基、C4烷氧基、C5烷氧基、C6烷氧基、C7烷氧基、C8烷氧基、C9烷氧基或C10烷氧基。合适的实例包括但不限于：甲氧基(-O-CH3或-OMe)、乙氧基(-O-CH2CH3或-OEt)和叔丁氧基(-O-C(CH3)3或-OtBu)。
术语“芳基”是指在芳香环化合物的基础上除去一个氢原子衍生的芳族烃基，可以为单环芳基、或稠环芳基、或多环芳基，对于多环的环种，至少一个是芳族环系。例如，“C6～C15芳基”是指包含6至15个碳原子的芳基，每次出现时，可以互相独立地为C6芳基、C7芳基、C8芳基、C9芳基、C10芳基、C12芳基、C14芳基、C15芳基。合适的实例包括但不限于：苯、联苯、萘、蒽、菲、二萘嵌苯、三亚苯及其衍生物。
术语“季胺离子基团”是指或质子化的胺或带正电的季铵阳离子(NR4+)，其中一个或多个氢原子被R取代或未取代，R的种类不作限制，在一些示例中可同R0。
术语“氨基”是指-NH2。
术语“胺基”是指在N(R)3的基础上除去一个氢原子形成的基团，其中R各自独立地为H、C1～C10烷基或C6～C15芳基，且R不同时为H。
目前，抗体类生物药的检测质量控制和稳定性评价需要高性能的分离介质来支撑，传统分离介质的分离原理包括Protein A、体积排阻(SEC)、离子交换(IEX)、疏水保留(HIC)和反相(RP)等。其中，体积排阻色谱(SEC)是一种不基于保留机制的分离模式，在抗体或融合蛋白的聚体和片段分析中应用广泛。然而，随着生物技术的不断发展，抗体类生物大分子的构成也日趋复杂，传统的体积排阻分离模式往往不能达到有效分离，因此现有的分离介质依然存在对单抗和双抗的分离选择性低的问题。
基于此，本申请的一些示例中提供一种改性硅胶微球，包括：
硅胶母球，所述硅胶母球表面具有羟基；可以理解地，该羟基为硅羟基(Si-OH)；
经所述羟基接枝于所述硅胶母球的环氧基化合物，所述环氧基化合物具有环氧基；
经所述环氧基接枝于所述环氧基化合物的第一修饰化合物和第二修饰化合物，所述第一修饰化合物具有羟基，所述第二修饰化合物具有仲胺基团、叔胺的质子化离子基团和季胺离子基团中的一种或多种。
上述改性硅胶微球，其分子结构具有体积排阻和阴离子交换混合模式，能够作为分离介质对单抗和双抗的分离发挥独特的分离选择性，且分离选择性可以调节。同时，上述改性硅胶微球作为分离介质还可以使用与质谱兼容的流动相进行单抗和双抗的分离，便于更高效地达到蛋白类生物大分子，如抗体类生物药的检测质量控制和稳定性评价的目的。
此外，上述改性硅胶微球的原料易得、合成方法简便，便于推广应用。
在其中一些示例中，所述第一修饰化合物包括具有如下式(I-1)～(I-3)所示结构特征的化合物中的一种或多种：
R1OH(I-1)
其中，R1为-C(R01)3，各R01各自独立地为H、羟基取代的C1～C10烷基、羟基取代的C6～C15芳基、羟基取代的聚醚或环氧官能团，且各R01不同时为H；
n为1～1000的整数；
m为10～1000的整数。
在其中一些示例中，n为1～5的整数。具体地，n为1、2、3、4、5。
在其中一些示例中，m为10～15的整数。具体地，m为10、11、12、13、14、15。
在其中一些示例中，所述第一修饰化合物包括具有式(I-2)所示结构特征的化合物中的一种或多种。进一步地，n为1～3的整数。更进一步地，n＝1。
不作限制地，所述第一修饰化合物包括如下化合物中的一种或多种：
在其中一些示例中，所述第二修饰化合物包括接枝于所述环氧基的第一接枝化合物，所述第一接枝化合物具有卤素基团；以及经所述卤素基团接枝于所述第一接枝化合物的胺基化合物。
在其中一些示例中，所述第一接枝化合物包括具有如下式(II-1)所示结构特征的化合物中的一种或多种：
R2Z2OH(II-1)
其中，R2为卤素基团；
Z2为C1～C10亚烷基或C6～C15亚芳基。
在其中一些示例中，R2为氯或溴。具体地，R2为氯。
在其中一些示例中，Z2为C1～C5亚烷基。进一步地，Z2为C1～C3亚烷基。具体地，Z2为乙基。
不作限制地，所述第一接枝化合物包括如下化合物中的一种或多种：
在其中一些示例中，所述胺基化合物包括具有如下式(II-2)所示结构特征的化合物中的一种或多种：
N(R0)3(II-2)
其中，各R0各自独立地为H、C1～C10烷基、C6～C15芳基、羟基取代的C1～C10烷基、羟基取代的C6～C15芳基、氨基取代的C1～C10烷基、氨基取代的C6～C15芳基或氨基取代的胺基。
在其中一些示例中，各R0不同时为H。
在其中一些示例中，各R0各自独立地为H、C1～C10烷基或羟基取代的C1～C10烷基。进一步地，各R0各自独立地为H、C1～C5烷基或羟基取代的C1～C5烷基。更进一步地，各R0各自独立地为H、甲基、乙基、羟基取代的甲基或或羟基取代的乙基。
不作限制地，所述胺基化合物包括如下化合物中的一种或多种：
在其中一些示例中，所述环氧基化合物包括具有环氧基的烷氧基硅烷类化合物。
在其中一些示例中，所述环氧基化合物包括具有如下式(III)所示结构特征的化合物中的一种或多种：
其中，X1、X2和X3各自独立地为H、C1～C10烷基、C6～C15芳基、C1～C10烷氧基、C6～C15芳氧基或卤素，且至少一个为C1～C10烷氧基、C6～C15芳氧基或卤素。
在其中一些示例中，X1、X2和X3各自独立地为C1～C5烷基或C1～C5烷氧基，且至少一个为C1～C5烷氧基。进一步地，X1、X2和X3各自独立地为甲基、乙基、甲氧基或乙氧基。
不作限制地，所述环氧基化合物包括如下化合物中的一种或多种：
在其中一些示例中，所述硅胶母球的粒径为1μm～100μm。具体地，所述硅胶母球的粒径包括但不限于：1μm、1.5μm、1.8μm、2μm、2.5μm、3μm、4μm、4.5μm、5μm、8μm、10μm、12μm、15μm、20μm、30μm、50μm、80μm、100μm。进一步地，所述硅胶母球的粒径为1μm～10μm。
在其中一些示例中，所述硅胶母球的孔径为100埃～3000埃。具体地，所述硅胶母球的孔径包括但不限于：100埃、120埃、150埃、170埃、200埃、250埃、280埃、300埃、320埃、350埃、400埃、450埃、480埃、500埃、520埃、550埃、600埃、800埃、900埃、950埃、1000埃、1050埃、1200埃、1500埃、2000埃、2500埃、3000埃。进一步地，所述硅胶母球的孔径为100埃～1000埃。
在其中一些示例中，所述硅胶母球的孔容积为0.6～2mL/g。具体地，所述硅胶母球的孔容积包括但不限于：0.6mL/g、0.65mL/g、0.8mL/g、1mL/g、1.2mL/g、1.42mL/g、1.44mL/g、1.45mL/g、1.47mL/g、1.5mL/g、1.7mL/g、2mL/g。进一步地，所述硅胶母球的孔容积为0.6～1.5mL/g。
在其中一些示例中，所述硅胶母球的比表面积为10～1000m2/g。具体地，所述硅胶母球的比表面积包括但不限于：10m2/g、20m2/g、25m2/g、30m2/g、50m2/g、80m2/g、100m2/g、120m2/g、140m2/g、150m2/g、160m2/g、165m2/g、170m2/g、200m2/g、250m2/g、300m2/g、320m2/g、350m2/g、400m2/g、430m2/g、450m2/g、470m2/g、500m2/g、600m2/g、800m2/g、1000m2/g。进一步地，所述硅胶母球的比表面积为50～450m2/g。
本申请的另一些示例提供如上所述的改性硅胶微球的制备方法，包括如下步骤：
将所述环氧基化合物与所述硅胶母球进行接枝反应，制备第一物料；
将所述第一物料与所述第一修饰化合物和第二修饰化合物进行接枝反应。
在其中一些示例中，将所述第一物料与所述第一修饰化合物和第二修饰化合物进行接枝反应的步骤包括：
将所述第一物料与所述第一修饰化合物和第一接枝化合物混合，进行第一反应，制备中间物料；
将所述中间物料与所述胺基化合物混合，进行第二反应。
具体地，第一反应的步骤中：
在其中一些示例中，所述第一物料与所述第一修饰化合物和第一接枝化合物的质量比为1:(0.5～5):(0.05～2.0)。
在其中一些示例中，反应溶剂为四氢呋喃、1，4-二氧六环、甲苯和二甲苯中的一种或多种。
在其中一些示例中，反应在催化剂存在的条件下进行。进一步地，所述催化剂为三氟化硼乙醚。在其中一些示例中，所述催化剂的用量为所述硅胶母球质量的1％～10％。
在其中一些示例中，反应温度为加热至50℃到回流温度，反应时间为1h～20h。
在其中一些示例中，反应在氮气保护下进行。
具体地，第二反应的步骤中：
在其中一些示例中，所述中间物料与所述胺基化合物的质量比为1:(0.3～2)。
在其中一些示例中，反应溶剂为四氢呋喃、水、1，4-二氧六环、乙腈和甲醇中的一种或多种。
在其中一些示例中，反应温度为室温或加热至40℃～60℃，反应时间为1h～20h。
具体地，将所述环氧基化合物与所述硅胶母球进行接枝反应的步骤中：
在其中一些示例中，所述环氧基化合物与所述硅胶母球的质量比为1:(0.5～5)。
在其中一些示例中，反应溶剂为甲苯、二甲苯、四氢呋喃和1，4-二氧六环中的一种或多种。
在其中一些示例中，反应温度为50℃～120℃，反应时间为2h～30h。
在其中一些示例中，反应在氮气保护下进行。
不作限制地，图1为本申请上述制备方法的反应过程示意图。
本申请的另一些示例提供一种色谱填料，包括如上所述的改性硅胶微球。
本申请的另一些示例提供一种色谱柱，包括柱管以及填充于所述柱管内的填料，所述填料包括如上所述的色谱填料。
不作限制地，所述柱管的材质为不锈钢、树脂或玻璃。其中，树脂举例可如聚醚醚酮(PEEK)树脂。
不作限制地，所述柱管的内径为1mm～1000mm。
不作限制地，所述柱管的长度为1mm～600mm。
本申请的另一些示例提供一种色谱检测方法，包括采用如上所述的色谱填料或如上所述的色谱柱进行检测的步骤。
不作限制地，检测对象为蛋白类生物大分子；进一步地，所述检测对象为抗体；更进一步地，所述检测对象为单抗、双抗或抗体偶联药物(ADC)；
不作限制地，流动相包括磷酸盐缓冲液体系和电解质。
在其中一些示例中，所述磷酸盐缓冲液体系的浓度为10mM～200mM，pH为6～8。
在其中一些示例中，所述电解质包括NaCl、Na2SO4、KCl、K2SO4和(NH4)2SO4中的一种或多种。进一步地，所述电解质在所述流动相中的浓度为50mM～500mM。
不作限制地，流动相的线流速为0.1～0.4mm/s。在其中一些示例中，对应4.6mm内径的色谱柱流动相的流速为0.1～0.4mL/min。
不作限制地，柱温为20℃～40℃。
不作限制地，检测器为紫外检测器。进一步地，检测波长为210nm或280nm。
本申请的另一些示例提供一种色谱和质谱联用检测方法，包括如上所述的色谱填料或如上所述的色谱柱进行检测以及进行质谱检测的步骤。
不作限制地，检测对象为蛋白类生物大分子；进一步地，所述检测对象为抗体；更进一步地，所述检测对象为单抗、双抗或抗体偶联药物(ADC)；
不作限制地，流动相包括可挥发性缓冲盐流动相。
在其中一些示例中，所述可挥发性缓冲盐流动相包括甲酸铵缓冲液体系和乙酸铵缓冲液体系中的一种或两种。
在其中一些示例中，所述可挥发性缓冲盐流动相的浓度为10mM～200mM，pH为4～7。
不作限制地，流动相的线流速为0.1～0.4mm/s。在其中一些示例中，对应4.6mm内径的色谱柱流动相的流速为0.1～0.4mL/min。
不作限制地，柱温为20℃～40℃。
不作限制地，检测器为紫外检测器。进一步地，检测波长为210nm或280nm。
本申请的另一些示例提供如上所述的色谱填料或如上所述的色谱柱在蛋白类生物大分子的分离或检测中的应用。
在其中一些示例中，所述蛋白类生物大分子为抗体；进一步地，所述蛋白类生物大分子为单抗、双抗或抗体偶联药物(ADC)。
在其中一些示例中，所述分离或检测的过程中采用可挥发性缓冲盐流动相作为流动相；进一步地，所述可挥发性缓冲盐流动相包括甲酸铵缓冲液体系和乙酸铵缓冲液体系中的一种或两种。
以下为具体的实施例，如无特别说明，实施例采用的原料均为市售产品。
实施例中的部分材料如下表1所示：
表1
实施例中涉及的材料结构如图2所示。
实施例1分离介质3a的制备方法
(1)制备带有环氧基的固体基质：在干燥氮气保护下，将50克3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷和50克硅胶A-1分散到300毫升甲苯中。在100℃下搅拌24小时后，将反应混合物过滤，依次用甲苯、二氧六环和丙酮洗涤，然后在50℃的真空中干燥8小时，得到中间体1a；
(2)制备带有亲水包覆层的中间体：在干燥氮气保护下，将40克乙二醇、4克氯乙醇和50克中间体1a的分散于300毫升四氢呋喃中。在室温下搅拌15分钟后，将2毫升三氟化硼乙醚加入到反应混合物中，然后将反应混合物加热至回流温度，继续搅拌8小时。反应结束后将反应混合物过滤并依次用丙酮、去离子水和丙酮洗涤；滤饼在50℃的真空中干燥8小时，得到中间体2a；
(3)引入阴离子交换基团：在干燥氮气保护下，将10克中间体2a分散于30毫升四氢呋喃中，室温下继续搅拌分散液，并向上述分散液中滴加5克二乙醇胺；在室温下搅拌8小时后，将反应混合物过滤并依次用丙酮、去离子水和丙酮洗涤；滤饼在50℃的真空中干燥8小时，得到混合机制分离介质3a。
实施例2分离介质3b的制备方法
制备带有环氧基的固体基质：在干燥氮气保护下，将50克3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷和50克硅胶A-1分散到300毫升甲苯中。在100℃下搅拌24小时后，将反应混合物过滤，依次用甲苯、二氧六环和丙酮洗涤，然后在50℃的真空中干燥8小时，得到中间体1a；
制备带有亲水包覆层的中间体：在干燥氮气保护下，将40克乙二醇、4克氯乙醇和50克中间体1a的分散于300毫升四氢呋喃中。在室温下搅拌15分钟后，将2毫升三氟化硼乙醚加入到反应混合物中，然后将反应混合物加热至回流温度，继续搅拌8小时。反应结束后将反应混合物过滤并依次用丙酮、去离子水和丙酮洗涤；滤饼在50℃的真空中干燥8小时，得到中间体2a；
引入阴离子交换基团：在干燥氮气保护下，将10克中间体2a分散于30毫升四氢呋喃中，室温下继续搅拌分散液，并向上述分散液中滴加5克甲基乙醇胺；在室温下搅拌8小时后，将反应混合物过滤并依次用丙酮、去离子水和丙酮洗涤；滤饼在50℃的真空中干燥8小时，得到混合机制分离介质3b。
实施例3分离介质3c的制备方法
制备带有环氧基的固体基质：在干燥氮气保护下，将50克3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷和50克硅胶A-1分散到300毫升甲苯中。在100℃下搅拌24小时后，将反应混合物过滤，依次用甲苯、二氧六环和丙酮洗涤，然后在50℃的真空中干燥8小时，得到中间体1a；
制备带有亲水包覆层的中间体：在干燥氮气保护下，将40克乙二醇、4克氯乙醇和50克中间体1a的分散于300毫升四氢呋喃中。在室温下搅拌15分钟后，将2毫升三氟化硼乙醚加入到反应混合物中，然后将反应混合物加热至回流温度，继续搅拌8小时。反应结束后将反应混合物过滤并依次用丙酮、去离子水和丙酮洗涤；滤饼在50℃的真空中干燥8小时，得到中间体2a；
引入阴离子交换基团：将10克中间体2a分散于30毫升去离子水中，室温下继续搅拌分散液，并向上述分散液中滴加10克三甲胺；在室温下搅拌8小时后，将反应混合物过滤并依次用去离子水和丙酮洗涤；滤饼在50℃的真空中干燥8小时，得到混合机制分离介质3c。
实施例4分离介质3d的制备方法
制备带有环氧基的固体基质：在干燥氮气保护下，将50克3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷和50克硅胶A-2分散到300毫升甲苯中。在100℃下搅拌24小时后，将反应混合物过滤，依次用甲苯、二氧六环和丙酮洗涤，然后在50℃的真空中干燥8小时，得到中间体1b；
制备带有亲水包覆层的中间体：在干燥氮气保护下，将40克乙二醇、4克氯乙醇和50克中间体1b的分散于300毫升四氢呋喃中。在室温下搅拌15分钟后，将2毫升三氟化硼乙醚加入到反应混合物中，然后将反应混合物加热至回流温度，继续搅拌8小时。反应结束后将反应混合物过滤并依次用丙酮、去离子水和丙酮洗涤；滤饼在50℃的真空中干燥8小时，得到中间体2b；
引入阴离子交换基团：在干燥氮气保护下，将10克中间体2b分散于30毫升四氢呋喃中，室温下继续搅拌分散液，并向上述分散液中滴加5克二乙醇胺；在室温下搅拌8小时后，将反应混合物过滤并依次用丙酮、去离子水和丙酮洗涤；滤饼在50℃的真空中干燥8小时，得到混合机制分离介质3d。
实施例5分离介质3e的制备方法
制备带有环氧基的固体基质：在干燥氮气保护下，将50克3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷和50克硅胶A-3分散到300毫升甲苯中。在100℃下搅拌24小时后，将反应混合物过滤，依次用甲苯、二氧六环和丙酮洗涤，然后在50℃的真空中干燥8小时，得到中间体1c；
制备带有亲水包覆层的中间体：在干燥氮气保护下，将40克乙二醇、4克氯乙醇和50克中间体1c的分散于300毫升四氢呋喃中。在室温下搅拌15分钟后，将2毫升三氟化硼乙醚加入到反应混合物中，然后将反应混合物加热至回流温度，继续搅拌8小时。反应结束后将反应混合物过滤并依次用丙酮、去离子水和丙酮洗涤；滤饼在50℃的真空中干燥8小时，得到中间体2c；
引入阴离子交换基团：在干燥氮气保护下，将10克中间体2c分散于30毫升四氢呋喃中，室温下继续搅拌分散液，并向上述分散液中滴加5克二乙醇胺；在室温下搅拌8小时后，将反应混合物过滤并依次用丙酮、去离子水和丙酮洗涤；滤饼在50℃的真空中干燥8小时，得到混合机制分离介质3e。
实施例6分离介质3f的制备方法
制备带有环氧基的固体基质：在干燥氮气保护下，将10克3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷和10克硅胶A-4分散到60毫升甲苯中。在100℃下搅拌24小时后，将反应混合物过滤，依次用甲苯、二氧六环和丙酮洗涤，然后在50℃的真空中干燥8小时，得到中间体1d；
制备带有亲水包覆层的中间体：在干燥氮气保护下，将8克乙二醇、1克氯乙醇和10克中间体1d的分散于60毫升四氢呋喃中。在室温下搅拌15分钟后，将0.5毫升三氟化硼乙醚加入到反应混合物中，然后将反应混合物加热至回流温度，继续搅拌8小时。反应结束后将反应混合物过滤并依次用丙酮、去离子水和丙酮洗涤；滤饼在50℃的真空中干燥8小时，得到中间体2d；
引入阴离子交换基团：在干燥氮气保护下，将10克中间体2d分散于30毫升四氢呋喃中，室温下继续搅拌分散液，并向上述分散液中滴加5克二乙醇胺；在室温下搅拌8小时后，将反应混合物过滤并依次用丙酮、去离子水和丙酮洗涤；滤饼在50℃的真空中干燥8小时，得到混合机制分离介质3f。
实施例7分离介质3g的制备方法
制备带有环氧基的固体基质：在干燥氮气保护下，将25克3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷和50克硅胶A-5分散到300毫升甲苯中。在100℃下搅拌24小时后，将反应混合物过滤，依次用甲苯、二氧六环和丙酮洗涤，然后在50℃的真空中干燥8小时，得到中间体1e；
制备带有亲水包覆层的中间体：在干燥氮气保护下，将40克乙二醇、4克氯乙醇和50克中间体1e的分散于300毫升四氢呋喃中。在室温下搅拌15分钟后，将2毫升三氟化硼乙醚加入到反应混合物中，然后将反应混合物加热至回流温度，继续搅拌8小时。反应结束后将反应混合物过滤并依次用丙酮、去离子水和丙酮洗涤；滤饼在50℃的真空中干燥8小时，得到中间体2e；
引入阴离子交换基团：在干燥氮气保护下，将10克中间体2e分散于30毫升四氢呋喃中，室温下继续搅拌分散液，并向上述分散液中滴加5克二乙醇胺；在室温下搅拌8小时后，将反应混合物过滤并依次用丙酮、去离子水和丙酮洗涤；滤饼在50℃的真空中干燥8小时，得到混合机制分离介质3g。
实施例8分离介质3h的制备方法
制备带有环氧基的固体基质：在干燥氮气保护下，将40克3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷和50克硅胶A-6分散到300毫升甲苯中。在100℃下搅拌24小时后，将反应混合物过滤，依次用甲苯、二氧六环和丙酮洗涤，然后在50℃的真空中干燥8小时，得到中间体1f；
制备带有亲水包覆层的中间体：在干燥氮气保护下，将40克乙二醇、4克氯乙醇和50克中间体1f的分散于300毫升四氢呋喃中。在室温下搅拌15分钟后，将2毫升三氟化硼乙醚加入到反应混合物中，然后将反应混合物加热至回流温度，继续搅拌8小时。反应结束后将反应混合物过滤并依次用丙酮、去离子水和丙酮洗涤；滤饼在50℃的真空中干燥8小时，得到中间体2f；
引入阴离子交换基团：在干燥氮气保护下，将10克中间体2f分散于30毫升四氢呋喃中，室温下继续搅拌分散液，并向上述分散液中滴加5克二乙醇胺；在室温下搅拌8小时后，将反应混合物过滤并依次用丙酮、去离子水和丙酮洗涤；滤饼在50℃的真空中干燥8小时，得到混合机制分离介质3h。
实施例9分离介质3i的制备方法
制备带有环氧基的固体基质：在干燥氮气保护下，将60克3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷和50克硅胶A-7分散到300毫升甲苯中。在100℃下搅拌24小时后，将反应混合物过滤，依次用甲苯、二氧六环和丙酮洗涤，然后在50℃的真空中干燥8小时，得到中间体1g；
制备带有亲水包覆层的中间体：在干燥氮气保护下，将40克乙二醇、4克氯乙醇和50克中间体1g的分散于300毫升四氢呋喃中。在室温下搅拌15分钟后，将2毫升三氟化硼乙醚加入到反应混合物中，然后将反应混合物加热至回流温度，继续搅拌8小时。反应结束后将反应混合物过滤并依次用丙酮、去离子水和丙酮洗涤；滤饼在50℃的真空中干燥8小时，得到中间体2g；
引入阴离子交换基团：在干燥氮气保护下，将10克中间体2g分散于30毫升四氢呋喃中，室温下继续搅拌分散液，并向上述分散液中滴加5克二乙醇胺；在室温下搅拌8小时后，将反应混合物过滤并依次用丙酮、去离子水和丙酮洗涤；滤饼在50℃的真空中干燥8小时，得到混合机制分离介质3i。
实施例10分离介质3j的制备方法
制备带有环氧基的固体基质：在干燥氮气保护下，将60克3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷和50克硅胶A-8分散到300毫升甲苯中。在100℃下搅拌24小时后，将反应混合物过滤，依次用甲苯、二氧六环和丙酮洗涤，然后在50℃的真空中干燥8小时，得到中间体1h；
制备带有亲水包覆层的中间体：在干燥氮气保护下，将40克乙二醇、4克氯乙醇和50克中间体1h的分散于300毫升四氢呋喃中。在室温下搅拌15分钟后，将2毫升三氟化硼乙醚加入到反应混合物中，然后将反应混合物加热至回流温度，继续搅拌8小时。反应结束后将反应混合物过滤并依次用丙酮、去离子水和丙酮洗涤；滤饼在50℃的真空中干燥8小时，得到中间体2h；
引入阴离子交换基团：在干燥氮气保护下，将10克中间体2h分散于30毫升四氢呋喃中，室温下继续搅拌分散液，并向上述分散液中滴加5克二乙醇胺；在室温下搅拌8小时后，将反应混合物过滤并依次用丙酮、去离子水和丙酮洗涤；滤饼在50℃的真空中干燥8小时，得到混合机制分离介质3j。
对比例1分离介质4的制备方法
第一步：在干燥氮气保护下，将50克3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷和50克硅胶A-1分散到300毫升甲苯中。在100℃下搅拌24小时后，将反应混合物过滤，依次用甲苯、二氧六环和丙酮洗涤，然后在50℃的真空中干燥8小时，得到中间体1a；
第二步：在干燥氮气保护下，将40克乙二醇和50克中间体1a的分散于300毫升四氢呋喃中。在室温下搅拌15分钟后，将2毫升三氟化硼乙醚加入到反应混合物中，然后将反应混合物加热至回流温度，继续搅拌8小时。反应结束后将反应混合物过滤并依次用丙酮、去离子水和丙酮洗涤；滤饼在50℃的真空中干燥8小时，得到SEC分离介质4。
应用实例1分离单抗
测试条件如下：
色谱填料：混合机制分离介质3a(实施例1)或SEC分离介质4(对比例1)
色谱柱规格：4.6×300mm
流动相：含有300mM NaCl的50mM磷酸盐缓冲液(pH6.8)
流速：0.35mL/min
温度：30℃
进样体积：10μL
检测方法：UV@280nm
样品:IgG单抗，分离前用去离子水稀释至浓度为1mg/mL。
测试结果如图3所示。由图3可知，SEC分离介质4显示正常的单体(主峰)和少量多聚体(主峰前的小峰)的分离；混合机制SEC分离介质3a表现出不同却具有优势的分离选择性，体现在：1)单抗及其相关物质的保留显著增强；2)主峰中分离出新的未知相关物质。
应用实例2分离双抗
测试条件如下：
色谱填料：混合机制分离介质3a(实施例1)或SEC分离介质4(对比例1)
色谱柱规格：4.6×300mm
流动相：含有300mM NaCl的50mM磷酸盐缓冲液(pH6.8)
流速：0.35mL/min
温度：30℃
进样体积：10μL
检测方法：UV@280nm
样品:双抗，分离前用去离子水稀释至浓度为1mg/mL。
测试结果如图4所示。由图4可知，与SEC分离介质4相比，混合机制SEC分离介质3a提供好的分离度。
应用实例3分离ADC
测试条件如下：
色谱填料：混合机制分离介质3a(实施例1)或SEC分离介质4(对比例1)
色谱柱规格：4.6×300mm
流动相：含有300mM NaCl的50mM磷酸盐缓冲液(pH6.8)
流速：0.35mL/min
温度：30℃
进样体积10μL
检测方法：UV@280nm
样品:ADC，分离前用去离子水稀释至浓度为1mg/mL。
测试结果如图5所示。由图5可知，SEC分离介质4只分离出一个峰，而混合机制SEC分离介质3a则分离出三个峰，表现出独特的选择性和分离优势。
应用实例4挥发性流动相适应性
测试条件如下：
色谱填料：混合机制分离介质3a(实施例1)或SEC分离介质4(对比例1)
色谱柱规格：4.6×300mm
流动相：100mM乙酸铵溶液(pH～7)
流速：0.35mL/min
温度：30℃
进样体积：10μL
检测方法：UV@280nm
样品：ADC，分离前用去离子水稀释至浓度为1mg/mL。
测试结果如图6所示。由图6可知，SEC分离介质4显示正常的单体(主峰)和少量多聚体(主峰前的小峰)的分离，而混合机制SEC分离介质3a表现出不同却具有优势的分离选择性，主峰中分离出新的未知相关物质。
同时，由于乙酸铵的可挥发性，是质谱兼容的流动相，由此证明混合机制SEC分离介质3a适用于采用质谱对抗体作进一步表征。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，便于具体和详细地理解本申请的技术方案，但并不能因此而理解为对申请专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本申请提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本申请所附权利要求的保护范围内。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (25)
1.一种改性硅胶微球，其特征在于，包括：
硅胶母球，所述硅胶母球表面具有羟基；
经所述羟基接枝于所述硅胶母球的环氧基化合物，所述环氧基化合物具有环氧基；
经所述环氧基接枝于所述环氧基化合物的第一修饰化合物和第二修饰化合物，所述第一修饰化合物具有羟基，所述第二修饰化合物具有仲胺基团、叔胺的质子化离子基团和季胺离子基团中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的改性硅胶微球，其特征在于，所述第一修饰化合物包括具有如下式(I-1)～(I-3)所示结构特征的化合物中的一种或多种：
R1OH(I-1)
其中，R1为-C(R01)3，各R01各自独立地为H、羟基取代的C1～C10烷基、羟基取代的C6～C15芳基、羟基取代的聚醚或环氧官能团，且各R01不同时为H；
n为1～1000的整数；进一步地，n为1～5的整数；
m为10～1000的整数；进一步地，m为10～15的整数。
3.根据权利要求1所述的改性硅胶微球，其特征在于，所述第二修饰化合物包括接枝于所述环氧基的第一接枝化合物，所述第一接枝化合物具有卤素基团；以及
经所述卤素基团接枝于所述第一接枝化合物的胺基化合物。
4.根据权利要求3所述的改性硅胶微球，其特征在于，所述第一接枝化合物包括具有如下式(II-1)所示结构特征的化合物中的一种或多种：
R2Z2OH(II-1)
其中，R2为卤素基团；进一步地，R2为氯或溴；
Z2为C1～C10亚烷基或C6～C15亚芳基；进一步地，Z2为C1～C5亚烷基。
5.根据权利要求4所述的改性硅胶微球，其特征在于，所述第一接枝化合物包括如下化合物中的一种或多种：
6.根据权利要求3所述的改性硅胶微球，其特征在于，所述胺基化合物包括具有如下式(II-2)所示结构特征的化合物中的一种或多种：
N(R0)3(II-2)
其中，各R0各自独立地为H、C1～C10烷基、C6～C15芳基、羟基取代的C1～C10烷基、羟基取代的C6～C15芳基、氨基取代的C1～C10烷基、氨基取代的C6～C15芳基或氨基取代的胺基；进一步地，各R0各自独立地为H、C1～C10烷基或羟基取代的C1～C10烷基。
7.根据权利要求6所述的改性硅胶微球，其特征在于，所述胺基化合物包括如下化合物中的一种或多种：
8.根据权利要求1所述的改性硅胶微球，其特征在于，所述环氧基化合物包括具有环氧基的烷氧基硅烷类化合物；进一步地，所述环氧基化合物包括具有如下式(III)所示结构特征的化合物中的一种或多种：
其中，X1、X2和X3各自独立地为H、C1～C10烷基、C6～C15芳基、C1～C10烷氧基、C6～C15芳氧基或卤素，且至少一个为C1～C10烷氧基、C6～C15芳氧基或卤素；更进一步地，X1、X2和X3各自独立地为C1～C5烷基或C1～C5烷氧基，且至少一个为C1～C5烷氧基。
9.根据权利要求8所述的改性硅胶微球，其特征在于，所述环氧基化合物包括如下化合物中的一种或多种：
10.根据权利要求1～9任一项所述的改性硅胶微球，其特征在于，所述硅胶母球具有如下所示特征中的一种或多种：
(1)所述硅胶母球的粒径为1μm～100μm；进一步地，粒径为1μm～10μm；
(2)所述硅胶母球的孔径为100埃～3000埃；进一步地，孔径为100埃～1000埃；
(3)所述硅胶母球的孔容积为0.6～2mL/g；进一步地，孔容积为0.6～1.5mL/g；
(4)所述硅胶母球的比表面积为10～1000m2/g；进一步地，比表面积为50～450m2/g。
11.权利要求1～10任一项所述的改性硅胶微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将所述环氧基化合物与所述硅胶母球进行接枝反应，制备第一物料；
将所述第一物料与所述第一修饰化合物和第二修饰化合物进行接枝反应。
12.根据权利要求11所述的改性硅胶微球的制备方法，其特征在于，将所述第一物料与所述第一修饰化合物和第二修饰化合物进行接枝反应的步骤包括：
将所述第一物料与所述第一修饰化合物和第一接枝化合物混合，进行第一反应，制备中间物料；
将所述中间物料与所述胺基化合物混合，进行第二反应。
13.根据权利要求12所述的改性硅胶微球的制备方法，其特征在于，第一反应的条件包括如下特征中的一种或多种：
(1)所述第一物料与所述第一修饰化合物和第一接枝化合物的质量比为1:(0.5～5):(0.05～2.0)；
(2)反应溶剂为四氢呋喃、1，4-二氧六环、甲苯和二甲苯中的一种或多种；
(3)反应在催化剂存在的条件下进行；进一步地，所述催化剂为三氟化硼乙醚；更进一步地，所述催化剂的用量为所述硅胶母球质量的1％～10％；
(4)反应温度为加热至50℃到回流温度，反应时间为1h～20h；
(5)反应在氮气保护下进行。
14.根据权利要求12所述的改性硅胶微球的制备方法，其特征在于，第二反应的条件包括如下特征中的一种或多种：
(1)所述中间物料与所述胺基化合物的质量比为1:(0.3～2)；
(2)反应溶剂为四氢呋喃、水、1，4-二氧六环、乙腈和甲醇中的一种或多种；
(3)反应温度为室温或加热至40℃～60℃，反应时间为1h～20h。
15.根据权利要求11～14任一项所述的改性硅胶微球的制备方法，其特征在于，将所述环氧基化合物与所述硅胶母球进行接枝反应的条件包括如下特征中的一种或多种：
(1)所述环氧基化合物与所述硅胶母球的质量比为1:(0.5～5)；
(2)反应溶剂为甲苯、二甲苯、四氢呋喃和1，4-二氧六环中的一种或多种；
(3)反应温度为50℃～120℃，反应时间为2h～30h；
(4)反应在氮气保护下进行。
16.一种色谱填料，其特征在于，包括权利要求1～10任一项所述的改性硅胶微球。
17.一种色谱柱，其特征在于，包括柱管以及填充于所述柱管内的填料，所示填料包括权利要求16所述的色谱填料。
18.根据权利要求17所述的色谱柱，其特征在于，包括如下所示特征中的一种的或多种：
(1)所述柱管的材质为不锈钢、树脂或玻璃；
(2)所述柱管的内径为1mm～1000mm；
(3)所述柱管的长度为10mm～600mm。
19.一种色谱检测方法，其特征在于，包括采用权利要求16所述的色谱填料或权利要求17～18任一项所述的色谱柱进行检测的步骤。
20.根据权利要求19所述的色谱检测方法，其特征在于，包括如下所示特征中的一种的或多种：
(1)检测对象为蛋白类生物大分子；进一步地，所述检测对象为抗体；更进一步地，所述检测对象为单抗、双抗或抗体偶联药物；
(2)流动相包括磷酸盐缓冲液体系和电解质；进一步地，所述磷酸盐缓冲液体系的浓度为10mM～200mM，pH为6～8；进一步地，所述电解质包括NaCl、Na2SO4、KCl、K2SO4和(NH4)2SO4中的一种或多种；更进一步地，所述电解质在所述流动相中的浓度为50mM～500mM；
(3)流动相的线流速为0.1～0.4mm/s；
(4)柱温为20℃～40℃；
(5)检测器为紫外检测器；进一步地，检测波长为210nm或280nm。
21.一种色谱和质谱联用检测方法，其特征在于，包括采用权利要求16所述的色谱填料或权利要求17～18任一项所述的色谱柱进行检测以及进行质谱检测的步骤。
22.根据权利要求21所述的色谱和质谱联用检测方法，其特征在于，包括如下所示特征中的一种的或多种：
(1)检测对象为蛋白类生物大分子；进一步地，所述检测对象为抗体；更进一步地，所述检测对象为单抗、双抗或抗体偶联药物；
(2)流动相包括可挥发性缓冲盐流动相；进一步地，所述可挥发性缓冲盐流动相包括甲酸铵缓冲液体系和乙酸铵缓冲液体系中的一种或两种；进一步地，所述可挥发性缓冲盐流动相的浓度为10mM～200mM，pH为4～7；
(3)流动相的线流速为0.1～0.4mm/s；
(4)柱温为20℃～40℃；
(5)检测器为紫外检测器；进一步地，检测波长为210nm或280nm。
23.权利要求16所述的色谱填料或权利要求17～18任一项所述的色谱柱在蛋白类生物大分子的分离或检测中的应用。
24.根据权利要求23所述的应用，其特征在于，所述蛋白类生物大分子为抗体；进一步地，所述蛋白类生物大分子为单抗、双抗或抗体偶联药物。
25.根据权利要求23所述的应用，其特征在于，所述分离或检测的过程中采用可挥发性缓冲盐流动相作为流动相；进一步地，所述可挥发性缓冲盐流动相包括甲酸铵缓冲液体系和
乙酸铵缓冲液体系中的一种或两种。
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