CN103028383A

CN103028383A - 一种硅胶色谱填料及其制备方法

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Publication number: CN103028383A
Application number: CN2012105949625A
Authority: CN
Inventors: 薛昆鹏; 赵岳星; 姚立新
Original assignee: Zhejiang Welch Materials Inc
Current assignee: Zhejiang Welch Materials Inc
Priority date: 2012-12-31
Filing date: 2012-12-31
Publication date: 2013-04-10
Anticipated expiration: 2032-12-31
Also published as: CN103028383B

Abstract

本发明提供一种具有两性离子的亲水性硅胶色谱填料的制备方法，包括如下步骤：(1)将硅胶活化预处理，制得活化硅胶；(2)将所述活化硅胶环氧基化改性，制得环氧基改性硅胶；(3)在环氧基改性硅胶上引入叔胺基，制得叔胺基改性硅胶；(4)在所述叔胺基改性硅胶上引入磺酸基，制得所述具有两性离子的亲水性硅胶色谱填料。本发明所制备的硅胶色谱填料静电作用小、对离子型或极性目标物具有较好吸附作用。

Description

一种硅胶色谱填料及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种硅胶色谱填料，特别涉及一种具有两性离子的亲水性硅胶色谱填料及其制备方法。

背景技术

近年来，随着生命科学、中药现代化、环境科学等研究领域的迅速发展，强极性、亲水性小分子以及碱性药物分子成为分析化学和药物化学领域研究的热点。然而，上述目标物在液相色谱中往往难于获得有效的分离。一方面，传统的反相色谱(RPLC)对上述目标物的保留和分离能力较弱，归因于上述目标物中极性官能团易于与流动相形成“偶极矩作用”，而与非极性固定相的该作用力却很弱，导致样品难于在色谱柱被保留，因而无法获得有效的分离；而另一方面，很多碱性药物分子在用以硅胶基质的反相键合色谱填料的液相色谱柱来评价其药效和纯度时，由于硅胶基质表面键合不完全，碱性目标物常与填料残余硅羟基产生“次级保留”作用，导致峰形拖尾严重；并且，碱性药物分子的亲水性很强，在酸性pH条件下所带的净电荷使其用RPLC也很难保留。并且，更为重要的是，在用正相色谱(NPLC)分离分析上述目标化合物时，其使用的流动相无法提供充分的溶解度；虽然采用离子交换色谱或离子对色谱代替RPLC能够对上述目标物进行分离分析，但这两种分离模式由于与质谱检测器的兼容性较差，因此具有很大的应用局限性。

Jane在1975年首次采用高浓度、高极性有机溶剂-水相缓冲液成功地分离了碱性药物分子(Jane I.J.Chromatogr.,1975,111:227-233.)；Alpert在1990年将这种色谱模式命名为亲水作用色谱(hydrophilic interactionchromatography,HILIC)，此后这种采用正相硅胶色谱柱/反相洗脱液的色谱系统引起了人们的广泛的关注。HILIC是一种以极性固定相(如硅胶或衍生硅胶)及含高浓度极性有机溶剂和低浓度水溶液为流动相的色谱模式。它与传统正相色谱(NPLC)相似，流动相的有机部分是弱溶剂，水溶液则是强溶剂。目标物根据亲水性增加的次序依次出峰，但所用的洗脱溶剂却与RPLC相似，采用与水互溶的极性有机溶剂如乙腈或甲醇；而不用NPLC中所用如正己烷及氯仿等溶剂。与RPLC分离碱性药物相比，该分离模式具有峰形对称、保留时间短以及重现性好等优点。最近几年该技术又与质谱联用，应用于生物样品中碱性化合物及其代谢产物的分离与鉴定。

默克公司专利(US20100300971)制备的两性离子亲水作用硅胶色谱填料

对强极性或亲水性离子型化合物具有较好的分离效果。该填料是在硅胶或聚合物表面键合了一个类似磺基甜菜碱结构的两性离子键合相。在该分离模式下，填料表面形成一个富集水的液体层，分析物在流动相和该水层之间进行分配，进而得以保留并分离。然而，该填料存在化合物与固定相的静电作用太强，化合物不易洗脱，需要采用高浓度的缓冲盐来调节，并且会抑制质谱信号、降低灵敏度等问题。因此，如何提供一种静电作用小、对离子型或极性目标物具有较好吸附作用的硅胶色谱填料已成为本领域急需解决的技术问题。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种具有两性离子的亲水性硅胶色谱填料及其制备方法。该具有两性离子的亲水性填料每个电荷的静电作用都会被邻近的反向电荷部分地平衡或抵消，因此总的静电作用较弱。较弱的静电作用允许流动相使用较低的缓冲盐浓度，能用作为HILIC模式用于液相色谱的分离分析；并且，由于使用温和的流动相也有利于提高质谱检测器的灵敏度。因而特别适用于极性、亲水性的小分子目标物以及碱性药物分子的分离分析。

为实现上述目的，本发明提供一种具有两性离子的亲水性硅胶色谱填料的制备方法，包括如下步骤：

(1)将硅胶活化预处理，制得活化硅胶；

(2)将所述活化硅胶环氧基化改性，制得环氧基改性硅胶；

(3)在环氧基改性硅胶上引入叔胺基，制得叔胺基改性硅胶；

(4)在所述叔胺基改性硅胶上引入磺酸基，制得所述具有两性离子的亲水性硅胶色谱填料。

根据本发明的构思，所述步骤(1)包括：将硅胶用蒸馏水清洗两次，然后用氢氟酸水溶液浸泡，随后用蒸馏水洗涤至pH值中性，最后用丙酮洗涤并干燥。

根据本发明的构思，所述步骤(2)包括：以甲苯为溶剂，将所述活化硅胶溶解均匀后，加入环氧基硅烷化试剂，在搅拌和回流下进行反应。

根据本发明的构思，所述步骤(3)包括：将所述环氧基改性硅胶与33wt%（质量百分比）的二甲胺水溶液在搅拌和回流下进行反应，待反应结束后，分别用蒸馏水和丙酮进行洗涤并真空干燥。

根据本发明的构思，所述步骤(4)包括：以乙腈为溶剂，将所述叔胺基改性硅胶与磺化试剂在搅拌和回流下进行反应，反应结束后，依次用水、甲醇和丙酮进行洗涤并真空干燥。

根据本发明的构思，在所述步骤(1)中，所述氢氟酸水溶液质量浓度为0.04-0.08%，所述硅胶的质量与氢氟酸水溶液的体积之比为1:8-1:10，所述氢氟酸水溶液浸泡的时间为22-24小时，优选24小时。

根据本发明的构思，在所述步骤(2)中，所述环氧基硅烷化试剂为γ-(2,3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷。

根据本发明的构思，在所述步骤(2)中，所述活化硅胶与环氧基硅烷化试剂的质量比为1:0.5-1:2，反应温度为90-110°C，反应时间为20-24小时。

根据本发明的构思，在所述步骤(2)中，所述活化硅胶与甲苯溶剂的质量体积比为1:4-1:6。

根据本发明的构思，在所述步骤(3)中，所述环氧基改性硅胶的质量与二甲胺水溶液的体积之比为1:3-1:8，反应温度为50-90°C，反应时间为16-20小时。

根据本发明的构思，所述磺化试剂为1,3-丙磺酸内酯，且所述叔胺基改性硅胶的质量与1,3-丙磺酸内酯的体积之比为1:0.5-1:2；反应温度为70-100°C，反应时间为46-50小时。

根据本发明的构思，在所述步骤(2)中，所述环氧基改性硅胶依次用蒸馏水、THF/水、THF以及乙腈清洗，其中THF/水的体积比为8:2，优选地，所使用的蒸馏水、THF/水、THF以及乙腈为热的；

为实现上述目的，本发明同时还提供一种具有两性离子的亲水性硅胶色谱填料，通过上述任一制备方法制备。

在本发明中，各反应步骤中所述的料液比为质量与体积之比。

本发明通过如下的措施来实现：鉴于环氧基团容易发生胺化放反应，本发明首先将全多孔的硅胶活化，然后利用活性硅羟基与γ-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷的硅烷化反应制备环氧基官能团改性的硅胶，随后利用具有高反应活性的环氧基团与二甲胺水溶液之间的胺化反应制备得到叔胺基改性硅胶，最后利用叔胺基改性硅胶与1,3-丙磺酸内酯之间和季铵化和磺化反应获得具有两性离子的亲水性硅胶色谱填料，该填料具有极强的亲水性，能够有效地保留反相色谱中保留弱或不保留的强极离子型目标物以及碱性药物分子。

本发明所制备的两性离子的亲水性硅胶色谱填料以具有共价键结合且强极性的两性官能团为基础，与传统的硅胶和氨基等HILIC填料相比能够提供更好的稳定性和更为优异的HILIC分离能力。

本发明是在反相色谱条件的分离模式下，以乙腈-水、甲醇-水等作为分离的流动相，流动相的流速为1.0mL/min，检测温度为25°C，紫外检测波长为214nm或260nm，分离的对象为尿囊素及其相关杂质，一磷酸腺苷(AMP)、尿甘酸(UMP)、鸟嘌呤(GMP)以及一磷酸胞苷(CMP)四种核苷酸等。

与常规的反相色谱填料相比，本发明所制备的具有两性离子的亲水性硅胶色谱填料具有以下优点：

1.流动相和固定相表面富集水层间的分配；

2.弱静电作用-同时和阴、阳离子作用的特殊选择性；

3.氢键和分子双极性作用；

4.与NPLC具有类似的保留行为，能为强极性的待测样品提供合适的保留；采用水水溶性有机相作为流动相，又能显著改善样品在流动相中的溶解度。

5.该填料在体现和RPLC正交的选择性的同时，具有与RPLC相媲美的柱效和对称的峰形；又与多种检测器-尤其是质谱-有良好的兼容性，因此是一种非常适合于强极性和强亲水性样品分离分析的新型填料。

附图说明

图1为本发明制备具有两性离子的亲水性硅胶色谱填料的方法的合成示意图。

图2为实施例1制备的硅胶色谱填料分离分析尿囊素及其相关杂质的效果示意图。

图3为实施例2制备的硅胶色谱填料分离分析四种核苷酸的效果示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。但本发明并不限于以下的实施例。

本发明提供一种具有两性离子的亲水性硅胶色谱填料的制备方法，包括如下步骤：

(1)将硅胶活化预处理，制得活化硅胶；

(2)将所述活化硅胶环氧基化改性，制得环氧基改性硅胶；

(3)在环氧基改性硅胶上引入叔胺基，制得叔胺基改性硅胶；

其中所述步骤(1)包括：将硅胶用蒸馏水清洗两次，然后用氢氟酸水溶液浸泡，随后用蒸馏水洗涤至pH值中性，最后用丙酮洗涤并干燥。

其中所述步骤(2)包括：以甲苯为溶剂，将所述活化硅胶溶解均匀后，加入环氧基硅烷化试剂，在搅拌和回流下进行反应。

其中所述步骤(3)包括：将所述环氧基改性硅胶与33wt%的二甲胺水溶液在搅拌和回流下进行反应，待反应结束后，分别用蒸馏水和丙酮进行洗涤并真空干燥。

其中所述步骤(4)包括：以乙腈为溶剂，将所述叔胺基改性硅胶与磺化试剂在搅拌和回流下进行反应，反应结束后，依次用水、甲醇和丙酮进行洗涤并真空干燥。

具体合成步骤过程，如图1所示。图1为本发明制备具有两性离子的亲水性硅胶色谱填料的方法的合成示意图。

以下为本发明制备具有两性离子的亲水性硅胶色谱填料的实施例，但本发明的构思及其应用原料/仪器并不限于。

实施例1：具有两性离子的亲水性硅胶色谱填料的制备

(1)往250mL反应容器中加入20g硅胶（5μm,购于日本大曹公司），并加入200mL蒸馏水搅拌30分钟、过滤，重复该步骤两次。然后加入160mL质量比为0.08%氢氟酸水溶液，搅拌24小时后用蒸馏水清洗至中性，最后加入200mL丙酮洗涤、过滤，110°C干燥12小时，得到经活化硅胶；

(2)称取活化硅胶20g(5μm,

)，置于500mL反应容器中；加入120mL甲苯：向反应容器中加入20mLγ-(2,3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷（美国Gelest公司），于97°C下回流搅拌反应20-22小时：依次用400mL热的超纯水、400mL热的THF/水(体积比80:20)、400mL热的THF以及400mL热的乙腈清洗制备好的填料、过滤，得到环氧基改性硅胶；

(3)向反应容器中加入“步骤(2)”中制备好的环氧基改性硅胶，并加入80mL33wt%二甲胺水溶液，水浴加热至60°C，搅拌回流反应18小时，冷却，用蒸馏水及丙酮洗涤数次，40°C真空干燥，即得叔胺基改性硅胶：

(4)将“步骤(3)”叔胺基改性硅胶置于500mL反应容器中，然后加入10g1,3-丙磺酸内酯和80mL乙腈，于80°C回流搅拌反应48小时：产物依次用水、甲醇和丙酮洗涤数次，真空干燥，即得两性离子亲水作用硅胶色谱填料。

实施例2：具有两性离子的亲水性硅胶色谱填料的制备

(1)往2L反应容器中加入100g硅胶，并加入200mL蒸馏水搅拌30分钟、过滤，重复该步骤两次。然后加入800mL质量比为0.08%氢氟酸水溶液，搅拌24小时后用蒸馏水清洗至中性，最后加入200mL丙酮洗涤、过滤，110°C干燥12小时，得到经活化的硅胶；

(2)称取活化的硅胶100g(5μm,

)，置于3L反应容器中；加入600mL甲苯：向反应容器中加入200mLγ-(2,3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷，于97°C下回流搅拌反应20-22小时：依次用2000mL热的超纯水、2000mL热的THF/水(80:20)、2000mL热的THF以及2000mL热的乙腈清洗制备好的填料、过滤，得到环氧基团改性硅胶；

(3)向反应容器中加入(2)步骤中制备好的环氧基改性硅胶，并加入600mL质量百分比浓度为33%的二甲胺水溶液，水浴加热至60°C，搅拌回流反应18小时，冷却，用蒸馏水及丙酮洗涤数次，40°C真空干燥，即得胺化硅胶微球：

(4)将胺化硅胶微球置于3L反应容器中，然后加入100g1,3-丙磺酸内酯和80mL乙腈，于80°C回流搅拌反应48小时：产物依次用水、甲醇和丙酮洗涤数次，60°C真空干燥24小时，即得两性离子亲水作用硅胶色谱填料。

以下为本发明制备具有两性离子的亲水性硅胶色谱填料的效果实施例，但本发明的构思及其应用原料/仪器并不限于。

实施例3：具有两性离子的亲水性硅胶色谱填料色谱柱亲水作用分离

将实施例1中的具有两性离子的亲水性硅胶色谱填料进行装柱，柱长250mm，柱内径4.6mm。装柱条件如下：装柱压力3000-7000psi，匀浆剂：三氯甲烷和环己醇，料液比为1:10，最后用甲醇顶替30min。以乙腈和水(80:20)为流动相，流速为每分钟0.8mL，检测波长为214nm，检测尿囊素及其相关杂质；效果如图2所示。图2是实施例1具有两性离子的亲水性硅胶色谱填料分离分析尿囊素及其相关杂质的效果示意图。横坐标是保留时间，单位为min，纵坐标是检测信号的响应值，单位为10^-3mV(毫伏)。实验表明：尿囊素样品用常规的C18柱难于获得满意的主峰与杂质峰分离度，并且C18柱的使用寿命也很短，而使用该两性离子的亲水性硅胶色谱填料填充的色谱柱进行分离时，其使用寿命也高于C18色谱柱。

实施例4：具有两性离子的亲水性硅胶色谱填料色谱柱亲水作用分离

将实施例2中的具有两性离子的亲水性硅胶色谱填料谱填料进行装柱，柱长250mm，柱内径4.6mm。装柱条件如下：装柱压力3000-7000psi，匀浆剂：三氯甲烷和环己醇，料液比为1:10，最后用甲醇顶替30min。以乙腈和水(80:20)为流动相，流速为每分钟0.8mL，检测波长为260nm，对AMP、UMP、GMP以及CMP这四种核苷酸进行测定。效果如图3所示。图3是实施例2具有两性离子的亲水性硅胶色谱填料分离分析四种核苷酸的效果示意图。横坐标是保留时间，单位为min，纵坐标是检测信号的响应值，单位为10^-3mV(毫伏)。由图可知：四种核苷酸能够在该色谱柱上或者较好的分离效果，并且能够在较短的时间内分离；而在普通的C18色谱柱却难于获得满意的分离度。

对比实施例：具有两性离子的亲水性硅胶色谱填料色谱柱与其他类型填料色谱柱的对比效果

将实施例2中的具有两性离子的亲水性硅胶色谱填料谱填料进行装柱，柱长250mm，柱内径4.6mm。装柱条件如下：装柱压力3000-7000psi，匀浆剂：三氯甲烷和环己醇，料液比为1:10，最后用甲醇顶替30min。以乙腈和水(80:20)为流动相，流速为每分钟0.8mL，检测波长为254nm，对ATP和TTP这二种核苷酸进行测定。通过与常规的C18柱、默克公司的

两性离子色谱柱对比发现，该色谱柱分离目标物的柱效、分离度明显优于常规的C18柱，其中对ATP和TTP的柱效分别为5919和6134，保留时间分别为5.75min和7.54min；而在常规的C18柱上保留时间很短，仅仅为1.5min左右，几乎和溶剂峰一起出来，而使用默克公司的

两性离子色谱柱分离ATP和TTP时，其柱效明显低于本方法制备的色谱填料色谱柱的柱效，仅仅为3024和3531，并且其保留时间也较本方法制备的色谱填料色谱柱分离这两种目标物的保留时间要长，这样也容易导致峰型展宽、峰灵敏度下降。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。

Claims

1.一种具有两性离子的亲水性硅胶色谱填料的制备方法，包括如下步骤：

(1)将硅胶活化预处理，制得活化硅胶；

(2)将所述活化硅胶环氧基化改性，制得环氧基改性硅胶；

(3)在环氧基改性硅胶上引入叔胺基，制得叔胺基改性硅胶；

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，

所述步骤(1)包括：

将硅胶用蒸馏水清洗两次，然后用氢氟酸水溶液浸泡，随后用蒸馏水洗涤至pH值中性，最后用丙酮洗涤并干燥；

所述步骤(2)包括：

以甲苯为溶剂，将所述活化硅胶溶解均匀后，加入环氧基硅烷化试剂，在搅拌和回流下进行反应；

所述步骤(3)包括：

将所述环氧基改性硅胶与33wt%的二甲胺水溶液在搅拌和回流下进行反应，待反应结束后，分别用蒸馏水和丙酮进行洗涤并真空干燥；

所述步骤(4)包括：

以乙腈为溶剂，将所述叔胺基改性硅胶与磺化试剂在搅拌和回流下进行反应，反应结束后，依次用水、甲醇和丙酮进行洗涤并真空干燥。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述氢氟酸水溶液质量浓度为0.04-0.08%，所述硅胶的质量与氢氟酸水溶液的体积之比为1:8-1:10，所述氢氟酸水溶液浸泡的时间为22-24小时。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述环氧基硅烷化试剂为γ-(2,3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述活化硅胶与环氧基硅烷化试剂的质量比为1:0.5-1:2，反应温度为90-110°C，反应时间为20-24小时。

6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述活化硅胶与甲苯溶剂的质量体积比为1:4-1:6。

7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述环氧基改性硅胶的质量与二甲胺水溶液的体积之比为1:3-1:8；反应温度为50-90°C，反应时间为16-20小时。

8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(4)中，且所述叔胺基改性硅胶的质量与1,3-丙磺酸内酯的体积之比为1:0.5-1:2；反应温度为70-100°C，反应时间为46-50小时。

9.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述环氧基改性硅胶依次用蒸馏水、THF/水、THF以及乙腈清洗。

10.一种具有两性离子的亲水性硅胶色谱填料，通过如权利要求1-9中任一项所述的制备方法制备。