CN1204963C - 杯芳烃键合硅胶固定相及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种杯芳烃键合硅胶固定相，其结构式为见右式。本发明还提供了上述杯芳烃键合硅胶固定相的制备方法，在相转移催化剂季铵盐存在下，将杯芳烃酚钠盐与卤代丙基键合硅胶在氮气或氩气中于110～120℃经固相缩合反应，制得所需杯芳烃硅胶键合固定相。该法制备的杯芳烃硅胶键合固定相性能稳定，适用于高效液相色谱、微柱液相色谱、电色谱分离分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种杯芳烃键合硅胶固定相及其制备方法和用途。
背景技术
色谱法在现代分离分析中具有举足轻重的地位，广泛应用于化学、生物、医药学、生命科学及环境科学，成为必不可少的研究手段。分离体系越来越复杂，特别是实际样品的分离分析对色谱技术尤其是色谱固定相提出了更高的要求，目前已经商品化的硅胶及改性硅胶种类十分丰富，但以十八烷基键合硅胶(ODS)为代表的反相色谱固定相已不能满足分离分析的要求。因此，高选择性的色谱固定相的研制和开发是色谱领域研究的核心内容之一。高选择性的“专属型”固定相种类繁多，主要有：为满足药物对映体分离需要的手性固定相；适应生化分离的蛋白质键合固定相；基于超分子作用的冠醚、环糊精、杯芳烃固定相以及专一型的分子印迹固定相。
蛋白质是天然手性大分子，与配体、酶等的相互作用具有高度立体选择性。蛋白质键合固定相具有独特的优点：多数对映体不需衍生化就可直接拆分；对具有生理活性物质的拆分也较为理想。但目前蛋白质键合固定相键合量小、成本高、使用寿命较短。冠醚是一类人工合成的具有一定环腔的大环聚醚化合物。冠醚键合固定相分离主要基于冠醚选择性地与阳离子或极性化合物形成主-客体包结配合物，不同配合物的稳定性存在差异，从而达到选择性分离。由于冠醚，尤其是衍生化的冠醚合成困难，因而这类固定相研究进展缓慢。环糊精键合固定相是近十多年来发展起来的新型固定相，也是研究最多的一类重要的手性固定相。二十世纪90年代以来，衍生化环糊精键合固定相得到了迅速发展并有不少已经商品化。对环糊精进行化学修饰，引入各种基团，提高分离选择性，对对映体进行手性拆分仍是研究的热点。但环糊精环腔体积大小单一，所涉及的客体对象主要限于中性分子。分子印迹聚合物固定相(MIPs)是受酶的抗体具有形状选择性的特点的启发，发展起来的基于主-客体作用，并主要用于手性拆分的固定相。MIPs对印迹分子的立体结构具有“记忆”功能，对预定的主-客体分子有高选择性，这是传统手性柱所不具备的。而这类固定相制备难度大，分离对象单一，“记忆”功能重现性差，因而应用有限。
杯芳烃是一类由苯酚单元通过亚甲基连接而成的大环化合物。能与中性分子及离子形成包合物，被誉为继冠醚和环糊精之后的第三代超分子化学主体分子。在离子选择性电极、催化、L-B膜分离、酶模拟等领域受到广泛的关注。在色谱领域，Mangia等首次报道将对-叔丁基杯[8]芳烃吸附在红色的硅藻土上成功分离醇类、氯代烃、及芳烃化合物(MangiaA，Pochini A，Ungaro R，Andreetti G.D，4-tert-butylcalix[8]arene as a stationary phase in Gas-solidchromatography Anal.Lett.1983，16，1027-1036)。90年代以来，杯芳烃在色谱中的应用不断取得进展。1993年，Park等首次把杯芳烃用于高效液相色谱，将磺化杯[6]芳烃添加到流动相中，基于溶质与杯芳烃形成主-客体包合物的稳定性差异，成功地分离了甲氧基苯酚、氨基苯酚及硝基苯酚位置异构体(J.H.Park，Y.K.Lee，N.Y.Cheng；M.D.Jang，Reversed phase liquidchromatographic separation of some mono-substituted phenols with calyx[6]arene-p-sulfonated modifiedEluents Chromatographia 37，1993，221-223)。1994年，Shohat等开始在高效毛细管电泳中采用杯芳烃作添加剂分离氯酚、苯二酚、甲基苯胺的位置异构体。程介克等以磺化杯[4]芳烃为添加剂，分离了硝基苯酚、氨基苯酚和苯二酚异构体，柱效高达3×105板/米。报道表明，杯芳烃在分离PAHs、苯二取代位置异构体、氨基酸酯、二肽、碱基、核苷、以及酸碱性药物等方面具有明显的优势，展示了杯芳烃在分离科学中的应用潜力。然而，杯芳烃溶解度差，加之作添加剂时，强紫外吸收干扰检测，使之应用有限，杯芳烃键合固定相的研究随之成为发展的主流。
所报道的杯芳烃键合固定相的制备方法有以下几种：硅氢加成、巯氢加成、以及缩合反应。这几种方法都是先通过衍生化反应制得杯芳烃硅烷化试剂，然后通过硅胶硅烷化反应制备键合固定相。反应过程长，耗时，各种有机中间体、杯芳烃硅烷化试剂纯化操作复杂。Glennon等通过硅氢加成制备了酯化杯[4]芳烃选择性地分离碱金属离子，发现杯[4]芳烃对Na+具有很高的选择性，其保留远远大于其它离子(J.D.Glennon，E.Horne，K.O’Connor，G.A.Kearney，S.J.Harris，M.A.McKervey，Chromatographic selectivity for amino acid esters and alkali metal ionson a silica bonded calix[4]arene tetraester stationary phase Anal.Proc.1994，31，33-35.)。随后，他们又采用巯氢加成制备酯化杯[6]芳烃。我们实验室先后分别用N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基甲基三乙氧基硅烷(WD-53)和γ-[(2，3)-环氧丙氧]丙氧三甲氧基硅烷(KH560)作偶联剂合成了对-叔丁基杯[4][6][8]芳烃键合固定相，并研究了它们在分离PAHs、位置异构体、核苷、碱基、磺胺和喹诺酮药物等方面的应用(p-tert-butyl-calix[8]arene-bonded silica stationary phase for highperformance liquid chromatography Anal..Lett.33，2000，3355-3372；Preparation and evaluation ofp-tert-butyl-Calix[4]arene-bonded silica stationary phases for high performance liquid chromatographyChromatographia 1999，49，643-648；Preparation and characterizations of p-tert-butyl-Calix[6]arene bondedsilica gel stationary phase for high performance liquid chromatography Chromatographia 1998，48，245-250)。此外，Krauss和Thomass等分别系统地研究了杯[4][6][8]芳烃在HPLC中的应用。其固定相均采用专利方法合成，未提供具体合成路线和技术。
发明内容
本发明就是针对上述问题提供一种杯芳烃键合硅胶固定相及其制备方法和用途，所得固定相稳定性高，适用于高效液相色谱、微柱液相色谱和毛细管电色谱，而且制法较简单。
本发明提供的技术方案是：一种杯芳烃键合硅胶固定相，其结构式为
式中n＝4～8；But为叔丁基。
本发明还提供了上述杯芳烃键合硅胶固定相的制备方法，在相转移催化剂季铵盐存在下，将杯芳烃酚钠盐与卤代丙基键合硅胶在氮气或氩气中于110～120℃经固相缩合反应，制得所需杯芳烃硅胶键合固定相。
上述杯芳烃酚钠盐以氢化钠和杯芳烃为反应物，以无水甲苯为溶剂，在50～60℃条件下制得。
上述杯芳烃包括杯芳烃母体及其衍生物。
本发明的杯芳烃键合硅胶固定相可用作高效液相色谱、微柱液相色谱或毛细管电色谱分离填料。
本发明采用固相表面连续反应制备杯芳烃键合固定相。卤代丙基键合硅胶(根据已有技术制备)是一种弱极性、弱疏水性的固定相，还可以作为中间体进一步合成含各种功能团的键合固定相。本发明将卤代丙基硅胶与杯芳烃酚钠盐通过固相缩合反应制备杯芳烃键合固定相；通过醚键连接的杯芳烃键合固定相稳定性高，从固定相分子结构设计上，采用三个亚甲基疏水短链连接可对硅胶表面硅羟基起立体屏蔽作用，降低键合硅胶的硅醇效应，改善色谱峰对称性。所得固定相适用于高效液相色谱、微柱液相色谱和毛细管电色谱，而且制法较简单。
具体实施方式
本发明杯芳烃键合硅胶固定相可通过下式所述的反应过程得到：
X＝Cl，Br，I n＝4～8
一、制备活化硅胶
称取一定量硅胶于一圆底烧瓶中，加入3mol/L盐酸，硅胶重量(g)及盐酸体积(mL)比为1∶10～1∶15。回流24小时，趁热用G-4型砂芯漏斗过滤，固体反复用二次水洗至中性，并用丙酮洗涤三次，先于红外灯下烘至硅胶分散，再于烘箱中160℃烘10小时以上，取出置于干燥器中冷至室温，将其迅速转至干燥枪中，水浴加热，真空干燥至少16小时，临用前取出。
二、卤代丙基键合硅胶的制备
于250ml三颈烧瓶中加入新蒸无水甲苯(无水甲苯用金属钠回流除水制备)，快速加入活化硅胶，再用移液管移取一定量偶联剂(卤代丙基三乙(甲)氧基硅烷)。干燥氮气(氮气预先经浓硫酸和氯化钙干燥)保护下，磁力搅拌(慢速)。硅胶质量(g)∶偶联剂(mmoL)∶无水甲苯(mL)一般为：10∶50∶500，滴加3滴新蒸三乙胺，油浴迅速升温至110～120℃，在回流状态下反应24小时(冷凝管上端加装有无水氯化钙的干燥管)，趁热用G-4砂芯漏斗抽滤，固体依次用甲苯、丙酮、甲醇、水、丙酮洗涤，得卤代丙基键合硅胶，真空干燥(100℃)8小时，保存于干燥器中备用。
三、杯芳烃酚钠盐的制备
称取一定量预先干燥的杯芳烃于250ml三颈烧瓶中，加入一定量新蒸无水甲苯，装上氮气导入管和氯化钙干燥管，通入氮气，开始搅拌(慢速)，迅速加入氢化钠粉末(空气中易变质)，油浴，恒温至50-60℃，加热搅拌2h，得杯芳烃酚钠盐悬浊液，移液管吸取上层液用于后续反应。
四、杯芳烃键合硅胶固定相的制备
杯芳烃酚钠盐中迅速加入相转移催化剂和卤代丙基键合硅胶，加速搅拌，并升温至110～120℃，回流状态下反应48小时。停止反应，趁热用G-4砂芯漏斗过滤，并用热的甲苯洗涤2～3次，再依次用丙酮、甲醇、二次蒸馏水、丙酮洗涤两次，红外灯下烘干，得固定相粗品。
五、浮选
取一50mL烧杯，加入30mL分析纯甲醇，再加入固定相粗品，超声波处理5分钟，静置约2小时，倾弃上层清液，再加入同样量甲醇并超声，将上层液显微观察，检查浮选效果，调整浮选次数及甲醇用量，一般浮选3～4次，过滤，用丙酮洗涤，烘干(100℃)，得杯芳烃键合硅胶固定相纯品，真空枪干燥8小时置于干燥器中备用。
六、原料投料比
活化硅胶(g)∶偶联剂(mmol)∶杯芳烃(mmol)∶氢化钠(mmol)∶相转移催化剂(mmol)
杯[8]芳烃一般为：1∶5∶0.2∶1.0∶0.4
杯[6]芳烃一般为：1∶5∶0.3∶1.2∶0.4
杯[4]芳烃一般为：1∶5∶0.4∶1.4∶0.4
溶剂按：硅胶(g)∶溶剂(mL)为：1∶50
根据杯芳烃的结构，上述用量比可作适当调整。
实施例：采用氯丙基三乙氧基硅烷为偶联剂和四丁基溴化铵为相转移催化剂，对-叔丁基杯[8]芳烃为原料，Kromasil 5μm球形硅胶为基质，制备杯芳烃硅胶键合固定相.按一至四步骤制备对-叔丁基杯[8]芳烃键合固定相。经红外光谱、热分析和元素分析表征，该固定相合成成功。
以氯丙基硅胶与KBr压片为参比，计算机进行本底扣除，得对-叔丁基杯[8]芳烃键合固定相的FTIR谱。光谱显示：ν2961.5cm-1；ν2929.7cm-1；ν2847.0cm-1饱和C-H的伸缩振动吸收峰；ν1599.1cm-1；ν1577.7cm-1；ν1487.6cm-1苯环骨架振动吸收峰；ν1477.9cm-1；ν1384.3cm-1 CH2、CH3弯曲振动峰；ν809.9cm-1对苯二取代的特征吸收峰。结果与对-叔丁基杯[8]芳烃的特征吸收带基本一致。热分析显示：固定相失重11.32％，与键合反应增重基本相符。元素分析结果见下表：
表1.对-叔丁基杯[8]芳烃键合相键合浓度
键合相 C(％) H(％) 键合浓度(mmolg-1)
CBS 8.98 2.12 0.06
CPS 3.21 0.38 0.10
附：固定相表面杯芳烃浓度：α＝W/M(μmolg-1)
W为固定相表面杯芳烃重量(g)，M为杯芳烃摩尔质量，α为固定相表面杯芳烃浓度(μmolg-1)。α为60～200μmolg-1(与杯芳烃结构有关)。
本发明先制备卤代丙基键合硅胶介体，中间体经过滤、洗涤，除去过量的反应物及副产物；减少有机中间体分离纯化等繁复操作。再将卤代丙基硅胶与杯芳烃酚钠盐通过固相缩合反应制备杯芳烃键合固定相。杯芳烃酚羟基在NaH作用下转变成钠盐，取上层液除去过量的NaH及NaOH副产物，防止强碱对硅胶基质的侵蚀，柱的渗透性明显得到改善；相转移催化剂的加入，提高反应活性和速率。
本发明固定相在高效液相色谱中的用途：按匀浆法高压填装不锈钢高效液相色谱柱(4.6×150mm)用于分离分析。
以甲醇-水(60∶40v/v)为流动相，甲苯为溶质，测得对-叔丁基杯[8]芳烃键合硅胶(CBS)柱效为24000塔坂/m。相同装柱和色谱条件下，氯丙基键合硅胶(CPS)和ODS柱的柱效分别为19000、15000塔板/m。CBS柱对异构体尤其是碱性胺类的分离，分离速度快，色谱峰对称，柱效高。硝基苯酚异构体在CBS上柱效为12000塔板/m而在ODS上，柱效为11500塔板/m；苯二胺异构体在CBS上，其柱效为19600塔板/m，；而相应在ODS柱上，柱效为6800塔板/m。从碱性溶质分离峰形看，溶质在CBS、CPS、ODS柱上的对称因子分别为1.00-1.30、1.20-1.80、1.17-3.20。明显改善了ODS柱对极性异构体分离柱效不高及对碱性物质拖尾的现象。这可能是由于对-叔丁基杯[8]芳烃大的环腔对硅羟基起着很好的屏蔽作用。分离实际样品如：激素。分离速度较ODS柱提高了一倍，并且有机改性剂含量大为减少，避免了ODS柱分离激素样品需梯度洗脱的缺点。因此，本发明制备的杯芳烃键合硅胶固定相较传统的ODS柱分析速度快，分离色谱峰(无论酸中碱性样品)对称，明显改善了ODS对碱性物拖尾现象；并且性能稳定，固定相不易流失，适用pH范围2-7。
Claims (5)
1.一种杯芳烃键合硅胶固定相，其结构式为：
式中n＝4～8；But为叔丁基。
2.权利要求1所述杯芳烃键合硅胶固定相的制备方法，其特征在于：在相转移催化剂季铵盐存在下，将杯芳烃酚钠盐与卤代丙基键合硅胶在氮气或氩气中于110～120℃经固相缩合反应，制得所需杯芳烃硅胶键合固定相。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：上述杯芳烃酚钠盐以氢化钠和杯芳烃为反应物，以无水甲苯为溶剂，在50～60℃条件下制得。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：杯芳烃为杯芳烃母体或其衍生物。
5.权利要求1所述杯芳烃键合硅胶固定相用作高效液相色谱、微柱液相色谱或毛细管电色谱分离填料。
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