CN1215329C - 一种杯芳烃硅胶键合固定相的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明采用功能偶联剂二次反应技术快速制备色谱键合固定相，该制备方法包括两步：第一步制备γ-环氧丙氧丙基硅胶前体。第二步以氢化钠和杯芳烃为反应物，以无水甲苯为溶剂，在70～80℃条件下制备杯芳烃酚钠盐，通过季铵盐相转移催化剂将杯芳烃钠盐带到上步硅胶前体表面，在氮气或氩气中于110～120℃条件下反应制备具有一定键合浓度的杯芳烃键合硅胶固定相。本发明方法简便、制备成本较低和制备方法适用面广，所制备的杯芳烃硅胶键合固定相表面键合率较高，对酸具有较高稳定性，适用于高效液相色谱、微柱液相色谱、电色谱分离分析及用作相关分离材料。

Description

一种杯芳烃硅胶键合固定相的制备方法

技术领域

本发明涉及一种杯芳烃键合硅胶固定相的制备方法。

背景技术

色谱法是近代分析化学中发展最快、应用最广的分离分析技术，并正在发展成高效、节能的分离工程技术，在化学、生物和生物技术、医药学、生命科学等众多领域发挥越来越重要的作用。色谱分析的基本要求是实现混合物各组分的分离，分离的实质则是基于被分析溶质与流动相和固定相之间的相互作用的差异。其中，高选择性固定相的研制是色谱系统的核心领域。在众多色谱固定相中，硅胶和改性硅胶开发时间最早，研究最为深入，目前仍然居主导地位。它的主要优点是：机械强度好，物理性质如比表面积、孔结构、孔径和孔容易于控制，表面硅醇基具有高反应活性，通过化学修饰能获得多种功能固定相。目前已商品化的硅胶及改性硅胶种类十分丰富。以十八烷基键合微粒硅胶(ODS)为代表的反相型固定相的应用曾经在HPLC常规分离分析中占80％以上，成为“广谱型”色谱固定相。然而，随着医药科学、生命科学和环境科学的飞速发展，分离对象的多样化和复杂化对色谱固定相的发展提出了挑战。高选择性的“专属型”固定相的涌现层出不穷，主要有：为满足药物对映体分离需要的手性固定相、适应生化分离的蛋白质键合固定相、基于超分子作用的冠醚、环糊精、杯芳烃固定相以及专一型的分子印迹固定相。近年来，快速分离的需要使新一代整体或连续床色谱固定相的研究和开发得到迅猛发展。色谱固定相的开发同时也促进了相关分离技术的发展。

毛细管电色谱{CEC}是近年来发展起来的一种新型微分离分析技术，由Pretorius在1974年首次提出；1981年由Jorgenson等得以实现。90年代以来，CEC技术和理论得到重视和发展，有关研究报道呈几何级数增加。CEC是在毛细管柱内填入固定相颗粒、管壁键合固定相或制成连续床形式，以电渗流(EOF)或电渗流结合压力驱动流动相，溶质基于在流动相和固定相间分配系数的不同及自身电泳淌度的差异得以分离。作为高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE)的杂化体，CEC具有一些优于两者的特点。

和HPLC相比，CEC的EOF平塞状流型可以克服HPLC抛物线流型导致的色谱峰离散和塔板高度增加。CEC柱效一般可达100,000-300,000plates/m，因而可以使用更短的柱子，缩短分离分析时间。EOF产生于填料表面，理论上其大小与填料粒径无关。作为驱动力不会产生压力梯度，可采用小粒径填料，降低传质阻力、提高柱效。尽管HPLC和CEC从原理和应用范围存在众多不同，但固定相可相互借鉴，新型固定相的制备是HPLC和CEC的重要环节。

近年来，基于主客体作用的键合固定相，由于其高选择性和生物样品的兼容性，使之成为一类极具潜力的新型固定相。它主要包括：蛋白质键合固定相、冠醚键合固定相、环糊精键合固定相、分子印迹固定相和杯芳烃键合固定相。

蛋白质是天然手性大分子，与配体、酶的相互作用具有高度立体选择性。蛋白质键合固定相具有独特的优点：多种对映体溶质不需衍生化就可直接拆分；对生理活性物质的拆分也较为理想。但目前蛋白质键合固定相尚存在键合量小、成本高、使用寿命较短等不足。冠醚键合固定相冠醚是一类人工合成的具有一定环腔的大环聚醚化合物。分离主要基于冠醚选择性地与阳离子或极性化合物形成主-客体包结配合物，不同配合物的稳定性存在差异，从而呈现色谱选择性保留。近年来，有关冠醚固定相的研究主要集中在对映体分离。由于冠醚，特别是含特定功能基冠醚合成技术有一定难度、成本高，因而这类固定相研究进展缓慢。环糊精键合固定相环糊精固定相是近十多年来发展起来的新型固定相，也是研究最多的一类重要的手性固定相。二十世纪90年代以来，衍生化环糊精键合固定相得到了迅速发展。对环糊精进行化学修饰，引入可形成π-π、氢键和偶极-偶极等相互作用的基团，具有对映体分离能力。但环腔体单一，所涉及的客体对象主要限于中性分子。分子印迹聚合物固定相(MIPs)是受酶的抗体具有形状选择性的特点的启发，发展起来的基于主-客体作用，并主要用于手性拆分的固定相。MIPs对印迹分子的立体结构具有“记忆”功能，有预定的基于主-客体作用的高选择性，这是传统CSP所不具备的。这类固定相制备难度大，分离对象单一，“记忆”功能重现性差，因而应用有限。

杯芳烃是一类由苯酚单元通过亚甲基连接而成的大环化合物。这类化合物具有典型的穴腔结构和功能化的外缘，实验证实，杯芳烃能与许多离子和中性分子形成稳定的包容络合物，因而，被继冠醚和环糊精之后的“第三代主体分子”。杯芳烃能通过多种非共价超分子作用识别客体，从而实现配位、催化、传质和能量转换等特殊功能，使之成为超分子化学的重要研究对象之一。近20年来，杯芳烃化学得到迅速发展，杯芳烃在液膜传质、络合萃取、分子探针、分子器件、传感器、液晶、非线性光学、催化、模拟酶及分离分析等领域的应用潜力。

利用杯芳烃对溶质的分子识别作用，有望提高色谱分离的选择性。近年来，杯芳烃用于液相色谱和毛细管电泳的研究成为热点之一。1993年，Park等首次把杯芳烃用于高效液相色谱，将磺化杯[6]添加到流动相中，成功地分离了甲氧基苯酚、氨基苯酚及硝基苯酚位置异构体，分离是基于溶质与杯芳烃形成主一客体包合物的稳定性差异。1994年，Shohat等开始在高效毛细管电泳中采用杯芳烃作添加剂分离氯酚、苯二酚、甲基苯胺的位置异构体。程介克等以磺化杯[4]芳烃为添加剂，分离了硝基苯酚、氨基苯酚和苯二酚异构体，柱效高达3×10⁵板/米，展示了杯芳烃在分离科学中的应用潜力。然而，杯芳烃溶解度差，加之作添加剂时，强紫外吸收干扰检测，使之应用有限，杯芳烃键合固定相的研究应是发展的主流。

1993年，Glennon等首次制备了酯化杯[4，6]芳烃键合固定相，用于分离碱金属离子、苯甲酰胺及氨基酸酯类化合物，发现杯[4]芳烃的键合大大提高了对Na+的分离选择性，实验表明，苯甲酰胺及氨基酸酯中的N-H能与杯芳烃酯羰基通过氢键和诱导作用，形成外式(beside-cavity)络合物，从而实现良好分离。Gebauer等用对叔丁基杯[4，6，8]作固定相分离了对甲基嘧啶异构体，效果明显优于ODS柱和环糊精柱。此后，尽管陆续有相关报道但杯芳烃键合相种类很少，且所报道的键合反应适用面窄，制备过程复杂。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供一种杯芳烃键合硅胶固定相的制备方法，该方法简便、成本较低，所合成的杯芳烃键合固定相具有键合量较高、键合层稳定。

本发明提供的技术方案是：一种杯芳烃硅胶键合固定相的制备方法，在氮气氛下，按活化硅胶∶偶联剂∶无水甲苯10g∶50mmoL∶100mL的比例，将偶联剂γ-环氧丙氧基三甲氧基硅烷加入无水甲苯中，搅拌，然后加入活化硅胶，加入三乙胺，油浴升温至110～120℃，搅拌，在回流状态下反应6小时，停止加热，继续通氮气直至室温；过滤，固体用甲苯和丙酮洗涤，真空干燥，制得前体硅胶；以氢化钠和杯芳烃为反应物，以无水甲苯为溶剂，在70～80℃条件下制得杯芳烃酚钠盐；在相转移催化剂季铵盐存在下，将γ-环氧丙氧丙基硅胶与杯芳烃酚钠盐在氮气或氩气中于110～120℃反应，制得所需杯芳烃硅胶键合固定相。

本发明采用γ-环氧丙氧基三甲氧基硅烷(KH-560)为偶联剂，在强碱性和相转催化剂存在的条件下，合成了杯芳烃硅胶键合相。所得固定相经红外光谱、元素分析和化学分析表征了其结构，以甲醇-水(70∶30，体积比)为流动相，流速为0.8mL/min，4.6×150mm不锈钢柱中匀浆填充粒径为5μm上述杯芳烃硅胶键合固定相，以联苯为溶质，室温下测得柱效为80,000板/米。以不同种类溶质为探针，溶质包括：多环芳烃、烷基苯、取代苯酚和苯胺、N-取代苯胺、取代苯甲酸、碳簇、核苷酸、碱基、磺胺药物和中草药提取物等，较系统地研究了固定相的色谱性能。在研究色谱分离机理的基础上，研究发现在硅胶基质表面，杯芳烃与溶质存在着类似溶液状态下的包容络合作用，固定相通过包容络合作用对溶质进行分子识别，分子识别与其分离选择性密切相关。实验结果表明，采用本方法所合成的杯芳烃键合固定相具有键合量较高、键合层稳定、方法简便、制备成本较低和制备方法适用面广等特点。它不仅具有传统的ODS反相色谱性能，同时能提供包容络合、氢键作用、π-π作用及空间匹配等多种作用位点。因而一定程度上能替代传统ODS，且为难分离物质提供分离可能性。

具体实施方式

本发明制备杯芳烃硅胶键合硅胶固定相的合成方法如下：

一、活化硅胶

称取一定量硅胶于一圆底烧瓶中，加入3molmL^-1盐酸，硅胶重量(g)及盐酸体积(mL)比为1∶10～1∶15。浸泡10小时后，回流24小时，趁热用G-4型砂芯漏斗过滤，固体反复用蒸馏水洗至中性，并用丙酮洗涤两次，先于红外灯下烘至硅胶散开，再于烘箱中160℃烘6小时，取出后于干燥器中冷至室温，将其快速转至干燥枪中，水浴加热，真空干燥至少16小时，临用前取出。

二、前体硅胶的制备

于一装有冷凝管、氮气导入管、氯化钙干燥管和带磁力搅拌的干燥装置中，加入新蒸无水甲苯(无水甲苯用金属钠回流除水制备)，通入干燥氮气(氮气预先经浓硫酸和氯化钙干燥)，再移取一定量偶联剂γ-环氧丙氧基三甲氧基硅烷(KH-560)，开动磁力搅拌器(慢速)，搅拌5分钟，再快速加入一定量活化硅胶，硅胶重量(g)∶偶联剂(mmoL)∶无水甲苯(mL)一般为：10∶50∶100，滴加3滴新蒸三乙胺，油浴迅速升温至110～120℃，搅拌速度同时加快，在回流状态下反应6小时，停止加热，继续通氮气直至室温。用G-4砂芯漏斗过漏，固体用甲苯和丙酮反复洗至滤液清亮为止，最后用丙酮洗涤，真空干燥(80℃)，所得前体硅胶保存于干燥器中备用。

三、杯芳烃酚钠盐的制备(原料投料比参照第六条)

称取一定量预先干燥的杯芳烃于一圆底烧瓶中，加入一定体积的新制无水甲苯，装上回流冷凝管、氮气导入管和氯化钙干燥管，通入氮气，开始搅拌(慢速)，快速加入一定量氢化钠粉末(空气中易变质)，油浴，恒温至80℃，加热搅拌45分钟后，得杯芳烃酚钠盐悬浊液，继续下一步反应。

四、杯芳烃硅胶键合相的制备

迅速加入相转移催化剂季铵盐和前体硅胶，加速搅拌，并升温至110～120℃，回流状态下反应24小时。停止反应，趁热用G-4砂芯漏斗过漏，并用热的甲苯洗涤2～3次，再依次用丙酮、甲醇、二次蒸馏水反复洗涤至滤液清亮为止，最后用丙酮洗涤两次，红外灯下烘干，得固定相粗品。

五、浮选

取一50mL量筒，加入30mL分析纯甲醇，再加入固定相粗品，超声波处理30分钟，静置约5小时，倾弃上层清液，再加入同样量甲醇并超声，将上层液显微观察，检查浮选效果，调整浮选次数及甲醇用量，一般浮选3～4次，过滤，用丙酮洗涤，烘干(120℃)，得杯芳烃硅胶键合相纯品，真空枪干燥48小时后，用于元素分析及相关分析。

六、原料投料比

活化硅胶(g)∶偶联剂(mmol)∶杯芳烃(mmol)∶氢化钠(mmol)∶相转移催化剂(mmol)

杯[8]芳烃一般为：1∶5∶0.2∶1.0∶0.4

杯[6]芳烃一般为：1∶5∶0.3∶1.2∶0.4

杯[4]芳烃一般为：1∶5∶0.4∶1.4∶0.4

溶剂按：硅胶(g)∶溶剂(mL)为：1∶10

根据杯芳烃的结构，杯芳烃和氢化钠的用量可适当调整，一般不偏离标示量的20％，其它用量不变。

七、键合浓度

固定相表面杯芳烃浓度：α＝W/M(μmolg^-1)

W为固定相表面杯芳烃重量(g)，M为杯芳烃摩尔质量，α为固定相表面杯芳烃浓度(μmolg^-1)。

α为20～200μmolg^-1(与杯芳烃结构有关)。

采用γ-环氧丙氧基三甲氧基硅烷(KH-560)为偶联剂，四丁基溴化铵为相转移催化剂，对-叔丁基杯[8]芳烃为原料，Kromasil 5μm球形硅胶为基质，合成杯芳烃硅胶键合固定相示例

按一至四步骤制备对-叔丁基杯[8]芳烃键合相，该固定相对-叔丁基杯[8]芳烃浓度为：71μmolg^-1(根据碳元素含量，见表1)。

             表1.对-叔丁基杯[8]芳烃键合相键合浓度

键合相        C(％)        H(％)        键合浓度(μmolg^-1)

键合相        15.93        2.85         71

前体硅胶      8.40         1.42         875

固定相在高效液相色谱及电色谱分析中的用途：

按匀浆法高压填装不锈钢高效液相色谱柱(4.6×150mm)及毛细管电色谱柱(100μm，有效长度20cm，总长30cm)分离分析按常规方法实施。用于分离分析：烷基苯同系物、苯二酚和硝基苯胺位置异构体、取代苯甲酸、磺胺药物和多环芳烃。

Claims (1)

1.一种杯芳烃硅胶键合固定相的制备方法，其特征在于：在氮气氛下，按活化硅胶∶偶联剂∶无水甲苯10g∶50mmoL∶100mL的比例，将偶联剂γ-环氧丙氧基三甲氧基硅烷加入无水甲苯中，搅拌，然后加入活化硅胶，加入三乙胺，油浴升温至110～120℃，搅拌，在回流状态下反应6小时，停止加热，继续通氮气直至室温；过滤，固体用甲苯和丙酮洗涤，真空干燥，制得前体硅胶；以氢化钠和杯芳烃为反应物，以无水甲苯为溶剂，在70～80℃条件下制得杯芳烃酚钠盐；在相转移催化剂季铵盐存在下，将前体硅胶与杯芳烃酚钠盐在氮气或氩气中于110～120℃反应，制得所需杯芳烃硅胶键合固定相。