CN111818996B - 用于生物分离的复合材料 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于纯化从生物原料获得的蛋白质的复合材料。本发明的复合材料包括具有5‑500nm的平均孔径的多孔载体，所述多孔载体填充有交联的聚合物，其中所述聚合物选自具有2,000至500,000Da的重均分子量(Mw)和至少66％的甲酰胺基团水解度的聚乙烯胺或聚烯丙胺，条件是不包括具有27,200Da的重均分子量(Mw)和70％的水解度的聚乙烯胺以及具有50,000Da的重均分子量(Mw)和95％的水解度的聚乙烯胺。

Description

用于生物分离的复合材料
技术领域
本发明涉及用于纯化从生物原料获得的蛋白质的复合材料。
背景技术
在过去的几十年期间，在许多治疗和诊断应用中，蛋白质用作生物药物的相关性持续提高。特别感兴趣的一个领域是重组单克隆抗体(mAb)的使用。用于治疗炎症性疾病、糖尿病、各种癌症和血液疾病的批准的治疗性mAb及其片段的数量逐年增加。
由于mAb的药代动力学特性，在许多情况下，每位患者需要约0.1-1g的初始单次剂量，然后每周或每月一次给予相似剂量。因此，需要大量的治疗性mAb，并且因此必须以工业规模制造治疗性mAb。mAb是在诸如发酵液(滤液)和细胞培养物这样的生物原料中制造的，发酵液和细胞培养物在分泌重组抗体的表达水平及其杂质含量方面会有所不同。
要获得药物资格，目标蛋白必须基本不含任何与产品或过程相关的杂质，这些杂质经常在收获后被发现于细胞培养上清液或滤液中(例如，来自培养基中分泌的目标蛋白的细胞和细胞碎片)。这些污染物不仅包含来自基因工程宿主的蛋白质和核酸(DNA和RNA)(例如中国仓鼠卵巢宿主细胞蛋白(CHO-HCP)和相应的DNA(CHO-DNA))，还包含剩余的细胞培养补充剂，包括作为营养物或稳定剂添加的蛋白质(例如牛血清白蛋白-BSA或转铁蛋白)、盐、缓冲液、以及内毒素和致病菌或其片段。
用于目标蛋白的纯化的已知方法包括通过适当的膜过滤步骤(例如，通过与强阴离子交换膜结合)去除病毒、内毒素和一定程度上的核酸，以及在下游处理(DownstreamProcessing，DSP)中的后续单元操作期间去除低分子量水溶性污染物。但是，要完全去除广谱的不同HCP是一项艰巨的任务，到目前为止，这主要是通过应用多个专用制备色谱步骤来解决的。用于mAb和其他重组蛋白产品的DSP的色谱纯化方法包括亲和色谱、阳离子和阴离子交换、疏水作用和金属螯合亲和。最近，各种多峰和伪亲和色谱介质变得可用，并发现它们在各自的生产过程中的用途，例如，用于离子交换或亲和色谱步骤之后的产品抛光(EP-A-1807205)。在当前应用的色谱方法中，通常可发现两种经典的色谱模式：一种基于连续洗脱色谱过程，另一种基于“结合和洗脱”概念。
这些色谱分离方法的共同原理是各种色谱介质对生物样品中一种或多种成分的选择性吸附能力。因此，未结合的(或弱结合的)成分与(更多的)强结合的成分分离，并以相应的突破性级分(breakthrough fraction)出现。此外，通常可通过调整洗脱条件来形成具有升高或降低的离子强度、pH值或特定置换剂浓度的连续或逐步梯度以使结合成分彼此分离，以在导致选择性解吸单个成分的条件下获得基于体积和时间的变化。
在可用的色谱方法中，尺寸排阻色谱法(SEC)由于其生产率低、分辨率低和速度低，因此被认为不适合用于除抛光目以外的大规模操作。相比之下，工业色谱mAb纯化平台中最广泛使用的第一步之一是基于“捕获”或“结合并洗脱”亲和机制的。这样的过程涉及目标化合物的结合(“捕获”)，而大多数不需要的产物则保持未结合状态或可通过选择性洗脱步骤与目标物分离，从而在目标物质之前或之后释放结合的杂质。这种结合并洗脱过程的代表性例子是蛋白A的使用。
在mAb的亲和纯化中，免疫球蛋白在有利于目标蛋白与色谱材料非常牢固结合的条件下与固定的蛋白A特异性结合，而HCP和其他杂质仍大量未结合。因此，在洗去未结合的组分之后，可通过采用适当的酸性缓冲溶液冲洗柱子来将各柱子的pH从大约中性改变为相当酸性的条件(例如pH 3)来释放结合的免疫球蛋白。从理论上讲，由于蛋白A对于结合至抗体分子的不同遗传保守结构单元(structural motives)具有极高的特异选择性，因此在此步骤之后收集的免疫球蛋白产物应完全纯净。但是，在实际的技术生产过程中，许多副作用阻止了这种完美的一步纯化。在残留的HCP的这些共洗脱中，观察到了与蛋白A、色谱基质材料甚至免疫球蛋白结合的残留HCP。此外，可能会发生微量蛋白A及其降解产物的泄漏，显示出再次结合目标蛋白的可能性，在将pH按需迅速调整回与抗体稳定性兼容的范围后，尤其如此。将免疫球蛋白暴露于蛋白质A色谱法的特定工艺条件下，也可能由于内在的蛋白质不稳定性(例如聚集体形成、蛋白水解引起的部分降解和其他不利影响)而或多或少地导致不可逆的产物损失。
因此，一直需要额外的纯化步骤，以实现针对药物级抗体产品所定义的高纯度水平。这些步骤，包括离子交换和各种多峰色谱方法，对于进一步降低HCP和核酸水平，以及去除蛋白质聚集体和较低分子量的抗体降解产物是必需的。这样的纯化步骤有助于进一步降低产品产率，并且增加整个生产过程的昂贵的操作和费时的努力。因此，需要一种可在一步法中去除大部分杂质的技术。
已知使用复合吸附剂来纯化mAb和其他蛋白质的多种方法。在这些方法中，通常将复合吸附剂装填到色谱柱中。
WO95/025574公开了一种用于从生物流体去除污染物的方法，该方法包括使所述生物流体与覆盖但不共价结合到多孔矿物氧化物基质上的交联的疏水性聚合物网络接触，该多孔矿物氧化物基质的内部多孔体积基本上被所述疏水性网络填充，从而去除具有低于10,000Da的平均分子量的疏水性和两亲性分子。
US 6,783,962 B1涉及一种可用于生物大分子的分离/纯化的颗粒材料。该颗粒材料具有至少为2.5g/ml的密度，颗粒材料的颗粒具有5-75μm的平均直径，且颗粒材料的颗粒基本上由聚合物基础基质和无孔芯材构成，所述芯材具有至少3.0g/ml的密度。聚合物基础基质包括在pH 4.0下带正电荷或为生物分子亲和配体的侧基。
WO2004/073843公开了一种复合材料，该复合材料包括具有多个孔的载体构件和填充该载体构件的孔的大孔交联凝胶。还公开了一种用于从液体吸附生物分子或生物离子的方法，该方法包括使含有生物分子或生物离子的液体通过复合材料，该复合材料承载对大孔凝胶上的生物分子表现出特定相互作用的结合位点。
EP-A-2545989公开了一种用于色谱应用的复合材料，其包括多孔载体和在多孔载体表面上的交联聚合物，其中多孔载体的孔径[nm]与交联聚合物中交联度[％]之间的比率为0.25～20[nm/％]，并且其中交联度为5～20％，基于交联聚合物中的可交联基团的总数。
WO 2018/050849公开了一种复合材料的制备，该复合材料包括具有25nm的孔径的多孔硅胶和具有27,200Da的平均分子量以及70％的水解度(实施例1)的交联聚(乙烯基甲酰胺-共-聚乙烯胺)。在该文件的综述部分中，还提到了具有50,000Da的平均分子量且被水解为95％的聚乙烯胺。
US-A-2017/304803公开了一种吸附剂，其包含涂覆有诸如聚乙烯胺这样的含氨基聚合物的多孔载体材料。但是，该参考文献没有提及具有至少66％的甲酰胺基团水解度的聚乙烯胺。
Dragan,E.S.et al.,Macromol.Rapid Commun.,2010,vol.31,pp.317-322描述了一种复合材料的生产，该复合材料包括具有15至40μm的平均粒径，且最大孔径在4至6nm范围内并涂覆有交联的聚乙烯胺的二氧化硅微粒。该参考文献教导了二氧化硅的内孔是聚合物链难以接近的。
EP-A-2027921描述了一种多孔吸附介质，其包括具有第一外侧和第二外侧的基材，所述两侧都是多孔的，并且它们之间具有多孔厚度，所述基材具有基本上覆盖所述基材的固体基质的吸附材料以及所述第一和第二外表面，所述吸附材料包括具有附接的伯胺基的交联聚合物。在该参考文献中没有提及颗粒材料基材。
设计本发明以克服现有技术在生物分子纯化中的局限性。
发明内容
本发明的目的是提供一种复合材料，该复合材料实现对诸如mAb这样的蛋白质从包含其的生物原料中改进的纯化。
本发明的目的通过根据所附权利要求1的复合材料来实现。
具体地，本发明提供了一种复合材料，其包括：
具有5-500nm的平均孔径的多孔载体，所述多孔载体填充有交联的聚合物，
其中所述聚合物选自具有2,000至500,000Da的重均分子量(Mw)和至少66％的甲酰胺基团水解度的聚乙烯胺或聚烯丙胺，
条件是不包括具有27,200的重均分子量(Mw)和70％水解度的聚乙烯胺以及具有50,000的重均分子量(Mw)和95％的甲酰胺基团水解度的聚乙烯胺。
令人惊讶地发现，通过将指定的多孔载体与指定的交联聚合物结合，可获得具有增强的净化能力的复合材料。
本发明提供了一种用于从包含于相同溶液或悬浮液中的不需要的化合物中纯化目标蛋白的复合材料。该复合材料特别适合从诸如mAb这样的所制造的生物治疗剂中有效去除杂质，并且可被容易地整合到净化(clarification)或下游纯化工艺(DSP)中。
该复合材料优选可同时从蛋白质生产期间中获得的含蛋白质溶液中消耗DNA和HCP，并且还可以实现优异的蛋白质回收率。
本发明还涉及一种用于制备复合材料的方法，该方法包括以下步骤：
a)将具有5-500nm的平均孔径的多孔载体浸入含有聚合物、交联剂和溶剂的溶液或分散液中，以及
b)在低于250℃的温度下使聚合物与交联剂交联，
其中，所述聚合物选自具有2,000至500,000Da的重均分子量(Mw)和至少66％的甲酰胺基团水解度的聚乙烯胺或聚烯丙胺，条件是不包括具有27,200Da的重均分子量(Mw)和70％的甲酰胺基团水解度的聚乙烯胺以及具有50,000Da的重均分子量(Mw)和95％的甲酰胺基团水解度的聚乙烯胺。
还提供了本发明的复合材料在用于纯化原料中的目标蛋白中的用途。
此外，本发明提供了一种用于纯化原料中目标蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
i)使原料与本发明的复合材料接触足够的时间；
ii)将复合材料与经纯化的原料分离；
iii)任选地，从原料分离经纯化的目标蛋白；
iv)任选地，采用溶剂洗涤复合材料并收集所得溶液用于进一步处理。
具体实施方式
复合材料
在本说明书中，术语“复合物”、“复合材料”和“吸附剂”可互换使用。
在本说明书中，凡提及“孔径”均指“平均孔径”。
多孔载体材料具有5nm至500nm的平均孔径。结合以上或以下实施方式中的任一个，平均孔径优选为15nm至300nm，更优选为20nm至200nm，进一步优选为25nm至250nm，甚至更优选为30nm至200nm，并且最优选40nm至100nm。在本说明书中，多孔载体材料的平均孔径是根据DIN 66133通过压汞法来确定的。多孔载体材料可以是膜、中空纤维、无纺布、单片或颗粒材料。颗粒和单片多孔材料是优选的。在与以上或以下实施方式中的任一个组合的优选实施方式中，多孔载体材料是具有不规则形状或球形形状的颗粒状多孔载体材料。
在另一个优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任何一个组合地，所述多孔载体材料由金属氧化物、半金属氧化物、陶瓷材料、沸石或天然或合成聚合物材料组成。
在另一个优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任何一个组合地，所述多孔载体材料是多孔二氧化硅、氧化铝或二氧化钛颗粒。
在另一个优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任何一个组合地，所述多孔载体材料是多孔硅胶。
在另一个优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任何一个组合地，所述多孔载体材料是诸如纤维素、壳聚糖或琼脂糖这样的多孔多糖。
在另一个优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任何一个组合地，所述多孔载体材料是多孔合成聚合物，诸如聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚醚酮、聚烷基醚(polyalkymether)、聚芳基醚、聚乙烯醇或聚苯乙烯、或其混合物或共聚物。
在另一个优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任何一个组合地，所述多孔载体材料是具有1μm至500μm，优选在20μm至200μm之间，更优选在30至150μm，最优选35至100μm之间的平均粒径(直径)的颗粒材料。
在本说明书中，多孔载体的平均粒径(直径)和粒径分布通过马尔文激光衍射法测定。
在本说明书中，除非另有说明，否则术语“聚合物”是指交联之前的聚合物。
在本说明书中，术语“水解度”是指聚合物的甲酰胺基的“水解度”。
本发明的复合材料包含交联的聚合物。所述聚合物(被交联之前)选自具有2,000至500,000Da的重均分子量(Mw)且甲酰胺基团水解度至少为66％的聚乙烯胺或聚烯丙胺。
在本说明书中，聚乙烯胺和聚烯丙胺包括乙烯基胺或烯丙基胺的线型或支化均聚物，以及乙烯基胺或烯丙基胺与氨基或酰胺基的共聚物。
在另一个优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任何一个组合地，所述聚乙烯胺是乙烯基胺的线型或支化均聚物或乙烯基胺与乙烯基甲酰胺的共聚物。优选地，基于聚合物的结构单元的总数，乙烯基胺和乙烯基甲酰胺的共聚物包含1％至70％的乙烯基甲酰胺单元，更优选2％至40％的乙烯基甲酰胺单元，最优选5％至25％的乙烯基甲酰胺单元。在另一个优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任何一个组合地，所述聚烯丙胺是烯丙基胺的线型或支化均聚物或烯丙基胺和烯丙基甲酰胺的共聚物。优选地，基于聚合物的结构单元的总数，烯丙胺和烯丙基甲酰胺的共聚物包含1％至70％的烯丙基甲酰胺单元，更优选2％至40％的烯丙基甲酰胺单元，最优选5％至25％的烯丙基甲酰胺单元。
在一个优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任何一个组合地，聚乙烯胺或聚烯丙胺的重均分子量(Mw)为2,000至500,000Da，优选15,000至400,000Da，更优选20,000至300,000Da，最优选25,000至250,000Da。
在本说明书中，聚合物的重均分子量(Mw)通过与多角度光散射和折射率检测器(SEC-MALS-RI)偶联的尺寸排阻色谱法(SEC)确定。
在一个优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任何一个组合地，聚乙烯胺或聚烯丙胺的甲酰胺基水解度为67％至99％，更优选68％至94％，甚至更优选72％至90％，最优选75％至86％。
在本说明书中，根据以下方法通过1H-NMR确定聚合物的甲酰胺基团的水解度：
将5.25g聚合物称量到烧瓶中，并添加10ml水。旋转获得的混合物以得到均质的组合物，且最后在真空下于50℃蒸发直至观察到干燥的固体。将固体在高真空下(≤0.1毫巴)在80℃的烤箱中干燥15小时，以产生干燥残留物。
水解度根据以下参考文献中描述的方法通过1H-NMR(来自Brucker的400MHz装置，溶剂：D2O)基于水解基团相对于总可水解基团的量化而确定：
Q.Wen,A.M.Vincelli,R.Pelton,“Cationic polyvinylamine binding toanionic microgels yields kinetically controlled structures”,J ColloidInterface Sci.369(2012)223-230。
在另一个优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任何一个组合地，聚乙烯胺或聚烯丙胺的重均分子量(Mw)为15,000至80,000Da，优选20,000至70,000Da，更优选25,000至50,000Da，并且甲酰胺基团水解度为66％至90％，优选67％至80％，更优选68％至75％。
在另一个优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任何一个组合地，聚乙烯胺或聚烯丙胺的重均分子量(Mw)为100,000至500,000Da，优选150,000至400,000Da，更优选200,000至300,000Da，并且甲酰胺基团水解度为70％至99％，优选为75％至95％，更优选为75％至90％。
在另一个优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任何一个组合地，将第一聚合物交联至5至25％(mol/mol)的交联度。在优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任何一个组合地，交联度为6至15％(mol/mol)，优选为7至12％(mol/mol)，更优选为8至9％(mol/mol)。
在本说明书中，“交联度”被定义为交联剂/聚合物比率(也被称为“交联剂比率”)。“交联剂比率”被定义为交联剂相对于用于反应的聚合物溶液中存在的乙烯基胺结构单元的摩尔百分比(基于平均分子量)。
即，交联剂比率通过以下公式(1)计算：
(1)
Figure BDA0002667487070000091
其中，V1(ml)是交联剂的体积，d1(g/ml)是交联剂的密度，C1(wt％)是交联剂的浓度，W2(g)是聚合物溶液的重量，C2(wt％)是聚合物的浓度，Mw1(g/mol)是交联剂的分子量，且Mw2(g/mol)是平均单体单元分子量。
Mw2由以下公式(2)计算：
(2)Mw2＝(∑kNk×Mk)/∑kNk
其中，Nk是形成聚合物的k型单体单元的数目，Mk是k型单体单元的分子量(g/mol)。
交联聚合物可采用氨基或酰胺基以外的官能团衍生。然而，交联聚合物优选不采用这样的官能团衍生。
在优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任一个组合地，交联聚合物的浓度为基于干燥复合材料的总重量计，至少3％w/w，优选至少5％w/w，更优选至少7％w/w，且优选小于25％w/w，更优选小于20％w/w，最优选小于15％。
用于制造复合材料的方法
本发明的复合材料可按照以下方法制造：
a)将具有5～500nm的平均孔径的多孔载体浸入含有聚合物、交联剂和溶剂的溶液或分散液中；以及
b)在低于250℃的温度下使聚合物与交联剂交联，其中，所述聚合物选自具有2,000至500,000Da的重均分子量(Mw)和至少66％的甲酰胺基团水解度的聚乙烯胺或聚烯丙胺，条件是不包括具有27,200Da的重均分子量(Mw)和70％的甲酰胺基团水解度的聚乙烯胺以及具有50,000Da的重均分子量(Mw)和95％的甲酰胺基团水解度的聚乙烯胺。
具有至少两个反应性基团的任何交联剂均可被用于本发明。
在一个优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任何一个组合地，所述交联剂选自双环氧化物、二醛和二缩水甘油醚。在更优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任一个组合地，所述交联剂选自丙二醇二缩水甘油醚、丁二醇二缩水甘油醚、己二醇二缩水甘油醚、聚乙二醇二缩水甘油醚、戊二醛和丁二醛。更优选地，交联剂选自丁二醇二缩水甘油醚和己二醇二缩水甘油醚。
在优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任何一个组合地，交联剂比率为6至15％(mol/mol)，更优选为7至12％(mol/mol)，最优选为8至9％(mol/mol)。
可使用能够溶解或分散聚合物和交联剂的任何溶剂或介质，只要它在上述方法的步骤b)的条件下不与交联剂和聚合物反应或仅与之缓慢反应即可。在本文中，缓慢是指在步骤(b)的持续时间内，在交联剂与溶剂之间以及在聚合物与溶剂之间没有可观察到的反应。
在一个优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任一个组合地，所述溶剂是极性质子或极性非质子溶剂。在一个优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任何一个组合地，所述溶剂是选自水、C1-6醇(例如甲醇、乙醇、异丙醇和丁醇)及其混合物的极性质子溶剂。水是最优选的。
在一个优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任何一个组合地，将步骤a)中使用的聚合物交联剂溶液的pH调节到8至13，优选9至11，最优选10至11。pH调节可通过添加诸如NaOH或KOH这样的强碱进行。
在上述方法的步骤b)期间，温度优选为20至180℃，更优选40至100℃，最优选50℃和80℃。
在优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任何一个组合地，步骤b)的持续时间优选在1小时至100小时之间，更优选在8至60小时之间，最优选在18小时至48小时之间。
在另一个优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任何一个组合地，步骤b)在40至100℃下进行8至60小时，优选在50至80℃下进行12至50小时，更优选在60℃下进行24至48小时。在另一个优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任一个组合地，该方法进一步包括步骤c)，该步骤c)为在步骤b)之后水解交联剂的任何未反应的可交联基团。
复合材料的用途
在本说明书中，术语“原料”和“进料”可互换使用。
在本说明书中，术语“蛋白质”包括多肽。这样的多肽优选包含至少20个氨基酸残基，更优选40至80个氨基酸残基。
本发明的复合材料可用于纯化原料中的目标蛋白。
在优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任一个组合地，原料包括宿主细胞蛋白(host cell protein，HCP)和DNA、以及任选的RNA和其他核酸。
在本发明中，原料任选地包含白蛋白、内毒素、去污剂和微生物或其片段。
本发明还提供了一种用于纯化原料中目标蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
i)使原料与根据本发明的复合材料接触足够的时间；
ii)将复合材料与经纯化的原料分离；
iii)任选地，从原料中分离目标蛋白；以及
iv)任选地，采用溶剂洗涤复合材料并收集所得溶液用于进一步处理。
在优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任何一个组合地，目标蛋白是诸如单克隆抗体(mAb)(例如人免疫球蛋白(hlgG))这样的重组蛋白。
在优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任一个组合地，原料的溶剂是水，其任选地包含一种或多种缓冲剂、一种或多种盐和/或一种或多种改性剂。在一个优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任何一个组合地，原料是发酵肉汤上清液(过滤之前或之后)或细胞培养上清液(CCS)，其包含目标蛋白和DNA、RNA或作为杂质的其他核酸和宿主细胞蛋白(HCP)。
在一个优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任何一个组合地，该复合材料被用于间歇吸附过程中。在该实施方式中，在本发明的纯化方法的步骤i)中，将复合材料分散在原料中，并且在步骤ii)中，将复合材料与原料分离(例如通过离心分离)。
在另一个优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任何一个组合地，复合材料被填充在色谱柱中。
在本发明的用于纯化目标蛋白的方法中，使原料与根据本发明的复合材料接触足够的时间。在优选的实施方式中，与以下实施方式中的任何一个组合地，接触时间为1分钟至10小时，优选为3分钟至5小时，更优选为5分钟至1小时。
在一个优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任何一个组合地，在使复合材料与原料接触之前，使复合材料在具有低于8，优选3至7.5，更优选4至7且最优选为5至6的pH的水溶液中平衡。水溶液的pH值可采用任何合适的缓冲液调节。例如，一元酸或其盐可被用于调节pH。优选的一元酸是甲酸、乙酸、氨基磺酸、盐酸、高氯酸和甘氨酸。一元酸的优选盐是铵盐、烷基铵盐、钠盐和钾盐。
在一个优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任何一个组合地，pH采用乙酸铵调节。
在另一个优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任何一个组合地，pH采用磷酸盐缓冲盐水(PBS)调节。
在一个优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任何一个组合地，原料与复合材料的比率(进料体积与干燥的复合材料的重量)在2：1至100：1，优选5：1至80：1，更优选10：1至70：1，最优选20：1至50：1的范围内。从实现复合材料的有效利用的观点出发，优选原料与复合材料的高比率。在一个优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任何一个组合地，对在上述方法的步骤ii)中分离的包含吸附杂质的复合材料进行洗脱工序以洗脱所述杂质，从而使复合材料再生以进行进一步使用。
本发明的用于纯化目标蛋白的方法可包含本领域已知的其他纯化步骤。这样的纯化步骤的示例包括离子交换色谱、添加絮凝剂或沉淀剂、离心、结晶、亲和色谱(例如，使用包含蛋白A、蛋白G或其组合的分离介质)、膜过滤、深度过滤(采用硅藻土或活性炭)和应用整体式分离剂。
在一个优选的实施方式中，与以上或以下实施方式中的任何一个组合地，使用根据本发明的相同或不同的复合材料，本发明的用于分离目标蛋白的方法的步骤i)和ii)被依次重复多次(例如2、3、4、5、6次)。
下列实施例对本发明进行阐释。
实施例
实施例中使用的起始材料
在实施例的复合材料制备中使用了以下起始材料：
聚合物：
A1 Lupamin 4570(由巴斯夫提供)(乙烯基胺和乙烯基甲酰胺的共聚物)
A2 Lupamin 4570进一步水解至68％水解度
A3 Lupamin 4570进一步水解至86％水解度
A4 Lupamin 4570进一步水解至99％水解度
通过如下进一步水解聚合物A1来获得聚合物A2至A4。
在旋转台上通过温和搅拌将聚合物A1均质化30分钟。将经称量的量的经均质处理的聚合物放入圆底烧瓶中，并加入氢氧化钠水溶液，且在氮气流的保护下于80℃加热数小时。随后将混合物在室温(23℃)下冷却，通过使用盐酸溶液调节pH。表1中列出了准确的条件。
表1：获得聚合物A2至A4的实验条件
Figure BDA0002667487070000141
聚合物A1至A4的性质在下表2中给出。
表2：聚合物A1至A4的性质
聚合物 聚合物水解度<sup>*1)</sup> 聚合物浓度<sup>*2)</sup> dn/dc(ml/g) Mw Mw/Mn
A1 65％ 15％ 0.2997 29,600 1.8
A2 68％ 11％ 0.3104 25,200 1.2
A3 86％ 10％ 0.4219 25,200 1.3
A4 99％ 7％ 0.4219 25,000 1.2
*1)水解度通过1H-NMR确定。
*2浓度是基于元素分析结果估算的。
1)水解度
聚合物A1至A4的甲酰胺基团水解度通过1H-NMR如下确定。
采用以下通用方案制备聚合物样品用于NMR分析：
将5.25g市售的或进一步水解的聚合物称重到烧瓶中，并加入10ml的水。旋转混合物以得到均匀的组合物，最后在真空下于50℃蒸发直至观察到干燥的固体。将固体在高真空下(≤0.1毫巴)在80℃的烤箱中干燥15小时，得到干燥残留物。
水解度根据以下参考文献中所描述的方法通过1H-NMR基于游离胺基团相对于甲酰胺基团的量化而确定：
Q.Wen,A.M.Vincelli,R.Pelton,“Cationic polyvinylamine binding toanionic microgels yields kinetically controlled structures",J ColloidInterface Sci.369(2012)223-230。用于测量的1H-NMR系统为400MHz。干燥的样品溶解在D2O中。
2)聚合物浓度
基于元素分析确定聚合物A1至A4的聚合物浓度。采用1H-NMR部分中描述的相同方案制备样品，直到得到干燥残余物。元素分析仪是FLASH 2000有机元素分析仪(ThermoScientific)。
3)聚合物的重均分子量(Mw)、多分散性(Mw/Mn)和比折光指数增量(dn/dc)
聚合物的重均分子量(Mw)、多分散性(Mw/Mn)和比折光指数增量(dn/dc)如下确定。
使用与多角度光散射和折射率检测器(SEC-MALS-RI)偶联的尺寸排阻色谱(SEC)，并使用Zimm形式的瑞利-甘斯-德拜(Rayleigh-Gans-Debye)方程以确定重均分子量(Mw)。
在这种方法中，假定光散射信号与色谱图中任何一点的平均分子量和样品浓度以及比折光指数增量(dn/dc)成正比。因此，当获得dn/dc的值时，偶联了折射率检测器作为浓度检测器的光散射检测器可准确地确定色谱图中任何点的平均分子量，并且可通过分析整个色谱分布来确定重均分子量(Mw)。
在瑞利-甘斯-德拜方程(等式(1))中，光散射信号与色谱图中任何一点的平均分子量和样品浓度以及比折光指数增量(dn/dc)成正比。
R(θ)＝K＊MCP(θ)[1-2A2 MCP(θ)] (1)
在等式(1)中，R(θ)是多余的(仅来自溶质)瑞利比(即散射和入射光强度的比率，针对散射体积的大小和与散射体积的距离进行校正)，M是摩尔质量(分子量)，C为分析物浓度，K*为根据等式(2)确定的瑞利比常数，
K＊＝(4π2(no)2/NA(λo)4)(dn/dc) (2)
在等式(2)中，n0是溶剂折射率，NA是阿伏加德罗数，λ0是入射光的真空波长，dn/dc是比折光指数增量，P(θ)是形状因子或散射函数，并且将散射强度的角度变化与颗粒的均方半径(rg)相关联，A2是第二病毒系数，是溶质与溶剂相互作用的量度。
从该分析，可确定数均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)、多分散性(Mw/Mn)和峰分子量(Mp)。
仪器：
SEC/MALS/RI系统由Shimadzu LC 20A系统、Wyatt Optilab rEX RI检测器和Wyatt DAWN HELEOS-II MALS检测器组成。
使用来自Wyatt的Astra(版本：5.3.4.20)软件计算分子量(Mw和Mn)和多分散性(Mw/Mn)。
带有预柱Tosoh TSKgel G6000PWxL(13μm，7.8毫米内径×30厘米)的TosohTSKgel G3000PWxL(7μm，7.8毫米内径×30厘米)被用于聚合物的SEC分析。
分析条件：
流动相：0.45M硝酸钠水溶液+0.5％(v/v)三氟乙酸(TFA)，
流速：0.5mL/min
检测：
MALS中的线性偏振激光波长：658nm
RI
温度：25℃
进样量：50μL
样品稀释：通过1.5mL流动相稀释10mg聚合物(浓度见表2)
运行时间：58分钟
多孔载体：
B1 硅胶Davisil LC 250，40-63μm(由W.R.Grace提供)
B2 硅胶XWP500A，35-75μm(由W.R.Grace提供)
B3 硅胶XWP1000A，35-75μm(由W.R.Grace提供)。
多孔载体B1至B3的性质在下表3中给出。
表3：多孔载体的性质
Figure BDA0002667487070000171
根据DIN 66133，通过压汞法确定多孔载体的孔径。
多孔载体的粒径分布通过马尔文激光衍射法测定。
交联剂：
1，6-己二醇二缩水甘油醚(HDGE；ipox RD18，由Ipox Chemicals提供)
1，4-丁二醇二缩水甘油醚(BDGE；由Sigma-Aldrich提供，ipox RD3由IpoxChemicals提供)
实施例1：
将15ml聚合物A2的水溶液(溶液中11％的聚合物A2)与1,6-己二醇二缩水甘油醚(HDGE)的溶液(704μl)混合以达到7-9％的交联剂。考虑反应基团相对于用于反应的聚合物溶液中存在的乙烯基胺单元的数量而计算交联剂比率。混合后，采用0.5NaOH将pH调节至11。
将10g干燥粉末多孔载体B1沉淀在具有8cm直径的平底不锈钢皿中。采用39.5g的聚合物-交联剂溶液浸渍多孔载体B1，该聚合物-交联剂溶液被逐滴添加并均匀地分布在多孔载体上并使用刮刀混合。将所得的糊状物在600rpm的旋转摇床上摇动1分钟，以获得具有光滑表面的均匀块体。采用不锈钢盖盖好盘后，无需进一步混合或移动在60℃的烤箱中将糊状物加热48小时，得到49.6g湿复合物。
随后在玻璃料上用5次25毫升水洗涤41.3克的该湿复合材料。然后，将复合滤饼悬浮在31.6ml的10％硫酸中，并在摇床浴中于环境温度(23℃)下处理2小时，以便水解未反应的环氧基。最后，在玻璃料上再用5次25毫升水洗涤产物，然后储存在20％乙醇水溶液中。
实施例2至4以及比较例1和2：
除了使用表4中列出的起始材料，以与实施例1相同的方式制备实施例2至4以及比较例1和2。
表4：
聚合物 多孔载体 交联剂比率 交联剂
实施例1 A2 B1 7-9％ HDGE
实施例2 A3 B1 7-9％ HDGE
实施例3 A2 B2 7-9％ BDGE
实施例4 A2 B3 7-9％ BDGE
比较例1 A1 B1 7-9％ HDGE
比较例2 A1 B1 7-9％ BDGE
实施例中复合材料的消耗性能和hlgG回收率的确定
为了测量复合材料的净化能力，确定杂质或不希望的化合物从目标物质中的消耗(分离)程度。为此目的，使用选择性化验确定进料中各成分的浓度。在纯化步骤之后，采用经纯化的馏分重复该浓度测量。因此，可从这些浓度和相关体积计算纯度和回收率。
进料
进料是未经处理和未稀释的细胞培养上清液CHO-K1，掺入2mg/ml的来自人血浆的hlgG(Octagam，10％溶液，Octapharma，维也纳)。
细胞培养上清液(CCS)
CCS1
CHO-K1，体内，柏林
细胞系CHO-K1(2.5×106活细胞/ml)
电导率：15mS/cm
平均宿主细胞蛋白(HCP)浓度：100-150μg/ml
平均DNA浓度：在700-1,000ng/ml之间
CCS2
CHO-K1，体内，柏林
细胞系CHO-K1
电导率：13mS/cm
平均宿主细胞蛋白(HCP)浓度：65-82μg/ml
平均DNA浓度：250-500ng/ml之间
在与进料接触之前，所有吸附剂均采用pH 6.5的50mM乙酸铵平衡。
使用Eppendorf离心机或离心管将200mg吸附剂与1ml进料一起培养。进料体积与吸附剂重量的比例为5：1(1ml进料：0.2g吸附剂)。轻轻摇动5分钟后，通过离心分离上清液以进行后续分析。还测试了进料体积与吸附剂重量的更高比率50：1(1ml进料：0.02g吸附剂)。除非另有说明，否则接触时间为5分钟。
为了确定宿主细胞蛋白质(HCP)和DNA的消耗效率以及hlgG回收率，在与复合材料进行指定的接触时间后，在原料进料和消耗的进料中对上述三种物质进行量化。随后将两个值进行比较。
宿主细胞蛋白(HCP)确定
根据制造商的说明(手册“800-F550，修订版3，2015年7月21日”)，通过VictorX分光光度计及用于读取和数据评估的PerkinElmer(Courtaboeuf，法国)的相应软件，使用了Cygnus CHO HCP Elisa试剂盒3G来确定来自Southport(USA)Cygnus Technologies的宿主细胞蛋白(HCP)，CHO宿主细胞蛋白第三代(#F550)的消耗效率。将样品在样品稀释液中稀释(产品目录号#I028，购自Cygnus Technologies)。
HCP消耗表示为：
HCP消耗(％)＝100×(上清液中的HCP浓度)/(初始掺杂CCS中的HCP浓度)
在上式中，“上清液”是指经纯化的CCS。
DNA测定
待分析的样品是起始CCS(掺入或没有掺入hlgG)和消耗的样品。
根据制造商的说明，在用于进行读取和数据评估的VictorX分光光度计和PerkinElmer(Courtaboeuf，法国)的相应软件上，使用Cygnus Technologies，Southport(美国)的DNA提取试剂盒(#D100T)提取DNA后，使用Invitrogen(德国)的Quant-iTTM
Figure BDA0002667487070000201
dsDNA试剂盒(#P7589)，通过DNA特异性荧光化验法完成DNA量化。
DNA消耗表示为：
DNA消耗(％)＝100×(上清液中的DNA浓度)/(初始掺杂CCS中的DNA浓度)
在上式中，“上清液”意指经纯化的CCS。
通过体积排阻色谱法(SEC)进行的hlgG回收率确定
通过定量SEC如下确定hlgG的回收率。
进料中hlgG的浓度和经纯化的溶液中hlgG的回收率采用SEC在以下条件下确定。
柱：来自Tosoh Bioscience公司的TSKgel UP-SW3000 4.6x 300mm(粒径2μm)。
流动相：100mM磷酸钠pH 6.7缓冲液+100mM Na2SO4+0.05％NaN3
进样量：10μL-采用流动相稀释的样品。
流速：0.35ml/min。
检测器：DAD 280nm。
温度：25℃
该柱具有高效率和相关的分析条件，允许对单体和二聚体峰进行适当的量化。
hlgG回收率表示为：
回收率(％)＝100×(上清液中的hlgG浓度)/(初始掺杂CCS中的hlgG浓度)
在上式中，“上清液”意指经纯化的CCS。
结果示于表5中。
表5：在50∶1的进料：复合物比率下，实施例中复合物的消耗性能和hlgG回收率
HCP消耗(％) DNA消耗(％) hlgG回收率(％)
实施例1 63 89 96
比较例1 58 83 96
如表5所示，进料：复合物比率为50：1时hlgG的回收率几乎是定量的(≥96％)，
以5：1的进料：复合物比率，实施例1至4的复合物以大于95％的比率消耗了来自原料的DNA和HCP。
从表5中可以看出，使用聚合物A1(水解度为65％)获得的比较例1具有不及实施例1的HCP和DNA消耗能力。
因此，本发明的复合材料在高的进料与复合物比率下实现了优异的DNA和HCP消耗以及hlgG回收率，并且因此适用于目标蛋白的高效和成本有效的纯化。

Claims (28)

1.一种复合材料，其包含：
具有5至500nm的平均孔径的多孔载体，所述多孔载体填充有交联的聚合物，
其中所述聚合物选自具有15,000至80,000 Da的重均分子量（Mw）和67%至99%的甲酰胺基团水解度的聚乙烯胺或聚烯丙胺，
条件是不包括具有27,200 Da的重均分子量（Mw）和70%的甲酰胺基团水解度的聚乙烯胺以及具有50,000Da的重均分子量（Mw）和95％的甲酰胺基团水解度的聚乙烯胺。
2.根据权利要求1所述的复合材料，其中所述多孔载体是具有1μm和500μm平均粒径的颗粒材料。
3.根据权利要求1或2所述的复合材料，其中所述多孔载体材料是多孔硅胶。
4.根据权利要求1或2所述的复合材料，其中所述聚乙烯胺是乙烯基胺的线型或支化均聚物或乙烯基胺与乙烯基甲酰胺的共聚物。
5.根据权利要求1或2所述的复合材料，其中基于干燥复合材料的总重量计，所述交联聚合物的浓度为至少3％w / w。
6.根据权利要求1或2所述的复合材料，其中，所述聚乙烯胺或聚烯丙胺的甲酰胺基团水解度为68％至99％。
7.根据权利要求1或2所述的复合材料，其中，所述聚乙烯胺或聚烯丙胺的甲酰胺基团水解度为68％至94％。
8.根据权利要求1或2所述的复合材料，其中，所述聚乙烯胺或聚烯丙胺的甲酰胺基团水解度为68％至90％。
9.根据权利要求1或2所述的复合材料，其中，所述聚乙烯胺或聚烯丙胺的甲酰胺基团水解度为68％至86％。
10.根据权利要求1或2所述的复合材料，其中，所述聚乙烯胺或聚烯丙胺的重均分子量（Mw）为20,000至70,000 Da。
11.根据权利要求1或2所述的复合材料，其中，所述聚乙烯胺或聚烯丙胺的重均分子量（Mw）为25,000至50,000 Da。
12.一种用于生产根据权利要求1-11中任一项所述的复合材料的方法，包括以下步骤：
a）将具有5-500nm平均孔径的多孔载体浸入含有聚合物、交联剂和溶剂的溶液或分散液中；以及
b）在低于250℃的温度下使聚合物与交联剂交联，
其中，所述聚合物选自具有15,000至80,000Da的重均分子量（Mw）和67%至99%的甲酰胺基团水解度的聚乙烯胺或聚烯丙胺，条件是不包括具有27,200 Da的重均分子量（Mw）和70％甲酰胺基团水解度的聚乙烯胺以及具有50,000Da的重均分子量（Mw）和95％甲酰胺基团水解度的聚乙烯胺。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述溶剂选自水、醇、醚和酮、或其混合物。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中，所述交联剂选自丙二醇二缩水甘油醚、丁二醇二缩水甘油醚、己二醇二缩水甘油醚、戊二醛和丁二醛。
15.根据权利要求12或13所述的方法，其中，所述聚乙烯胺或聚烯丙胺的甲酰胺基团水解度为68％至99％。
16.根据权利要求12或13所述的方法，其中，所述聚乙烯胺或聚烯丙胺的甲酰胺基团水解度为68％至94％。
17.根据权利要求12或13所述的方法，其中，所述聚乙烯胺或聚烯丙胺的甲酰胺基团水解度为68％至90％。
18.根据权利要求12或13所述的方法，其中，所述聚乙烯胺或聚烯丙胺的甲酰胺基团水解度为68％至86％。
19.根据权利要求12或13所述的方法，其中，所述聚乙烯胺或聚烯丙胺的重均分子量（Mw）为20,000至70,000 Da。
20.根据权利要求12或13所述的方法，其中，所述聚乙烯胺或聚烯丙胺的重均分子量（Mw）为25,000至50,000 Da。
21.权利要求1-11中任一项所述的复合材料用于纯化原料中的目标蛋白的用途。
22.根据权利要求21所述的用途，其中，所述目标蛋白是单克隆抗体。
23.一种用于纯化原料中的目标蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
i）使所述原料与根据权利要求1至11中任一项所述的复合材料接触至少1分钟；
ii）将所述复合材料与经纯化的原料分离。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述目标蛋白是单克隆抗体。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中接触时间为1分钟至10小时。
26.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述原料包括宿主细胞蛋白（HCP）和DNA。
27.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述方法还包括从所述原料分离所述目标蛋白的步骤。
28.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述方法还包括采用溶剂洗涤所述复合材料并收集所得溶液以进行进一步处理的步骤。
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