JP2014019694A

JP2014019694A - 抗体単量体の分離用分離剤及び分離方法

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Publication number: JP2014019694A
Application number: JP2012163399A
Authority: JP
Inventors: Kosuke Araki; 康祐荒木
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2012-07-24
Filing date: 2012-07-24
Publication date: 2014-02-03
Anticipated expiration: 2032-07-24
Also published as: JP6064402B2

Abstract

【課題】抗体単量体の精製方法、特に抗体水溶液中に溶解している抗体重合体の除去方法を提供することにある。
【解決手段】硫酸基が担体に固定化されている分離剤を使用することを特徴とする、抗体の単量体の分離・精製方法、及び、担体が無機材料、多糖類、及び合成高分子からなる群より選ばれることを特徴とする、抗体の単量体の分離・精製方法。
【選択図】図２

Description

本発明は、硫酸基を有する、抗体単量体と抗体重合体との分離用分離剤に関するものである。また本発明は、抗体単量体と抗体重合体を含む溶液を硫酸基を有する分離用分離剤と接触させる工程と、抗体単量体を抗体重合体と分離した状態で回収する工程とからなる、抗体単量体の分離方法に関するものである。

抗体（免疫グロブリン）、中でも免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、医薬品や体外診断薬として有用である。医薬品として用いられる抗体の多くは、遺伝子組み換え動物細胞を培養して生産されるが、培養液には、宿主となった動物細胞由来のタンパク質、ＤＮＡ、ウイルス、エンドトキシン、そして目的とする抗体の重合体や目的とする抗体以外の抗体の重合体等、医薬品や対外診断薬に混入すると効能の低下や副作用の発生を引き起こしかねない「夾雑物」が含まれる。そこで、液体クロマトグラフィー等を利用して、培養液から目的とする抗体の単量体のみを分離する（精製する）ことが重要である。なお抗体の重合体とは、複数の抗体分子が会合・結合することより形成される、二量体以上の多量体である。

抗体の分離については、抗体に強い親和性を示すプロテインＡを有する分離剤を用いる液体クロマトグラフィー（以下、プロテインＡ法等と記載することがある）が知られている。しかし、プロテインＡ法では、抗体の単量体と重合体とを十分に分離することができないという課題がある。また非特許文献１によれば、プロテインＡを有する分離剤を用いた液体クロマトグラフィーの工程で、抗体分子の会合・結合よる重合体の形成が起こり得ることも指摘されており、プロテインＡ法の実施後、付加的に実施することで抗体単量体を抗体重合体から分離する分離方法、又は、プロテインＡ法を実施することなく、前記培養液等を直接処理することで、抗体単量体を夾雑物、特に抗体重合体から分離する分離方法が必要である。

抗体単量体を抗体重合体から分離する液体クロマトグラフィー法として、アパタイトを分離剤として用いる方法（特許文献１）、陽イオン交換基を有する分離剤を用いる方法（特許文献２から４）、陰イオン交換基を有する分離剤を用いる方法（特許文献４又は５）、疎水性基を有する分離剤を用いる方法（特許文献６）等が知られている。しかしこれらの方法では、抗体単量体と抗体重合体との分離が十分ではなく、高純度の抗体単量体を得ようとすればその回収率の低下を容認せざるを得ず、コスト高になるという課題がある。また硫酸基を有する分離剤については、抗体に対して親和性を有することが知られている（特許文献１０）が、これが抗体の単量体を分離するために使用し得るか否かについては従来知られていない。

国際公開２００９／０９２０１４号特表２０１０−５２８０７６号国際公開２００７／１２３２４２号欧州特許１０８４１３６号米国特許６１７７５４８号米国公開５４２９７４６号特開２０１０−４７５２６号特開２０１１−８９０５８号特開２００５−１４５８５２号特許第３０８４４３６号

：バイオテクノロジーアンドバイオエンジニアリング（ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、ワイリー（Ｗｉｌｅｙ）、２０１１年７月、第１０８巻、第７号、ｐ．１４９４〜１５０８

医薬品や対外診断薬分野で抗体を利用するためには、高純度の抗体単量体を大量に生産することが必要である。そこで本願発明の目的は、抗体単量体と抗体重合体を十分に分離し得る抗体単量体の分離用分離剤及び分離方法を提供することにある。

前記目的を達成すべくなされた本願発明は、硫酸基を有する、抗体単量体と抗体重合体との分離用分離剤、及び、抗体単量体と抗体重合体を含む溶液を硫酸基を有する分離用分離剤と接触させる工程と、抗体単量体を抗体重合体と分離した状態で回収する工程とからなる、抗体単量体の分離方法である。

本願発明の分離剤は、硫酸基を有する、抗体単量体と抗体重合体との分離用分離剤である。このような分離剤を使用することにより、抗体単量体を抗体重合体から分離して回収し得ることについては従来知られていない。また本願発明の分離剤は、好ましく表面積の大きな担体、更に好ましく水溶性高分子がグラフト鎖として結合した担体を用い、硫酸基の担体への導入量を調整することにより、抗体単量体の吸着容量を自由にデザインすることが可能である。このため、例えば品質管理等の分析目的で使用するための分離剤や抗体単量体を大量に製造するための分離剤等を自由に設計し、使用することが可能となる。

本願発明の分離方法は、抗体単量体と抗体重合体を含む溶液を硫酸基を有する分離用分離剤と接触させる工程、及び、抗体単量体を抗体重合体と分離した状態で回収する工程との二つの工程のみからなる、極めてシンプルな抗体単量体の分離方法である。特に本願発明の分離剤を液体クロマトグラフィー用の充填剤に求められる寸法・形状等としてカラムに充填して使用することにより、抗体単量体と抗体重合体を含む溶液と、塩を溶解した溶液を使用するだけで、操作性が良好で、操作に長時間を要しない抗体単量体の分離が可能となる。

ゲル濾過クロマトグラフィーによる、クロマトグラフィー評価用のＩｇＧ単量体／重合体混合サンプルの分析結果である。実施例１に記載の、マウスモノクローナルＩｇＧの単量体と重合体の分離結果を示すクロマトグラムである。実施例２に記載の、マウスモノクローナルＩｇＧの単量体と重合体の分離結果を示すクロマトグラムである。実施例３に記載の、マウスモノクローナルＩｇＧの単量体と重合体の分離結果を示すクロマトグラムである。実施例４に記載の、マウスモノクローナルＩｇＧの単量体と重合体の分離結果を示すクロマトグラムである。実施例５に記載の、マウスモノクローナルＩｇＧの単量体と重合体の分離結果を示すクロマトグラムである。実施例６に記載の、マウスモノクローナルＩｇＧの単量体と重合体の分離結果を示すクロマトグラムである。実施例７に記載の、マウスモノクローナルＩｇＧの単量体と重合体の分離結果を示すクロマトグラムである。実施例８に記載の、マウスモノクローナルＩｇＧの単量体と重合体の分離結果を示すクロマトグラムである。比較例１に記載の、マウスモノクローナルＩｇＧの単量体と重合体の分離結果を示すクロマトグラムである。比較例２に記載の、マウスモノクローナルＩｇＧの単量体と重合体の分離結果を示すクロマトグラムである。比較例３に記載の、マウスモノクローナルＩｇＧの単量体と重合体の分離結果を示すクロマトグラムである。

本願発明によれば、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の区別なく、抗体の単量体を、一種又は二種以上の抗体が重合した抗体重合体（かかる重合体には、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の重合体、同種又は異種の、二分子以上のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の重合体、クラス又はサブクラスの異なる抗体の重合体等、種々の重合体が含まれる）から分離することが可能であり、特に抗体としての構造が最もシンプルなヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）単量体を、十分に、ＩｇＧ重合体から分離することが可能である。本願発明は、抗体重合体以外に種々の夾雑物を含む溶液から抗体単量体を分離する上でも効果的であるが、例えばプロテインＡを有する分離剤によって事前に抗体単量体と抗体重合体以外の夾雑物を分離・除去した溶液等から抗体単量体を分離する上で、特に効果的である。

本願発明の分離剤は、硫酸基を有するものであり、より具体的には、分離剤の形状、寸法及び強度（耐圧等）を決定する部分（以下担体という）に硫酸エステル塩構造（Ｒ―ＯＳＯ_３ ^―；Ｒは担体を表す）を導入したもの（担体を硫酸エステル化したもの）である。なお、担体に硫酸基を導入する方法は後述する方法等に制限されるものではなく、また硫酸基の導入量にも何ら制限はないが、導入量が増すにつれて抗体の吸着容量も増加する傾向にあることから、１０〜８００μｅｑ／ｍＬの範囲とすることが好ましい。

担体には、多孔質ガラス又は多孔質シリカゲル等の無機材料、アガロース、デキストラン又はセルロース等の多糖類、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリビニルアルコール又はスチレン−ジビニルベンゼン共重合体等の合成高分子等といった材料を使用することができるが、アルカリに対して耐性のある多糖類又は合成高分子等を使用したり、表面を多糖類や合成高分子で被覆した担体を使用することが好ましい。これらの材料はアルカリ耐性に優れており、分離操作毎に分離剤をアルカリ溶液で洗浄した場合に、分離能の低下を招き難いからである。

担体の形状や寸法は、そのまま本願発明の分離剤の形状や寸法となる。そのため担体の形状及び寸法は、分離剤を使用する状況等を考慮して決定することが好ましい。形状ついては、培養液等の抗体単量体を含む溶液と分離剤との十分な接触を確保できれば、例えば球状（粒子状）、多面体状、筒状、膜状、網状、柱状、板状、カップ状等、いかなる形状でも良いが、本願発明の分離剤を液体クロマトグラフィー用の充填剤として使用する場合には、球状（粒子状）、円筒状又は円柱状とすることができる。特に平均粒子径２〜３００μｍ程度の球状が好ましく、少量の分取を目的とする場合には１５〜５０μｍ、大量の培養液等を処理する場合には５０〜３００μｍ程度とすることが特に好ましい。

一度の操作で分離し得る抗体単量体の量を増加させて操作に要する時間を短縮し、結果的に高純度の抗体単量体を提供するのに要するコストを低減するために、抗体吸着容量を大きくする（硫酸基の導入量を大きくする）ことが好ましい。このためには、表面積が１ｍ^２／ｇ以上の担体を使用し、大量の硫酸基を導入することが好ましい。

液体クロマトグラフィー用の充填剤として本願発明の分離剤を使用する場合、上記した理由から表面積が１ｍ^２／ｇ以上の多孔性担体を用いることが好ましい。この場合、当該多孔性担体の排除限界分子量は、移動相として純水を使用し、標準ポリエチレンオキシド（例えば、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）標準ポリエチレンオキシドＳＥ−キット、東ソー株式会社製）を用いて測定した場合に、１０００〜５００万の範囲であることが好ましく、より好ましくは３０００〜２００万の範囲である。なお、排除限界分子量は多孔性担体の細孔径の指標であり、排除限界分子量が大きいほど、細孔径が大きいことを意味する。排除限界分子量は、より詳細には、ゲル浸透クロマトグラフィーにおいて細孔内に侵入できない分子の分子量のうち、最も小さい分子量のことを言い、種々の分子量の化合物を用いて溶出体積との関係を調べることにより測定できる。排除限界分子量の測定方法として、具体的には、Ｌ．Ｒ．Ｓｎｙｄｅｒ、Ｊ．Ｊ．Ｋｉｒｋｌａｎｄ著、小島次雄、春木達郎訳、”「高速液体クロマトグラフィー」第１版”、１９７６年１１月、東京化学同人、ｐ．２２８−２５９などに記載されている方法が例示される。

担体に硫酸基を導入する方法としては、例えば特開平７−１９６７０２号や特開２００１−９７９９７号に開示された、担体を硫酸化剤で処理して硫酸基を直接導入する（担体を硫酸エステル化する）方法を使用することができる。これらの方法によって本願発明の分離剤を得る場合、硫酸化剤の仕込み量と反応時間により担体への硫酸基導入量を調整することができる。硫酸化剤の仕込み量は、目的とする分離剤の硫酸基量（目的とする分離剤の抗体吸着容量）や反応条件に従って異なるが、担体の乾燥重量を１とした場合は１〜５の範囲とし、４０〜７０℃にて、１２〜２４時間反応させることが例示できる。

担体への硫酸基の導入には、担体に硫酸基を有する化合物を結合する方法を使用することもできる。具体的には、担体にエポキシ基などの反応性官能基を導入した後、該反応性官能基と反応しうる官能基及び硫酸基の両方を有する化合物（硫酸基含有化合物）を反応させる方法を例示できる。担体に導入する反応性官能基としては、エポキシ基、ハロゲン基、イソシアネート基、カルボジイミド基が例示できるが、これらに限定されるものではない。また、このような反応性官能基をわざわざ導入しなくとも、担体自体が反応性官能基を有する場合には、それを利用することもできる。硫酸基含有化合物としては、デキストラン硫酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸などの硫酸化多糖類、硫酸化ポリビニルアルコール、Ｏ−硫酸セロトニン、Ｏ−硫酸化チロシン、シニグリン、フェネチルグルコシノレート、レマゾールブリリアントブルー、ｐ−アミノフェノール硫酸塩、硫酸水素２−アミノエチル、アスコルビン酸硫酸エステル、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル硫酸カリウムが例示できるが、これらに限定されるものではない。

担体への硫酸基の導入には、例えば特許公開２００８−２３２７６４号や特許公開２０１１−２２０９９２号に開示された、担体にヒドロキシ基などを有する化合物を導入した後、硫酸化剤を用いて硫酸化する方法を使用することもできる。より具体的には、エピクロロヒドリンや多官能性エポキシ化合物等を用いて担体表面にエポキシ基を導入した後、デキストランやプルランなどのヒドロキシ基をもつ親水性高分子を反応後、親水性高分子中のヒドロキシ基を三酸化硫黄ピリジン錯体で硫酸化するものである。この方法は、親水性高分子を利用することにより、硫酸基の導入量（抗体の吸着容量）を向上でき、特に好ましい。

前述した通り、一度の操作で分離し得る抗体単量体の量を増加させて操作に要する時間を短縮し、結果的に高純度の抗体単量体を提供するのに要するコストを低減するために、抗体吸着容量を大きくする（硫酸基の導入量を大きくする）ことが好ましい。このためには、前述したような表面積が大きな担体を使用する以外にも、例えば米国特許６４２８７０７号又は特開２００８―２３２７６４号に開示されたような、水溶性高分子、特に好ましくはヒドロキシ基を有する水溶性高分子がグラフト鎖として結合した担体を用い、該ヒドロキシ基の一部又は全部に前述した方法で硫酸基を導入することが例示できる。ヒドロキシ基は担体に親水性を付与するため、本願発明の分離剤に対する非特異的な抗体の吸着、特に疎水性相互作用による抗体の吸着を抑制し、より抗体単量体と抗体重合体の分離を良好にできるからである。ヒドロキシ基を有する水溶性高分子としては、特に制限はないが、分子量が５０００〜１００万程度の、一種又は二種以上の多糖類を例示することができ、当該多糖類としてはデキストラン、プルラン、セルロース又はこれらの誘導体を例示できる。
本願発明の分離方法は、抗体単量体と抗体重合体を含む溶液を上述した分離剤と接触させる工程（以下第１工程と記載することがある）と、抗体単量体を抗体重合体と分離した状態で回収する工程（以下第２工程と記載することがある）とからなる。
第１工程は、分離剤の寸法や形状に応じて種々の形で実施することができるが、例えば容器状の分離剤を用いる場合には当該容器に抗体単量体を含む溶液を投入すれば良い。中でも本願発明の分離剤を液体クロマトグラフィー用充填剤として使用し、これを充填したカラムに抗体単量体を含む溶液を供することによって実施することが、操作性の向上、高純度の抗体単量体の回収等という観点から好ましい。
第１工程において、分離剤が有する硫酸基と抗体とのアフィニティー（親和結合力）は、抗体単量体の結合力と比較して抗体重合体の結合力が高い。このため、抗体と分離剤との結合力に影響を与える塩濃度等を調節した溶液を抗体単量体含有溶液と混合して第１工程を実施することにより、（１）抗体単量体と抗体重合体の両者が分離剤と結合する、又は、（２）抗体単量体は分離剤と結合せず、抗体重合体のみが分離剤と結合する、のいずれかを生じさせることができる。なかでも、塩濃度等の設定が容易であり、抗体単量体の回収量の低下を招くおそれが少ない（１）が好ましい。また（１）であれば、抗体単量体を分離剤から遊離させない溶液で洗浄することにより、分離剤に結合しないか、結合しても抗体単量体と比較して弱くしか結合しない抗体重合体以外の夾雑物を除去することもできる。

第２工程では、抗体単量体を抗体重合体と分離した状態で回収する。第１工程で（２）のように抗体単量体は分離剤と結合せず、抗体重合体のみが分離剤と結合する塩濃度等を選択した場合には、分離剤を当該溶液と分離するのみで抗体単量体を抗体重合体から分離した状態で回収することができる。また液体クロマトグラフィーの手法を使用する場合には、塩濃度等を調節した溶液をカラムに供し続けることにより、抗体単量体を抗体重合体から分離した状態で回収することができる。第１工程で（１）のように抗体単量体と抗体重合体の両者が分離剤と結合する塩濃度等を選択した場合には、好ましくは分離剤を洗浄した後、（３）抗体単量体のみが分離剤から遊離するように塩濃度等を調整した溶液を分離剤と接触させる、又は、（４）塩濃度等を連続的又は段階的に増加させる、のいずれかにより、抗体単量体を抗体重合体とは異なる塩濃度等で分離剤から遊離させ、抗体単量体を抗体重合体から分離して回収すれば良い。なかでも塩濃度等の設定が容易であり、抗体単量体の回収量の低下を招くおそれが少ない（４）が好ましいが、液体クロマトグラフィーの手法を使用すれば塩濃度等の連続的又は段階的な増加は容易に行い得る。なお、第２工程を（４）のように実施する場合には、例えば２８０ｎｍの吸光度を測定する等して分離剤から遊離する抗体単量体を同定した上で回収することにより、より高純度の抗体単量体を回収することが可能となる。

以下、本願発明をさらに詳細に説明するため実施例を記載するが、これら実施例は本願発明を限定するものではない。実施例において使用したクロマトグラフィー評価用のＩｇＧ単量体／重合体混合溶液（以下サンプルと記載する）は、精製したマウスモノクローナル抗体水溶液（ＩｇＧ濃度２１．３ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ５．５）１００μＬに０．０５ｍｏｌ／Ｌクエン酸水溶液を２５μＬ加え、温度６０℃の恒温槽中に３０分間静置した後、０．０５ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）で４倍希釈することにより調製した。
サンプル中のＩｇＧ単量体と重合体の組成は、ゲル濾過クロマトグラフィーの手法により確認した。市販のゲル濾過クロマトグラフィー用カラム（ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）Ｇ３０００ＳＷ_ＸＬ、東ソー株式会社製）を室温（約２３℃）条件下におき、溶離液は０．２ｍｏｌ／Ｌアルギニン塩酸塩を含む０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）とし、流速は１ｍＬ／分とした。カラムからの遊離物は２８０ｎｍの吸光度を測定して検出した。
図１は、上記条件にてサンプル中の抗体単量体を分離した結果を示すものである。図１において、ＩｇＧ単量体とＩｇＧ重合体のピークはそれぞれ８分、６〜７分付近に現れている。

実施例１
親水性ビニル系ポリマーを基材とした市販のゲル濾過クロマトグラフィー用充填剤（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＨＷ−６５Ｃ、東ソー株式会社製、ポリエチレンオキシド換算の排除限界分子量６０万、粒子径５０〜１００μｍ）をガラスフィルターにとり、水で洗浄・吸引濾過を繰り返して、水湿潤ゲルとした。該ゲルの含水率は、加熱式水分量計（株式会社エー・アンド・デイ製、ＭＸ−５０）で測定した結果、７５重量％であった。

上記の水湿潤ゲル１００ｇ、水１８０ｇ、エピクロロヒドリン１２０ｇを攪拌機付き反応器に仕込み、４８重量％ＮａＯＨ水溶液１００ｇを２時間をかけて滴下投入した後、４５℃で２時間反応を実施した。反応終了後、ゲルをガラスフィルターを用いて濾過し、水で洗浄し、エポキシ化水湿潤ゲル（含水率７７重量％）を得た。

次に、デキストラン硫酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社、硫黄含量約１８％、分子量約５０万）３７ｇを水８４．８ｇに溶解し、これに上記のエポキシ化水湿潤ゲル６０ｇを加えた。この溶液に４８重量％ＮａＯＨ水溶液を５．３ｇ投入し、４０℃で１７時間撹拌することにより反応を行った。反応終了後、ゲルをガラスフィルターで濾過し、水で洗浄して、デキストラン硫酸固定化ゲル（分離剤１）を得た。
イオン交換容量の評価は、次のように実施した。１０ｇの分離剤１をガラスフィルターに移し、０．１ｍｏｌ／L水酸化ナトリウム水溶液３０ｍＬで３回洗浄した後、ろ液のｐＨが８以下になるまで水でゲルを洗浄した。次に、０．５ｍｏｌ／L塩酸３０ｍＬでゲルを３回洗浄した後、ろ液のｐＨが５以上になるまで水で洗浄した。以上の処理を行ったゲルを２０ｍＬの水に懸濁して、リザーバーを装着したガラスフィルター付きガラス管（容積３ｍＬ）に注ぎ、吸引ろ過によって溶媒を除去した。ガラス管からリザーバーを外し、ガラス管内に堆積した水湿潤ゲル（３ｍＬ）を回収して、１００ｍＬの０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液に懸濁した。これを、酸塩基自動滴定装置（ＡＴ−５００Ｎ、京都電子工業株式会社）を用いて、０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液で滴定した。滴定終点はｐＨ７．０とし、終点までの滴定液量からイオン交換容量を算出した結果、１１μｅｑ／ｍＬであった。
ＩｇＧ吸着容量の評価は次のように実施した。３００ｍＬの三角フラスコに、５２ｍＬの吸着用緩衝液（０．０５４ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液、ｐＨ４．７）と、１．０ｍＬの分離剤１を投入した。これに、ヒト血清γ−グロブリン（ＩｇＧ濃度約１５０ｍｇ／ｍＬ、一般財団法人化学及血清療法研究所）１．７ｍＬを加え、温度２５℃で３時間振盪し、ＩｇＧ吸着処理を行った。その上清を吸着用緩衝液で１０倍に希釈して、２８０ｎｍの吸光度を紫外可視分光光度計（ＵＶ−１８００、株式会社島津製作所）で測定するとＩ_ｓ＝０．６１７６であった。ＩｇＧ１．０ｍｇ／ｍＬ当たりの吸光度を１．４とみなすと、下記の式から上清中のＩｇＧ濃度（Ｃ_ｓ）は４．４１１ｍｇ／ｍＬとなる。なおＩ_ｓは、１０倍希釈上清の吸光度である。

上清中のＩｇＧ濃度［ｍｇ／ｍＬ］：Ｃ_ｓ＝（Ｉ_ｓ／１．４）×１０
また、ヒト血清γ−グロブリンを吸着用緩衝液で２００倍に希釈して同様に吸光度を測定するとＩ_ｆ＝１．１０３であった。ＩｇＧ１．０ｍｇ／ｍＬ当たりの吸光度を１．４とみなすと、下記の式からヒト血清γ−グロブリン中のＩｇＧ濃度（Ｃ_ｆ）は１５７．６ｍｇ／ｍＬとなる。なおＩ_ｆは、２００倍希釈ヒト血清γ−グロブリンの吸光度である。
ヒト血清γ−グロブリン中のＩｇＧ濃度［ｍｇ／ｍＬ］：Ｃ_ｆ＝（Ｉ_ｆ／１．４）×２００
上記のようにして求めたＣ_ｓ及びＣ_ｆの値を使用し、次の式から分離剤１のＩｇＧ吸着容量を求めると２８ｍｇ／ｍＬであった。なお分離剤の含水量は０．７ｍＬとみなした。

ＩｇＧ吸着容量［ｍｇ／ｍＬ分離剤］：ｑ＝Ｃ_ｆ×１．７−Ｃ_ｓ×５４．４
［クロマトグラフィー評価］
試作した分離剤による「ＩｇＧの単量体」と「ＩｇＧの重合体を含む不純物」との混合物のクロマトグラフィー分離を、以下の方法で検討した。
ステンレス製カラム（内径７．５ｍｍ、長さ７．５ｃｍ）に分離剤１を充填した後、ＨＰＬＣ装置（東ソー株式会社）に接続した。流速１．０ｍｌ／分にて、カラム容量の約１０倍量の０．０５ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）で平衡化した後、前述のクロマトグラフィー評価用サンプル（１００μＬ）を該カラムへ注入した。溶出は、１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む０．０５ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を使用して、６０分の直線塩濃度勾配溶出法（リニアグラジエント）で実施した。なお、流速は１．０ｍｌ／分、検出は２８０ｎｍの吸光度、カラム温度は室温（約２３℃）として評価を実施した。

分離剤１において得られたクロマトグラムを図２に示す。図２において横軸は保持時間（分）を示し、１８分付近に溶出しているピークがＩｇＧの単量体で、３５分付近に溶出しているピークがＩｇＧの重合体であり、ピークの分離度Ｒｓは１．８であった。

実施例２
分離剤として、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ−６５Ｃにデキストラン硫酸ナトリウム（名糖産業株式会社、硫黄含量約５％、分子量；約１，６００）を固定化したゲルを使用する以外は、実施例１と同様の反応と評価を実施した。この場合のイオン交換容量は３μｅｑ／ｍＬ、ＩｇＧ吸着容量は１７ｍｇ／ｍＬであった。クロマトグラフィー評価の結果を図３に示した。ＩｇＧの単量体と重合体の溶出時間はそれぞれ約９分と約２０分、ピーク分離度Ｒｓは１．１であった。実施例２では、ＩｇＧ吸着容量及びＲｓが実施例１より低かったが、この理由としては、イオン交換容量（言い換えると、硫酸基の固定化量）が低い点が考えられる。

実施例３
分離剤として、多糖類の一種であるアガロースから成るゲル濾過クロマトグラフィー用充填剤Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社、ポリエチレンオキシド換算の排除限界分子量３０万、粒子径４５〜１６５μｍ）にデキストラン硫酸（分子量約５０万）を固定化したゲルを使用する以外は、実施例１と同様の反応と評価を行った。イオン交換容量は３８μｅｑ／ｍＬ、ＩｇＧ吸着容量は４４ｍｇ／ｍＬであった。クロマトグラフィー評価の結果は図４に示したとおりであり、ＩｇＧの単量体と重合体の溶出時間はそれぞれ約１９分と約３５分で、ピーク分離度Ｒｓは１．９であった。

実施例１との比較より、担体を合成高分子から多糖類に変えても、同等の分離性能が得られたことが分かる。

実施例４
分離剤として、ヘパリン（ブタ粘膜由来）を導入したアフィニティークロマトグラフィー用充填剤ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＡＦ−ＨｅｐａｒｉｎＨＣ−６５０Ｍ（東ソー株式会社、粒子径４０〜９０μｍ）を用いた以外は、実施例１と同じ条件でＩｇＧの単量体とＩｇＧの重合体との混合物のクロマトグラフィー分離を検討した。得られたクロマトグラムを図５に示す。ＩｇＧの単量体と重合体の溶出時間はそれぞれ約１６分と約２８分であり、ピーク分離度Ｒｓは１．９であった。

ヘパリンと実施例１で用いたデキストラン硫酸は、両者とも硫酸基を有する多糖類であるが、分子構造が互いに異なる。実施例１と実施例４の比較から、担体に導入する”硫酸基を有する化合物”の構造が変化しても、同等の分離性能が得られることが確認された。

実施例５
実施例１と同様の反応でＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ−６５Ｃから得たエポキシ化水湿潤ゲル（含水率７７重量％）１００ｇを、デキストラン（名糖産業株式会社、分子量約７万）３９ｇを１１０ｍｌの水に溶解した水溶液に懸濁し、４８重量％ＮａＯＨ水溶液４．３ｇを加えて、４０℃で１６時間撹拌することにより反応を実施した。反応終了後、ゲルをガラスフィルターで濾過し、水で洗浄した後、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、和光純薬工業株式会社）で洗浄して、デキストラン固定化ゲル（含液率７３重量％）を得た。

上記のデキストラン固定化ゲル８０ｇを攪拌機付き反応器にとり、ＤＭＦを１５４ｇ、三酸化硫黄ピリジン錯体（和光純薬工業株式会社）４４ｇを加え、７０℃で２０時間反応した。反応終了後、ゲルをガラスフィルターで濾過して、０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムで洗浄した後、水で洗浄し、硫酸エステル化により硫酸基を固定化した分離剤を得た。イオン交換容量は６８０μｅｑ／ｍＬ、ＩｇＧ吸着容量は９０ｍｇ／ｍＬであった。図６に、クロマトグラフィー評価の結果を示した。ＩｇＧの単量体と重合体の溶出時間はそれぞれ約２０分と約３５分であり、ピーク分離度Ｒｓは１．５であった。

実施例１との比較から、デキストラン硫酸を担体へ直接固定化する方法（実施例１に記載の手法）より、担体へデキストランを導入した後、この重合体を硫酸化する方法（実施例５に記載の手法）の方が、高いＩｇＧ吸着容量が得られることが分かる。

実施例６
分子量の異なるデキストラン（ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓＩｎｃ．分子量約１７，５００）を用いる以外は、実施例５と同様の反応を行い、硫酸基を含む分離剤を得た。イオン交換容量は６４０μｅｑ／ｍＬ、ＩｇＧ吸着容量は７６ｍｇ／ｍＬであった。クロマトグラフィー評価の結果を図７に示した。ＩｇＧの単量体と重合体の溶出時間はそれぞれ約２０分と約３６分であり、ピーク分離度Ｒｓは１．７であった。

実施例５との比較より、担体に固定化するデキストランの分子量を小さくすると、イオン交換容量（硫酸基の固定化量）が低下し、ＩｇＧ吸着容量も低くなる傾向があると考えられた。

実施例７
デキストランの代わりにプルラン（株式会社林原、分子量約２０万）を用いる以外は、実施例５と同様の反応を行った。ただし、プルランの仕込み量はデキストランの３分の２として、硫酸基を含む分離剤を得た。イオン交換容量は６７０μｅｑ／ｍＬ、ＩｇＧ吸着容量は９１ｍｇ／ｍＬであった。図８に、クロマトグラフィー評価の結果を示した。ＩｇＧの単量体と重合体の溶出時間はそれぞれ約２１分と約３８分であり、ピーク分離度Ｒｓは１．８であった。

実施例５との比較より、担体に含まれるグラフト鎖（水溶性高分子）の分子構造が変化しても、同等の分離性能とＩｇＧ吸着容量が得られると推察された。

実施例８
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ−６５Ｃをガラスフィルターにとり、水で洗浄・吸引濾過を繰り返した後、ＤＭＦで同様に洗浄し、ＤＭＦ湿潤ゲルとした（含液率８３重量％）。

上記のＤＭＦ湿潤ゲル２０ｇを攪拌機付き反応器にとり、ＤＭＦを１７ｇ、三酸化硫黄ピリジン錯体を７ｇを加え、７０℃で２０時間反応した。反応終了後、ゲルをガラスフィルターで濾過して、０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムで洗浄した後、水で洗浄し、硫酸基を含む分離剤を得た。イオン交換容量は５９０μｅｑ／ｍＬ、ＩｇＧ吸着容量は４５ｍｇ／ｍＬであった。図９に、クロマトグラフィー評価の結果を示した。ＩｇＧの単量体と重合体の溶出時間はそれぞれ約１７分と約３５分であり、ピーク分離度Ｒｓは１．３であった。この結果より、担体を直接硫酸化した場合においても、抗体の単量体と重合体に対する分離性能が発現すると考えられた。

比較例１
分離剤として、スルホン酸型の強陽イオン交換体であるＴＯＹＯＰＥＡＲＬＳＰ−６５０Ｍ（東ソー株式会社、粒子径４０〜９０μｍ）を用いた以外は、実施例１と同じ条件でＩｇＧの単量体とＩｇＧの重合体との混合物のクロマトグラフィー分離を検討した。得られたクロマトグラムを図１０に示す。ＩｇＧの単量体と重合体の溶出時間はそれぞれ約１２分と約１７分であり、ピーク分離度Ｒｓは０．６であった。

比較例２
分離剤として、デキストランのグラフト鎖を含む架橋アガロース担体から成る、スルホン酸型充填剤ＳＰＳｅｐｈａｒｏｓｅＸＬ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社、粒子径４５〜１６５μｍ）を用いた以外は、実施例１の記載と同一条件でＩｇＧの単量体とＩｇＧの重合体との混合物の分離を行なった。その結果、図１１に示したとおり、ＩｇＧの単量体とＩｇＧの重合体のピーク分離は見られなかった。

実施例１〜８と比較例１及び２との比較より、担体に固定化されている官能基がスルホン酸基（Ｒ―ＳＯ_３ ^―；Ｒは担体を表す）である場合は、抗体の単量体と抗体の重合体の分離が不十分であり、硫酸基（Ｒ―ＯＳＯ_３ ^―；Ｒは担体を表す）を固定化した場合にのみ高い選択性が得られることが分かる。

比較例３
特許文献（国際公開第２００７／１２３２４２号公報）に従って、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ−６５Ｃにポリアクリル酸（和光純薬工業株式会社、分子量約２５万）を固定化した分離剤を試作して、実施例１の記載と同一条件でＩｇＧの単量体とＩｇＧの重合体との混合物の分離を行なった。図１２に得られたクロマトグラムを示した。ＩｇＧの単量体と重合体の溶出時間はそれぞれ約１８分と約２６分であり、ピーク分離度Ｒｓは１．３であった。また、ＩｇＧ吸着容量は４１ｍｇ／ｍＬであった。

実施例１〜８との比較より、本発明の方法を適用すると、従来の技術を用いた場合と比べて、より大量の抗体の単量体を効率良く分離・精製できることがわかる。

Claims

硫酸基を有する、抗体単量体と抗体重合体との分離用分離剤。
抗体単量体がヒト免疫グロブリンＧ単量体であり、抗体重合体が２分子以上のヒト免疫グロブリンが結合した多量体である、請求項１の分離剤。
抗体単量体と抗体重合体を含む溶液を、硫酸基を有する分離用分離剤と接触させる工程と、抗体単量体を抗体重合体と分離した状態で回収する工程とからなる、抗体単量体の分離方法。
抗体単量体がヒト免疫グロブリンＧ単量体であり、抗体重合体が二分子以上のヒト免疫グロブリンが結合した多量体である、請求項３の分離方法。