JP2021516615A - バイオセパレーションのための複合材料 - Google Patents

Abstract

本発明は、生物学的供給原料から得られるタンパク質の精製に有用な複合材料に関する。本発明の複合材料は、平均孔径が５〜５００ｎｍである多孔性支持体であって、架橋されたポリマーが充填されている多孔性支持体を含み、ポリマーは、重量平均分子量（Ｍｗ）が２，０００〜５００，０００Ｄａであり、ホルムアミド基の加水分解度が少なくとも６６％であるポリビニルアミン又はポリアリルアミンから選択され、但し、重量平均分子量（Ｍｗ）が２７，２００であり、且つ加水分解度が７０％であるポリビニルアミン及び重量平均分子量（Ｍｗ）が５０，０００であり、且つホルムアミド基の加水分解度が９５％であるポリビニルアミンは除く。

Description

本発明は、生物学的供給原料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｅｅｄｓｔｏｃｋ）から得られるタンパク質の精製に有用な複合材料に関する。

多くの治療及び診断用途において、タンパク質をバイオ医薬品として使用することの妥当性は、ここ数十年間で高まる一方である。特に関心が寄せられている分野の一つが組換えモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の使用である。炎症性疾患、糖尿病、各種がん及び血液疾患の治療に承認される治療用ｍＡｂ及びその断片の数は年々増加している。

ｍＡｂの初回の単回投与量は、多くの場合、その薬物動態特性により、患者一人当たり約０．１〜１ｇの範囲とすることが必要であり、その後、同等の用量が毎週又は毎月投与される。そのため、多量の治療用ｍＡｂが必要となる。つまり、治療用ｍＡｂは工業規模で製造しなければならない。ｍＡｂは、発酵ブロス（濾過液）や細胞培養液等の生物学的供給原料で製造されるが、分泌される組換え抗体の発現量及びその不純物含有量は様々である。

医薬品としての適格性が認められるためには、目的タンパク質は、回収後（例えば、細胞培養液中に分泌された目的タンパク質から細胞又は細胞片を回収した後）の細胞培養液上清又は濾液中に必ず含まれている、生成物由来又は製造工程由来不純物を基本的に含んでいてはならない。これらの夾雑物は、遺伝子組替え宿主由来タンパク質及び核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）、例えば、チャイニーズハムスター卵巣宿主由来タンパク質（ＣＨＯ−ＨＣＰ）又はＤＮＡ（ＣＨＯ−ＤＮＡ）のみならず、残存している、栄養素として添加されたタンパク質又は安定剤（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はトランスフェリン）をはじめとした細胞培養液添加物、塩、緩衝剤に加えて、エンドトキシン及び病原菌又はその断片も含んでいる。

目的タンパク質を精製するための公知の方法には、適切な膜濾過工程による（例えば、高強度のイオン交換膜に結合させることによる）、ウィルス、エンドトキシン及びある程度の核酸の除去、並びにダウンストリーム工程（Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）（ＤＳＰ）で行われる後段の単位操作における低分子量水溶性夾雑物の除去が含まれる。しかしながら、広範囲に亘る様々なＨＣＰを完全に除去することは困難な作業であり、これまでは主として、複数の専用の分取クロマトグラフィー工程を適用することによって対応されてきた。

ｍＡｂ及び他の組換えタンパク質製品のＤＳＰにおいて使用されるクロマトグラフィーによる精製方法には、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン及び陰イオン交換、疎水性相互作用並びに金属キレートアフィニティーが含まれる。更に最近になって、様々なマルチモード及び偽アフィニティー（ｐｓｅｕｄｏ−ａｆｆｉｎｉｔｙ）クロマトグラフィー媒体が利用できるようになり、各製造プロセスにおける用途、例えば、イオン交換又はアフィニティークロマトグラフィー工程後の生成物をポリッシングするための用途が見出されている（欧州特許出願公開第１８０７２０５（Ａ）号）。現在適用されているクロマトグラフィー方法には、通常、２種の古典的なクロマトグラフィー方式が用いられている：１つは連続溶出クロマトグラフィープロセスに基づくものであり、もう１つは「結合溶出」概念に基づくものである。

これらのクロマトグラフィー分離方法に共通する原理は、様々なクロマトグラフィー媒
体が、生物学的試料の１種以上の成分に対し選択的吸着能を有していることにある。したがって、結合していない（又は弱く結合する）成分は、（より）強力に結合している成分から分離し、対応するブレークスルー画分に出現する。また、結合している成分を互いに分離できるようにするためには、個々の成分を選択的に脱着させる、体積及び時間に応じて変化する条件が得られるように、イオン強度、ｐＨ又は特定の置換物質（ｄｉｓｐｌａｃｅｒ）の濃度を増加又は減少させて、連続的又は段階的勾配を形成することによって溶出条件を調整することが多い。

利用可能なクロマトグラフィー方法の中でも、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、生産性が低く、分解能が低く、且つ速度が遅いことから、ポリッシング目的を除いて、大規模操作に有用ではないと考えられている。それとは対照的に、工業的なｍＡｂのクロマトグラフィー精製のプラットフォームに最も広く使用されている第１工程の１つが、「捕捉」又は「結合溶出」親和性機構に基づくものである。この種のプロセスは、目的化合物を結合（「捕捉」）させることを含む一方で、望ましくない生成物の大部分を結合しないままであるか、或いは、結合した不純物を目的物質よりも先又は後に遊離させる選択的溶出工程により分離してもよい。この種の結合溶出プロセスの代表例には、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを使用するものが含まれれる。

ｍＡｂのアフィニティー精製においては、目的タンパク質がクロマトグラフィー材料に非常に強固に結合することを容易にする条件下で、免疫グロブリンは、固定化されたＰｒｏｔｅｉｎ Ａに特異的に結合し、一方、ＨＣＰ及び他の不純物の大部分は結合しないままである。したがって、未結合成分を洗い流した後、カラムに適切な酸性緩衝液を流して各カラムのｐＨを中性付近から幾分酸性の条件（例えば、ｐＨ３）に変化させることにより、結合している免疫グロブリンを遊離させることができる。理論上、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａは、別個の遺伝的に保存されている抗体分子の構造モチーフに結合する選択性が極めて高く且つ特異的であることから、この工程の後に回収される免疫グロブリン生成物は完全に純粋となるはずである。しかし、実際に実用されている製造プロセスにおいては、多くの副次的な作用がこの完璧な１段階精製を妨げる。その中でも、残存ＨＣＰが、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａに、クロマトグラフィーマトリクス材料に、又は免疫グロブリンにさえ結合して、同時に溶出することが観測されている。更に、微量のＰｒｏｔｅｉｎ Ａ及びその分解物の漏出も起こり得、特に、抗体の安定化に適したｐＨ範囲に戻すために必要な、急速なｐＨ調整を行った後に、目的タンパク質に再び結合する可能性もある。免疫グロブリンをＰｒｏｔｅｉｎ Ａクロマトグラフィーの特定のプロセス条件に曝すことも、内在タンパク質の不安定性に起因して、例えば、凝集物の形成、タンパク質分解による一部の分解及び他の有害作用により、ある程度の不可逆な生成物の損失を促す可能性がある。

したがって、医薬品用抗体製品に関し規定されている高水準の純度を達成するために、追加の精製工程が必ず必要となる。イオン交換法及び様々なマルチモードクロマトグラフィー法を含むこうした工程を行うことは、ＨＣＰ及び核酸の量を更に低減すると共に、タンパク質凝集物及びより分子量の小さい抗体分解物を除去するために必要である。そのような精製工程は、生成物の収率を更に低下させる原因となり、また、全体の製造プロセスに、費用が嵩む作業及び時間のかかる労力を追加する。したがって、不純物の大部分を１段階の処理で除去することができる技術が求められている。

ｍＡｂ及び他のタンパク質を精製するために複合吸着材を利用する多くの方法が知られている。これらの方法において、複合吸着材は、通常、クロマトグラフィーカラムに充填される。

国際公開第９５／０２５５７４号には、生物学的流体（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄ）から夾雑物を除去するための方法が開示されており、これは、多孔性無機酸化物マ
トリックスを覆っているが、共有結合はしていない、架橋された疎水性高分子の網目（前記疎水性の網目によって、内部の空孔容積が実質的に充填されている）に、前記生物学的流体を接触させることを含み、それによって、平均分子質量が１０，０００Ｄａ未満である疎水性及び両親媒性分子が除去される。

米国特許第６，７８３，９６２（Ｂ１）号は、生体高分子の単離／精製に有用な粒子状材料に関する。この粒子状材料は密度が少なくとも２．５ｇ／ｍＬであり、粒子状材料の粒子は平均径が５〜７５μｍであり、粒子状材料の粒子は基本的に高分子ベースマトリックス及び非多孔性の芯材から構成されており、前記芯材は密度が少なくとも３．０ｇ／ｍＬである。高分子ベースマトリックスは、ｐＨ４．０で正に帯電しているか又は生体分子の親和性リガンドである側基を含む。

国際公開第２００４／０７３８４３号は、複数の孔を有する支持部材及び支持部材の孔に充填されているマクロ孔を有する架橋ゲルを含む複合材料を開示している。生物学的分子又は生物学的イオンを液体から吸着するためのプロセスも開示されており、これは、生物学的分子又は生物学的イオンを含む液体を、マクロ孔ゲル上に生体分子と特異的に相互作用する結合部位を有する複合材料に通過させることを含む。

欧州特許出願公開第２５４５９８９（Ａ）号には、多孔性支持体及び多孔性支持体表面上の架橋されたポリマーを含む、クロマトグラフィー用途のための複合材料が開示されており、多孔性支持体の孔径（ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ）［ｎｍ］及び架橋ポリマーの架橋度［％］の比は０．２５〜２０［ｎｍ／％］であり、架橋ポリマー中の架橋性基の総数を基準とする架橋度は５〜２０％である。

国際公開第２０１８／０５０８４９号には、孔径が２５ｎｍである多孔性シリカゲルと、平均分子量が２７，２００Ｄａであり、加水分解度が７０％（実施例１）である架橋されたポリ（ビニルホルムアミド−ｃｏ−ポリビニルアミン）とを含む複合材料の調製が開示されている。当該文書の概要項には、平均分子量が５０，０００Ｄａであり、９５％まで加水分解されたポリビニルアミンについても述べられている。

米国特許出願公開第２０１７／３０４８０３Ａ号には、ポリビニルアミン等のアミノ基を含むポリマーで被覆された多孔性支持材料を含む収着材が開示されている。しかしながら、この参考文献には、ホルムアミド基の加水分解度が少なくとも６６％であるポリビニルアミンについては述べられていない。

Ｄｒａｇａｎ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１０，ｖｏｌ．３１，ｐｐ．３１７−３２２には、架橋されたポリビニルアミンで被覆された、平均粒子径が１５〜４０μｍであり、最大孔径が４〜６ｎｍの範囲にあるシリカ微粒子を含む複合材料の製造が記載されている。この参考文献には、シリカ内部の孔には高分子鎖が到達できないことが教示されている。

欧州特許出願公開第２０２７９２１（Ａ）号には、第１外面及び第２外面と、それらの間の多孔性厚みとを有し、両面が多孔性である基材を含む、多孔性収着性媒体が記載されており、前記基材は、基材の中実（ｓｏｌｉｄ）マトリックス並びに前記第１及び第２該面を実質的に覆っている収着性材料を有し、前記収着性材料は、１級アミン基が結合している架橋ポリマーを含む。この参考文献においては、粒子状材料の基材については述べられていない。

本発明は、生体分子の精製における既存の技術の限界を克服するべく設計された。

本発明の目的は、ｍＡｂ等のタンパク質を含む生物学的供給原料からの該タンパク質の精製を向上する複合材料を提供することにある。

本発明の目的は、添付の請求項１に記載の複合材料によって達成される。

具体的には、本発明は：
平均孔径が５〜５００ｎｍである多孔性支持体であって、架橋されたポリマーが充填されている、多孔性支持体を含む複合材料であって、
このポリマーは、重量平均分子量（Ｍｗ）が２，０００〜５００，０００Ｄａであり、ホルムアミド基の加水分解度が少なくとも６６％であるポリビニルアミン又はポリアリルアミンから選択され、
但し、重量平均分子量（Ｍｗ）が２７，２００であり、且つ加水分解度が７０％であるポリビニルアミン及び重量平均分子量（Ｍｗ）が５０，０００であり、且つホルムアミド基の加水分解度が９５％であるポリビニルアミンは除く、
複合材料を提供する。

驚くべきことに、ここに特定の多孔性支持体を特定の架橋されたポリマーと組み合わせることにより、精製能力が向上した複合材料が得られることが見出された。

本発明は、溶液又は懸濁液中に含有されている望ましくない化合物から目的タンパク質を精製するための複合材料を提供する。この複合体は、製造されたｍＡｂ等のバイオ医薬品から不純物を効率的に除去するのに特に適しており、清澄化やダウンストリーム精製工程（ＤＳＰ）に容易に統合することができる。

この複合材料は、好ましくは、タンパク質製造時に得られるタンパク質含有溶液からＤＮＡ及びＨＣＰを同時に除去（ｄｅｐｌｅｔｅ）することができると共に、非常に高いタンパク質回収率を達成することもできる。

本発明はまた、
ａ）平均孔径が５〜５００ｎｍである多孔性支持体を、ポリマー、架橋剤及び溶媒を含む溶液又は分散液に浸す工程；及び
ｂ）ポリマーを２５０℃未満の温度で架橋剤により架橋する工程
を含む、複合材料の製造方法であって、
ポリマーは、重量平均分子量（Ｍｗ）が２，０００〜５００，０００Ｄａであり、ホルムアミド基の加水分解度が少なくとも６６％であるポリビニルアミン又はポリアリルアミンから選択され、
但し、重量平均分子量（Ｍｗ）が２７，２００Ｄａであり、且つホルムアミド基の加水分解度が７０％であるポリビニルアミン及び重量平均分子量（Ｍｗ）が５０，０００Ｄａであり、且つホルムアミド基の加水分解度が９５％であるポリビニルアミンは除く、方法にも関する。

更に、供給原料中の目的タンパク質を精製するための本発明の複合材料の使用も提供する。

更に本発明は、供給原料中の目的タンパク質の精製方法であって：
ｉ）供給原料を本発明の複合材料と十分な時間接触させる工程；
ｉｉ）精製された供給原料から複合材料を分離する工程；
ｉｉｉ）任意に、精製された目的タンパク質を供給原料から単離する工程；及び
ｉｖ）任意に、複合材料を溶媒で洗浄し、得られた溶液を更なる処理のために回収する工程
を含む、方法を提供する。

複合材料
本明細書において、「複合体」、「複合材料」及び「吸着材」という語は互換的に使用される。

本明細書において、「孔径」に言及する場合は常に「平均孔径」を意味する。

多孔性支持材料の平均孔径は５ｎｍ〜５００ｎｍである。上述又は後述の任意の実施形態と組み合わせて、平均孔径は、好ましくは１５ｎｍ〜３００ｎｍ、より好ましくは２０ｎｍ〜２００ｎｍ、更に好ましくは２５ｎｍ〜２５０ｎｍ、一層好ましくは３０ｎｍ〜２００ｎｍ、最も好ましくは４０ｎｍ〜１００ｎｍである。本明細書における多孔性支持材料の平均孔径は、ＤＩＮ ６６１３３に準拠する水銀圧入により決定される。

多孔性支持材料は、膜、中空繊維、不織布、モノリシックな材料又は粒子状材料であり得る。粒子状及びモノリシックな多孔性材料が好ましい。上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、多孔性支持材料は、不規則又は球状形状を有する粒子状多孔性支持材料である。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた更なる好ましい実施形態において、多孔性支持材料は、金属酸化物、半金属酸化物、セラミック材料、ゼオライト又は天然若しくは合成のポリマー材料から構成される。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた更なる好ましい実施形態において、多孔性支持材料は、多孔性シリカ、アルミナ又はチタニア粒子である。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた更なる好ましい実施形態において、多孔性支持材料は、多孔性シリカゲルである。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた更なる好ましい実施形態において、多孔性支持材料は、セルロース、キトサン、アガロース等の多孔性多糖類である。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた更なる好ましい実施形態において、多孔性支持材料は、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリエーテルケトン、ポリアルキルエーテル（ｐｏｌｙａｌｋｙｍｅｔｈｅｒ）、ポリアリールエーテル、ポリビニルアルコール若しくはポリスチレン又はこれらの混合物若しくはコポリマー等の多孔性合成ポリマーである。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた更なる好ましい実施形態において、多孔性支持材料は、平均粒子径（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ）（直径）が１μｍ〜５００μｍ、好ましくは２０μｍ〜２００μｍの間、より好ましくは３０〜１５０μｍの間、最も好ましくは３５〜１００μｍの間にある粒子状材料である。

本明細書における多孔性支持体の平均粒子径（直径）及び粒度分布は、Ｍａｌｖｅｒｎ
Ｌａｓｅｒ Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎにより求められる。

本明細書においては、特段の指定がない限り、「ポリマー」という語は架橋前のポリマーを指す。

本明細書における「加水分解度」という語は、ポリマーのホルムアミド基の加水分解度を指す。

本発明の複合材料は、架橋されたポリマーを含む。前記ポリマー（架橋前）は、重量平均分子量（Ｍｗ）が２，０００〜５００，０００Ｄａであり、ホルムアミド基の加水分解度が少なくとも６６％であるポリビニルアミン又はポリアリルアミンから選択される。

本明細書において、ポリビニルアミン及びポリアリルアミンには、ビニルアミン又はアリルアミンの直鎖又は分岐ホモポリマー及びビニルアミン又はアリルアミンとアミノ基又はアミド基とのコポリマーが含まれる。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、ポリビニルアミンは、ビニルアミンの直鎖若しくは分岐ホモポリマー又はビニルアミンとビニルホルムアミドとのコポリマーである。好ましくは、ビニルアミンとビニルホルムアミドとのコポリマーは、ビニルホルムアミド単位を、ポリマーの構造単位の総数を基準として、１％〜７０％、より好ましくは、ビニルホルムアミド単位を２％〜４０％、最も好ましくは、ビニルホルムアミド単位を５％〜２５％含む。上述又は後述の実施形態と組み合わせた更なる好ましい実施形態において、ポリアリルアミン（ｐｏｌｙａｌｌｙａｍｉｎｅ）は、アリルアミンの直鎖若しくは分岐ホモポリマー又はアリルアミンとアリルホルムアミドとのコポリマーである。好ましくは、アリルアミンとアリルホルムアミドとのコポリマーは、ポリマーの構造単位の総数を基準として、アリルホルムアミド単位を１％〜７０％、より好ましくは、アリルホルムアミド単位を２％〜４０％、最も好ましくは、アリルホルムアミド単位を５％〜２５％を含む。

上述又は後述の実施形態と組み合わせた好ましい実施形態において、ポリビニルアミンまたはポリアリルアミンの重量平均分子量（Ｍｗ）は２，０００〜５００，０００Ｄａ、好ましくは１５，０００〜４００，０００Ｄａ、より好ましくは２０，０００〜３００，０００Ｄａ、最も好ましくは２５，０００〜２５０，０００Ｄａである。

本明細書において、ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）は、多角度光散乱及び示差屈折率検出器を連結したサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ−ＲＩ）により決定される。

上述又は後述の実施形態と組み合わせた好ましい実施形態において、ポリビニルアミン又はポリアリルアミンのホルムアミド基の加水分解度は、６７％〜９９％、より好ましくは６８％〜９４％、一層好ましくは７２％〜９０％、最も好ましくは７５％〜８６％である。

本明細書におけるポリマーのホルムアミド基の加水分解度は、次に示す方法に従い^１Ｈ−ＮＭＲにより求められる：
ポリマー５．２５ｇをフラスコに秤り取り、水１０ｍＬを加える。得られた混合物を回転させて均質な混合物を得、そして、乾燥固体が認められるまで５０℃の真空下で蒸発させる。固体を８０℃のオーブンで１５時間高真空下（≦０．１ｍｂａｒ）に乾燥させることにより乾燥残渣を得る。

加水分解度は、^１Ｈ−ＮＭＲ（Ｂｒｕｃｋｅｒからの４００ＭＨｚの装置、溶媒：Ｄ_２Ｏ）にて、参考文献に記載されている方法に従い、加水分解可能な基全体に対する加水分
解された基の定量に基づき求められる。

Ｑ．Ｗｅｎ，Ａ．Ｍ．Ｖｉｎｃｅｌｌｉ，Ｒ．Ｐｅｌｔｏｎ，“Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌａｍｉｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ａｎｉｏｎｉｃ ｍｉｃｒｏｇｅｌｓ ｙｉｅｌｄｓ ｋｉｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ”，Ｊ Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ．３６９（２０１２）２２３−２３０。

上述又は後述の実施形態と組み合わせた更なる好ましい実施形態において、ポリビニルアミン又はポリアリルアミンは、重量平均分子量（Ｍｗ）が１５，０００〜８０，０００Ｄａ、好ましくは２０，０００〜７０，０００Ｄａ、より好ましくは２５，０００〜５０，０００Ｄａであり、ホルムアミド基の加水分解度が６６％〜９０％、好ましくは６７％〜８０％、より好ましくは６８％〜７５％である。

上述又は後述の実施形態と組み合わせた更なる好ましい実施形態において、ポリビニルアミン又はポリアリルアミンは、重量平均分子量（Ｍｗ）が１００，０００〜５００，０００Ｄａ、好ましくは１５０，０００〜４００，０００Ｄａ、より好ましくは２００，０００〜３００，０００Ｄａであり、ホルムアミド基の加水分解度が７０％〜９９％、好ましくは７５％〜９５％、より好ましくは７５％〜９０％である。

上述又は後述の実施形態と組み合わせた更なる好ましい実施形態において、第１ポリマーは、架橋度が５〜２５％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）になるように架橋されている。上述又は後述の実施形態と組み合わせた好ましい実施形態において、架橋度は６〜１５％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）、好ましくは７〜１２％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）、より好ましくは８〜９％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）である。

本明細書における「架橋度」は、架橋剤／ポリマーの比として定義される（「架橋剤比」とも称する）。「架橋剤比」は、反応に使用されるポリマー溶液中に存在するビニルアミン構造単位（平均分子量に基づく）に対する架橋剤のモル数の百分率として定義される。

即ち、架橋剤比は、次式（１）に従い求められる：

（式中、Ｖ１（ｍｌ）は架橋剤の体積、ｄ１（ｇ／ｍｌ）は架橋剤の密度、Ｃ１（ｗｔ％）は架橋剤の濃度、Ｗ２（ｇ）はポリマー溶液の重量、Ｃ２（ｗｔ％）はポリマーの濃度、Ｍｗ１（ｇ／ｍｏｌ）は架橋剤の分子量、Ｍｗ２（ｇ／ｍｏｌ）はモノマー単位の平均分子量である）。

Ｍｗ２は次式（２）に従い求められる：

（式中、Ｎｋは、ポリマーを構成するタイプｋのモノマー単位の個数であり、Ｍｋは、タ
イプｋのモノマー単位の分子量（ｇ／ｍｏｌ）である）。

架橋されたポリマーは、アミノ基又はアミド基以外の官能基で誘導体化することができる。しかしながら、架橋されたポリマーは、好ましくはそのような官能基で誘導体化されていない。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、架橋されたポリマーの総濃度は、乾燥した複合材料の総重量を基準として、少なくとも３％ｗ／ｗ、好ましくは少なくとも５％ｗ／ｗ、より好ましくは少なくとも７％ｗ／ｗ、且つ好ましくは２５％ｗ／ｗ未満、より好ましくは２０％ｗ／ｗ未満、最も好ましくは１５％未満である。

複合材料の製造方法
本発明の複合材料は、次に示す方法:
ａ）平均孔径が５〜５００ｎｍである多孔性支持体を、ポリマー、架橋剤及び溶媒を含む溶液又は分散液に浸し；及び
ｂ）ポリマーを２５０℃未満の温度で架橋剤により架橋するこ
により製造することができ、
ポリマーは、重量平均分子量（Ｍｗ）が２，０００〜５００，０００Ｄａであり、ホルムアミド基の加水分解度が少なくとも６６％であるポリビニルアミン又はポリアリルアミンから選択され、但し、重量平均分子量（Ｍｗ）が２７，２００Ｄａであり、且つホルムアミド基の加水分解度が７０％であるポリビニルアミン及び重量平均分子量（Ｍｗ）が５０，０００Ｄａであり、且つホルムアミド基の加水分解度が９５％であるポリビニルアミンは除く。

本発明には、少なくとも２個の反応性基を有する任意の架橋剤を使用することができる。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、架橋剤は、ビスエポキシド、ジアルデヒド及びジグリシジルエーテルから選択される。上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせたより好ましい実施形態において、架橋剤は、プロパンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、グルタルジアルデヒド及びコハク酸ジアルデヒドから選択される。より好ましくは、架橋剤は、ブタンジオールジグリシジルエーテル及びヘキサンジオールジグリシジルエーテルから選択される。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、架橋剤比は、６〜１５％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）、より好ましくは７〜１２％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）、最も好ましくは８〜９％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）である。

上述の方法の工程ｂ）の条件下において、架橋剤及びポリマーと反応しないか、又はゆっくりとしか反応しないのであれば、ポリマー及び架橋剤を溶解又は分散することができる任意の溶媒又は媒体を使用することができる。この文脈における、ゆっくり、とは、工程（ｂ）を行う間、架橋剤と溶媒との間、及びポリマーと溶媒との間に観測可能な反応が起こらないことを意味する。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、溶媒は、極性プロトン性溶媒又は極性非プロトン性溶媒である。上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、溶媒は、水、Ｃ_１〜_６アルコール（例え
ば、メタノール、エタノール、イソプロパノール及びブタノール）及びその混合物から選択される極性プロトン性溶媒である。水が最も好ましい。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、工程ａ）で使用されるポリマー及び架橋剤の溶液のｐＨは、８〜１３、好ましくは９〜１１、最も好ましくは１０〜１１に調整される。ｐＨの調整は、ＮａＯＨやＫＯＨ等の強塩基を添加することにより行うことができる。

上述の方法の工程ｂ）を行う際の温度は、好ましくは２０〜１８０℃、より好ましくは４０〜１００℃、最も好ましくは５０℃〜８０℃である。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、工程ｂ）を行う時間は、好ましくは１時間〜１００時間、より好ましくは８〜６０時間、最も好ましくは１８時間〜４８時間である。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた更なる好ましい実施形態において、工程ｂ）は、４０〜１００℃で８〜６０時間、好ましくは５０〜８０℃で１２〜５０時間、より好ましくは６０℃で２４〜４８時間実施される。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた更なる好ましい実施形態において、本方法は、工程ｂ）の後に、架橋剤の未反応の架橋性基を加水分解する工程ｃ）を更に含む。

複合材料の使用
本明細書において、「供給原料（ｆｅｅｄｓｔｏｃｋ）」及び「供給物（ｆｅｅｄ）」という語は互換的に使用される。

本明細書における「タンパク質」という語は、ポリペプチドを包含する。この種のポリペプチドは、好ましくは、少なくとも２０個のアミノ酸残基、より好ましくは４０〜８０個のアミノ酸残基を含む。

本発明の複合材料は、供給原料中の目的タンパク質の精製に有用である。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、供給原料は、宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）及びＤＮＡ、並びに任意にＲＮＡ及び他の核酸を含む。

本発明における供給原料は、任意に、アルブミン、エンドトキシン、界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）及び微生物又はそれらの断片が含まれる。

本発明はまた、供給原料中の目的タンパク質の精製方法であって：
ｉ）供給原料を本発明による複合材料と十分な時間接触させる工程；
ｉｉ）精製された供給原料から複合材料を分離する工程；
ｉｉｉ）任意に、目的タンパク質を供給原料から単離する工程；及び
ｉｖ）任意に、複合材料を溶媒で洗浄し、得られた溶液を更なる処理のために回収する工程
を含む、方法を提供する。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、目的タンパク質は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（例えば、ヒト免疫グロブリン（ｈＩｇＧ）
）等の組換えタンパク質である。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、供給原料の溶媒は、任意に、緩衝剤、塩及び／又は調整剤（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）を含む水である。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、供給原料は、目的タンパク質及びＤＮＡ、ＲＮＡ又は他の核酸並びに不純物としての宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）を含む発酵ブロスの上清（濾過の前又は後）又は細胞培養液の上清（ＣＣＳ）である。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、複合材料は、バッチ吸着法で使用される。この実施形態における本発明の精製方法の工程ｉ）において、複合材料を供給原料中に分散させ、工程ｉｉ）において、複合材料を供給原料から分離する（例えば、遠心分離による）。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた他の好ましい実施形態において、複合材料はクロマトグラフィーカラムに充填される。

本発明の目的タンパク質の精製方法においては、供給原料を本発明による複合材料と十分な時間接触させる。後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、接触時間は１分間〜１０時間、好ましくは３分間〜５時間、より好ましくは５分間〜１時間である。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態においては、複合材料を供給原料と接触させる前に、複合材料を、ｐＨが８未満、好ましくは３〜７．５、より好ましくは４〜７、最も好ましくは５〜６の水溶液中で平衡化させる。水溶液のｐＨは任意の好適な緩衝剤により調整することができる。例えば、一塩基酸又はその塩をｐＨの調整に使用することができる。好ましい一塩基酸は、ギ酸、酢酸、スルファミン酸、塩酸、過塩素酸及びグリシンである。一塩基酸の好ましい塩は、アンモニウム、アルキルアンモニウム、ナトリウム及びカリウム塩である。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、ｐＨは酢酸アンモニウムを用いて調整される。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた更なる好ましい実施形態において、ｐＨはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で調整される。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、供給原料対複合材料（供給物の体積対乾燥複合材料の重量）の比は、２：１〜１００：１、好ましくは５：１〜８０：１、より好ましくは１０：１〜７０：１、最も好ましくは２０：１〜５０：１の範囲にある。供給原料対複合材料の比が高い方が、複合材料を効率的に利用するという意味で好ましい。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、上述の方法の工程ｉｉ）で分離される、吸着された不純物を含む複合材料を、前記不純物を溶出するための溶出手順に付し、それにより、複合材料を更に使用するために再生する。

本発明の目的タンパク質の精製方法は、当該技術分野において知られている更なる精製工程を含むことができる。この種の精製工程の例としては、イオン交換クロマトグラフィ
ー、凝集剤又は沈殿剤の添加、遠心分離、結晶化、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ又はこれらの組合せを収容している分離媒体を用いる）、膜濾過、深層濾過（珪藻土又は活性炭を用いる）及びモノリシックな分離剤（ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）の適用が挙げられる。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、本発明の目的タンパク質を分離するための方法の工程ｉ）及びｉｉ）は、本発明による同一又は異なる複合材料を用いて連続して複数回（例えば、２、３、４、５、６回）繰り返す。

次に示す実施例により本発明を説明する。

実施例に使用する出発物質
次に示す出発物質を実施例の複合材料の調製に使用した：
ポリマー：
Ａ１ Ｌｕｐａｍｉｎ ４５７０（ＢＡＳＦから供給）（ビニルアミン及びビニルホルムアミドのコポリマー）
Ａ２ Ｌｕｐａｍｉｎ ４５７０を加水分解度６８％まで更に加水分解したもの
Ａ３ Ｌｕｐａｍｉｎ ４５７０を加水分解度８６％まで更に加水分解したもの
Ａ４ Ｌｕｐａｍｉｎ ４５７０を加水分解度９９％まで更に加水分解したもの

ポリマーＡ２〜Ａ４は、ポリマーＡ１を次に示すように更に加水分解することにより得たものである。

ポリマーＡ１を回転台上で穏やかに撹拌することにより均質化した。この均質化したポリマーを丸底フラスコに秤り取り、水酸化ナトリウム水溶液を加えて８０℃で数時間、Ｎ_２気流で保護しながら加熱した。次いで混合物を室温に冷却し（２３℃）、塩酸溶液を用いてｐＨを調整した。正確な条件を表１に列挙する。

ポリマーＡ１〜Ａ４の特性を次の表２に示す。

１）加水分解度
ポリマーＡ１〜Ａ４のホルムアミド基の加水分解度を次に示すように^１Ｈ−ＮＭＲを用いて測定した。

ＮＭＲ分析用のポリマー試料を次に示す一般手順により調製した：
市販のポリマー又は更に加水分解したポリマー５．２５ｇをフラスコに秤り取り、水１０ｍＬを加えた。混合物を回転させて均質な組成物を得、そして、５０℃の真空下で乾燥固体が得られるまで蒸発させた。固体を８０℃のオーブンを用いて高真空下で（≦０．１ｍｂａｒ）１５時間乾燥させることにより乾燥した残渣を得た。

^１Ｈ−ＮＭＲによるホルムアミド基に対する遊離アミン基の定量に基づき、参考文献に記載されている方法に従い加水分解度を決定した：
Ｑ．Ｗｅｎ，Ａ．Ｍ．Ｖｉｎｃｅｌｌｉ，Ｒ．Ｐｅｌｔｏｎ，“Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌａｍｉｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ａｎｉｏｎｉｃ ｍｉｃｒｏｇｅｌｓ ｙｉｅｌｄｓ ｋｉｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ”，Ｊ Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ．３６９（２０１２）２２３−２３０。

^１Ｈ−ＮＭＲ測定には４００ＭＨｚの装置を使用した。乾燥試料をＤ_２Ｏに溶解した。

２）ポリマー濃度
ポリマーＡ１〜Ａ４のポリマー濃度を元素分析に基づき決定した。試料を^１Ｈ−ＮＭＲの項に記載した手順と同じ手順で調製し、乾燥残渣が得られるまで実施した。元素分析装置はＦＬＡＳＨ ２０００ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とした。

３）ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）、多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）及び固有の屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）
ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）、多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）及び固有の屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）を次に示すように求めた。

多角度光散乱及び示差屈折率検出器を連結したサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ−ＲＩ）を使用し、重量平均分子量（Ｍｗ）を、Ｚｉｍｍ形式によるレイリー・ガンズ・デバイ（Ｒａｙｌｅｉｇｈ−Ｇａｎｓ−Ｄｅｂｙｅ）の式を用いて
決定した。

この手法においては、光散乱シグナルが、クロマトグラムの任意の点における平均分子量及び試料濃度並びに固有の屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）に比例すると仮定する。したがって、濃度検出器としての屈折率検出器を連結した光散乱検出器は、クロマトグラムの任意の点の平均分子量を正確に求めることができ、ｄｎ／ｄｃの値が得られた場合、クロマトグラフィーの分布全体の分析を用いて重量平均分子量（Ｍｗ）を決定することができる。

レイリー・ガンズ・デバイの式（式（１））において、光散乱シグナルは、クロマトグラムの任意の点における平均分子量及び試料濃度並びに固有の屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）に比例する。
Ｒ（θ）＝Ｋ^＊ＭＣＰ（θ）［１−２Ａ_２ ＭＣＰ（θ）］Ｒ（θ） （１）
式（１）中、Ｒ（θ）は、過剰（溶質単独に対する）レイリー（Ｒａｙｌｅｉｇｈ）比（即ち、散乱体積及び散乱体積からの距離に関し補正された、散乱光及び入射光強度の比）、Ｍはモル質量（分子量）、Ｃは分析物の濃度、Ｋ^＊は式（２）に従い定められるレイリー比の定数であり：
Ｋ^＊＝（４π^２（ｎ_０）^２／Ｎ_Ａ（λ_０）^４）（ｄｎ／ｄｃ） （２）
式（２）中、ｎ_０は溶媒の屈折率、Ｎ_Ａはアボガドロ数、λ_０は入射光の真空波長、ｄｎ／ｄｃは固有の屈折率増分、Ｐ（θ）は形状因子又は散乱関数であり、粒子の平均二乗半径（ｒ_ｇ）に対する散乱強度の角度変化に関連し、Ａ_２は、溶質と溶媒の相互作用の目安である、第２ビリアル係数である。

この解析から、数平均分子量（Ｍｎ）、重量平均分子量（Ｍｗ）、多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）及びピーク分子量（Ｍｐ）を求めることができる。

測定装置：
ＳＥＣ／ＭＡＬＳ／ＲＩシステムは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ ２０Ａシステム、Ｗｙａｔｔ Ｏｐｔｉｌａｂ ｒＥＸ ＲＩ検出器及びＷｙａｔｔ ＤＡＷＮ ＨＥＬＥＯＳ−ＩＩ ＭＡＬＳ検出器から構成されるものとした。

分子量（Ｍｗ及びＭｎ）及び多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）は、ＷｙａｔｔからのＡｓｔｒａ（バージョン：５．３．４．２０）ソフトウェアを用いて算出した。

ポリマーのＳＥＣ分析を行うために、プレカラムＴｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ６０００ＰＷｘＬ（１３μｍ、７．８ｍｍＩ．Ｄ×３０ｃｍ）を取り付けたＴｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＰＷｘＬ（７μｍ、７．８ｍｍＩ．Ｄ×３０ｃｍ）を使用した。

分析条件：
移動相：０．４５Ｍ 硝酸ナトリウム水溶液＋０．５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）
流速：０．５ｍＬ／分
検出：
ＭＡＬＳの直線偏光レーザーの波長：６５８ｎｍ
ＲＩ
温度：２５℃
注入量：５０μＬ
試料の希釈：ポリマー１０ｍｇ（表２に示した濃度）を移動相１．５ｍＬで希釈
運転時間：５８分

多孔性支持体：
Ｂ１ シリカゲルＤａｖｉｓｉｌ ＬＣ ２５０、４０〜６３μｍ（Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅから供給）
Ｂ２ シリカゲルＸＷＰ５００Ａ、３５〜７５μｍ（Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅから供給）
Ｂ３ シリカゲルＸＷＰ１０００Ａ、３５〜７５μｍ（Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅから供給）
多孔性支持体Ｂ１〜Ｂ３の特性を次の表３に示す。

多孔性支持体の孔径は、ＤＩＮ ６６１３３に準拠し、水銀圧入により求めた。

多孔性支持体の粒度分布はＭａｌｖｅｒｎ Ｌａｓｅｒ Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎにより求めた。

架橋剤：
１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル（ＨＤＧＥ；Ｉｐｏｘ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから供給されているｉｐｏｘ ＲＤ１８）
１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＧＥ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから供給、及びＩｐｏｘ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから供給されているｉｐｏｘ ＲＤ３）

実施例１：
ポリマーＡ２の水溶液（ポリマーＡ２の１１％溶液）１５ｍＬを、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル（ＨＤＧＥ）の溶液（７０４μＬ）と混合することにより、架橋剤が７〜９％になるようにした。架橋剤比は、反応に使用したポリマー溶液中に存在するビニルアミン単位に対する反応性基の量を考慮して算出した。混合後、０．５Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨを１１に調整した。

乾燥粉末状の多孔性支持体Ｂ１を１０ｇ、底が平らな直径８ｃｍのステンレス鋼製の皿に敷いた。ポリマー−架橋剤溶液３９．５ｇを、多孔性支持体Ｂ１全体に均しく行き渡るように滴下し、スパチュラを用いてかき混ぜた。得られたペーストを、表面が滑らかな均質なまとまりになるように、旋回シェーカーにて６００ｒｐｍで１分間振盪した。皿にステンレス鋼の蓋を被せた後、ペーストを更に混ぜたり動かしたりすることなく、６０℃のオーブンで４８時間加熱し、湿った複合体４９．６ｇを得た。

次いでこの湿った複合体４１．３ｇをフリット上において水２５ｍＬで５回洗浄した。次いで、未反応のエポキシ基を加水分解するために、この複合体のケークを１０％硫酸３１．６ｍＬ中に懸濁させ、振盪恒温槽において２時間周囲温度（２３℃）で処理した。そして、生成物をフリット上において再び水２５ｍＬで５回洗浄した後、２０％エタノール水中で保管した。

実施例２〜４並びに比較例１及び２：
実施例２〜４並びに比較例１及び２を、表４に列挙する出発物質を使用したことを除いて比較例１と同様にして調製した。

実施例の複合材料の除去性能及びｈＩｇＧ回収率の測定
複合材料の精製能力を測定するために、目的物質から不純物又は望ましくない化合物が除去（分離）された度合いを測定する。この目的のために、供給物中の個々の成分の濃度を、選択的測定（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｓｓａｙ）を用いて決定する。精製工程の後、精製された画分に対しこの濃度測定を繰り返す。このようにして、これらの濃度及び対応する体積から、純度及び回収率の両方を算出することが可能である。

供給物
未処理且つ未希釈の細胞培養液上清ＣＨＯ Ｋ１に、ヒト血漿由来ｈＩｇＧ（Ｏｃｔａｇａｍ、１０％溶液、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ、Ｖｉｅｎｎａ）を２ｍｇ／ｍＬスパイクしたものを供給物とした。

細胞培養液上清（ＣＣＳ）
ＣＣＳ１
ＣＨＯ−Ｋ１（Ｉｎｖｉｖｏ、Ｂｅｒｌｉｎ）
細胞株：ＣＨＯ−Ｋ１（２．５×１０^６生細胞／ｍＬ）
電気伝導度：１５ｍＳ／ｃｍ
平均宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）濃度：１００〜１５０μｇ／ｍＬ
平均ＤＮＡ濃度：７００〜１，０００ｎｇ／ｍＬ

ＣＣＳ２
ＣＨＯ−Ｋ１（Ｉｎｖｉｖｏ、Ｂｅｒｌｉｎ）
細胞株：ＣＨＯ−Ｋ１
電気伝導度：１３ｍＳ／ｃｍ
平均宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）濃度：６５〜８２μｇ／ｍＬ
平均ＤＮＡ濃度：２５０〜５００ｎｇ／ｍＬ

吸着材は全て供給物と接触させる前に５０ｍＭ酢酸アンモニウムを用いてｐＨ６．５で平衡化させた。

吸着材２００ｍｇをエッペンドルフ管又は遠心管を用いて供給物１ｍＬと一緒にインキュベートした。供給物の体積対吸着材重量の比を５：１（供給物１ｍＬ：吸着材０．２ｇ）とした。５分間穏やかに振盪した後、続いて分析を行うため上清を遠心分離した。供給物体積対吸着材重量の比がより高い５０：１（供給物１ｍＬ：吸着材０．０２ｇ）についても試験を行った。特段の指定がない限り、接触時間は５分間とした。

宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）及びＤＮＡの除去効率並びにｈＩｇＧの回収効率を
求めるために、上に示した３種の物質の定量を、未精製供給物及び複合材料と所定の時間接触させた後の除去処理された供給物について実施した。次いで両方の値を比較した。

宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）測定
宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）の除去効率を求めるためにＣｙｇｎｕｓ ＣＨＯ ＨＣＰ Ｅｌｉｓａ Ｋｉｔ ３Ｇを使用した。Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ（ＵＳＡ）のＣｙｇｎｕｓ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＣＨＯ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ３^ｒｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（＃Ｆ５５０）を製造業者の指示（取扱説明書“８００−Ｆ５５０，Ｒｅｖ．３，２１ＪＵＬ２０１５”）に従い使用し、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ，Ｆｒａｎｃｅ）からのＶｉｃｔｏｒＸ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ及び対応するソフトウェアを読取り及びデータ評価に使用した。試料をサンプル希釈液で希釈した（製品カタログ番号＃Ｉ０２８、Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより購入）。

ＨＣＰ除去率を次に示すように表す：
ＨＣＰ除去率（％）＝１００×（上清中のＨＣＰ濃度）／（初期スパイク時のＣＣＳ中のＨＣＰ濃度）
上式における「上清」は精製後のＣＣＳを指す。

ＤＮＡ測定
分析試料は初期ＣＣＳ（スパイクｈＩｇＧ含有又は非含有）及び除去処理後の試料とした。

ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（＃Ｄ１００Ｔ），Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ（ＵＳＡ）を用いて製造業者の指示に従いＤＮＡを抽出した後、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（＃Ｐ７５８９），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ （Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、ＤＮＡ特異的蛍光アッセイ（ＤＮＡ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ）によりＤＮＡの定量を行った。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ，Ｆｒａｎｃｅ）からのＶｉｃｔｏｒＸ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ及び対応するソフトウェアを読取り及びデータ評価に使用した。

ＤＮＡの除去率を次に示すように表す：
ＤＮＡ除去率（％）＝１００×（上清中のＤＮＡ濃度）／（初期スパイク時のＣＣＳ中のＤＮＡ濃度）
上式における「上清」は精製後のＣＣＳを指す。

サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によるｈＩｇＧ回収率測定
ｈＩｇＧ回収率を次に示すように定量ＳＥＣによって求めた。

供給物中のｈＩｇＧ濃度及び精製後の溶液中のｈＩｇＧ回収率を次に示す条件でＳＥＣを用いて求めた。
カラム：Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＬＣＣからのＴＳＫｇｅｌ ＵＰ ＳＷ３０００ ４．６ × ３００ｍｍ（粒子径２μｍ）
移動相：１００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．７）＋１００ｍＭ Ｎａ_２ＳＯ_４＋０．０５％ ＮａＮ_３
注入量：１０μＬ（試料を移動相で希釈）
流速：０．３５ｍＬ／分
検出器：ＤＡＤ ２８０ｎｍ
温度：２５℃

この高効率カラム及びそれに付随する分析条件により、単量体及び二量体ピークを適切に定量することが可能になる。

ｈＩｇＧ回収率を次に示すように表す：
回収率（％）＝１００×（上清中のｈＩｇＧ濃度）／（初期スパイク時のＣＣＳ中のｈＩｇＧ濃度）
上式における「上清」は精製後のＣＣＳを指す。

結果を表５に示す。

表５から分かるように、供給物：複合体比を５０：１とした場合のｈＩｇＧの回収率はほぼ定量的であった（≧９６％）。

供給物：複合体比を５：１とした場合、実施例１〜４は９５％を超えるＤＮＡ及びＨＣＰを供給原料から除去した。

表５から分かるように、ポリマーＡ１（加水分解度６５％）を用いて得られた比較例１は、ＨＣＰ及びＤＮＡの除去能力が実施例１よりも劣っている。

このように、本発明の複合材料は、高い供給原料対複合体比においても優れたＤＮＡ及びＨＣＰ除去率並びにｈＩｇＧ回収率を達成し、したがって、目的タンパク質の効率的且つ費用対効果の高い精製に適している。

Claims (15)

1. 平均孔径が５〜５００ｎｍである多孔性支持体であって、架橋されたポリマーが充填されている、多孔性支持体を含む複合材料であって、
   前記ポリマーは、重量平均分子量（Ｍｗ）が２，０００〜５００，０００Ｄａであり、ホルムアミド基の加水分解度が少なくとも６６％であるポリビニルアミン又はポリアリルアミンから選択され、
   但し、重量平均分子量（Ｍｗ）が２７，２００であり、且つ加水分解度が７０％であるポリビニルアミン及び重量平均分子量（Ｍｗ）が５０，０００であり、且つホルムアミド基の加水分解度が９５％であるポリビニルアミンは除く、複合材料。
2. 前記多孔性支持体は、平均粒子径が１μｍ〜５００μｍである粒子状材料である、請求項１に記載の複合材料。
3. 前記多孔性支持体材料は、多孔性シリカゲルである、請求項１又は２に記載の複合材料。
4. 前記ポリビニルアミンは、ビニルアミンの直鎖若しくは分岐ホモポリマー又はビニルアミン及びビニルホルムアミドのコポリマーである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の複合材料。
5. 架橋されたポリマーの濃度は、乾燥した前記複合材料の総重量を基準として少なくとも３％ｗ／ｗである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の複合材料。
6. 前記ポリビニルアミン又はポリアリルアミンの加水分解度は６８％〜９９％である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の複合材料。
7. ａ）平均孔径が５〜５００ｎｍである多孔性支持体を、ポリマー、架橋剤及び溶媒を含む溶液又は分散液に浸す工程；及び
   ｂ）前記ポリマーを２５０℃未満の温度で前記架橋剤により架橋する工程
   を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合材料の製造方法であって、
   前記ポリマーは、重量平均分子量（Ｍｗ）が２，０００〜５００，０００Ｄａであり、ホルムアミド基の加水分解度が少なくとも６６％であるポリビニルアミン又はポリアリルアミンから選択され、
   但し、重量平均分子量（Ｍｗ）が２７，２００Ｄａであり、且つホルムアミド基の加水分解度が７０％であるポリビニルアミン及び重量平均分子量（Ｍｗ）が５０，０００Ｄａであり、且つホルムアミド基の加水分解度が９５％であるポリビニルアミンは除く、
   方法。
8. 前記溶媒は、水、アルコール、エーテル及びケトン又はこれらの混合物から選択される、請求項７に記載の方法。
9. 架橋剤はプロパンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、グルタルジアルデヒド及びコハク酸ジアルデヒドから選択される、請求項７又は８に記載の方法。
10. 供給原料中の目的タンパク質を精製するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合材料の使用。
11. 前記目的タンパク質はモノクローナル抗体である、請求項１０に記載の使用。
12. 供給原料中の目的タンパク質の精製方法であって：
    ｉ）前記供給原料を請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合材料と十分な時間接触させる工程；
    ｉｉ）精製された前記供給原料から前記複合材料を分離する工程；
    ｉｉｉ）任意に、前記目的タンパク質を前記供給原料から単離する工程；及び
    ｉｖ）任意に、前記複合材料を溶媒で洗浄し、得られた溶液を更なる処理のために回収する工程
    を含む、方法。
13. 前記目的タンパク質はモノクローナル抗体である、請求項１２に記載の方法。
14. 前記接触時間は少なくとも１分間である、請求項１２又は１３に記載の方法。
15. 前記供給原料は、宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）及びＤＮＡを含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。