KR101243601B1 - 크로마토그래피 리간드 - Google Patents

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KR101243601B1
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카리나 엥스트란트
안니카 포르쓰
군나르 글라드
보-렌나르트 요한슨
한스 제이. 요한슨
장-뤼크 말루아셀
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지이 헬스케어 바이오-사이언시스 에이비
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Abstract

본 발명은 하기 식 (I)로 정의되는 크로마토그래피 리간드에 관한 것이다.
[식 I]
R1-R2-N(R3)-R4-R5
{여기서, R1은 치환 또는 비치환 페닐기이고, R2는 0 내지 4개의 탄소 원자를 포함하는 탄화수소 쇄이고, R3은 1 내지 3개의 탄소 원자를 포함하는 탄화수소 쇄이고, R4는 1 내지 5개의 탄소 원자를 포함하는 탄화수소 쇄이고, R5는 OH 또는 H임}
본 발명은 또한 다공성 지지체, 예를 들어 입자 또는 막에 커플링된 설명된 리간드를 포함하는 분리 매트릭스를 포함한다. 본 발명에 따른 리간드 및 매트릭스는 생체분자 또는 유기 화합물, 예를 들어 단백질, 폴리펩티드, DNA 등의 정제를 위해 유용하다. 본 발명에 따른 유익한 용도는 항체의 정제이다.
항체의 정제, 리간드, 크로마토그래피, 분리 매트릭스

Description

크로마토그래피 리간드 {CHROMATOGRAPHY LIGAND}
본 발명은 단백질과 같은 생체분자의 정제를 위해 유용한 신규한 크로마토그래피 리간드에 관한 것이다. 본 발명의 리간드는 예를 들어, 바람직하게는 다공성 지지체, 예를 들어 입자 또는 막에 고정된 항체의 정제에 유용하다. 결과적으로, 본 발명은 또한 신규한 리간드를 포함하는 크로마토그래피 매트릭스, 그의 제조를 위한 방법 및 항체 정제용 키트를 포괄한다.
면역계는 공동으로 세균, 기생충, 진균, 바이러스 감염 및 종양 세포의 성장으로부터 신체를 보호하는 많은 상호의존적인 세포 종류로 구성된다. 면역계의 보초는 그들의 숙주의 혈류를 계속 배회하는 대식세포이다. 감염 또는 면역화에 의해 공격받을 때, 대식세포는 항원으로 알려진 외래 분자로 표식된 침입자를 포식함으로써 반응한다. 헬퍼 T 세포에 의해 매개되는 상기 사건은 B-세포를 자극하는 복잡한 연쇄 반응을 설명한다. 이들 B-세포는 다시 외래 침입자에 결합하는 항체로 불리는 단백질을 생산한다. 항체와 항원 사이의 결합 사건은 식균작용 또는 보체계의 활성화를 통해 파괴하기 위해 외래 침입자를 표식한다. 많은 상이한 클래스의 항체 (면역글로불린으로도 알려짐), 예를 들어 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재한다. 이들은 그들의 생리학적 역할뿐만 아니라 구조에서 상이하다. 구조적 관점에서, IgG 항체가 아마도 성숙 면역 반응에서의 우세한 역할 때문에 광범위하게 연구되었다. 폴리클로날 항체는 표준 방법에 따라 적절한 항원으로 동물을 면역화시켜 생산된다. 응답시, 동물은 폴리클로날인 항체를 생산할 것이다. 그러나, 많은 목적을 위해, 모노클로날 항체로서 공지된 특정 항체의 단일 클론을 갖는 것이 요망된다. 모노클로날 항체 (MAb)는 단일 항체만을 생산하는 정상 B-세포와 비정상 골수종 종양 세포 사이의 융합체로 이루어진 융합된 세포 또는 하이브리드 (hybrid)에 의해 생산된다. 하이브리도마 (hybridoma)로서 공지된 생성된 하이브리드는 오늘날 항체 생산을 위한 표준 방법에서 사용된다.
면역글로불린이 갖는 생물학적 활성은 오늘날 인간 및 수의학 진단, 보건 및 치료 부문에서 다양한 상이한 용도로 활용된다. 실제로, 지난 수년 동안, 모노클로날 항체 및 재조합 항체 구성체는 현재 임상 시험으로 연구되고 치료제 및 진단제로서 FDA 승인을 받는 단백질의 가장 큰 클래스가 되었다. 발현 시스템 및 생산 계획에 보완적으로, 간단하고 비용 효율적인 방식으로 고도로 순수한 항체를 얻기 위해 효율적인 정제 프로토콜이 요구된다.
면역글로불린 단리를 위한 전통적인 방법은 다른 군의 단백질을 용액 중에 남기면서 면역글로불린을 포함하는 단백질 분획의 선택적이고 가역적 침전에 기반한다. 전형적인 침전제는 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 리오트로픽 (lyotropic) 염, 예를 들어 황산암모늄 및 인산칼륨, 및 카트릴산이다. 대개, 이들 침전 방법은 매우 불순한 생성물을 제공하면서, 동시에 시간 소모적이고 수고롭다. 또한, 원료 물질에 침전제를 첨가하면 상등액을 다른 목적에 사용하기가 어렵게 되고, 폐기 문제를 일으키며, 이는 면역글로불린의 대규모 정제를 이야기할 때 특히 관련된다.
면역글로불린 단리를 위한 대안적인 방법은 크로마토그래피이고, 이는 밀접하게 관련된 분리 방법의 종류를 포괄한다. 크로마토그래피를 대부분의 다른 물리적 및 화학적 분리 방법과 구분하는 특징은 2개의 상호 불혼화상을 접촉시키는 것이고, 여기서 하나의 상은 정지상이고 다른 것은 이동상이다. 이동상 내로 도입된 샘플 혼합물은 이동상에 의해 시스템을 통해 운반되는 동안 정지상 및 이동상과 일련의 상호작용을 겪는다. 상호작용은 샘플 중의 성분들의 물리적 또는 화학적 특성의 차이를 활용한다. 이들 차이는 정지상을 함유하는 컬럼을 통해 이동하는 이동상의 영향 하에 개별 성분들의 이동 속도를 좌우한다. 분리된 성분은 정지상과의 상호작용이 증가하는 순서로 빠져나온다. 가장 적게 지연된 성분이 처음에 용출하고, 가장 강하게 보유된 물질이 마지막에 용출한다. 샘플 성분들이 컬럼으로부터 용출할 때 한 성분이 인접한 용질 구역과 겹치는 것을 방지하기 위해 충분히 지연될 때 분리가 이루어진다. 각각의 특수한 분리 목적을 위한 최적 정지상을 설계하기 위한 노력이 계속 이루어지고 있다. 상기 정지상은 일반적으로 관능기, 즉 결합기를 포함하는 리간드가 부착되는 지지체 또는 베이스 (base) 매트릭스로 구성된다. 이용하는 상호작용의 원리를 기초로 각각의 종류의 크로마토그래피, 예를 들어 이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 친화도 크로마토그래피를 일반적으로 참조한다.
친화도 크로마토그래피는 자물쇠-열쇠 인식 원리의 표적 생체분자와 생물특 이적 리간드 사이의 특이적 상호작용에 기반한다. 따라서, 표적물 및 리간드는 친화도 쌍, 예를 들어 항원/항체, 효소/수용체 등을 구성할 것이다. 단백질-기반 친화도 리간드, 예를 들어 항체의 단리 및 정제를 위해 널리 이용되는 방법인 프로테인 A(Protein A) 및 프로테인 G(Protein G) 친화도 크로마토그래피가 잘 알려져 있다. 프로테인 A 크로마토그래피는 특히 모노클로날 항체에 대한 현저한 특이성을 제공하고, 결과적으로 고순도를 얻을 수 있음이 잘 알려져 있다. 이온 교환, 소수성 상호작용, 히드록시아파타이트 및/또는 겔 여과 단계와 조합 사용되어, 프로테인 A-기반 방법은 많은 생물의약품 회사에서 선택되는 항체 정제 방법이 되었다 (예를 들어 WO 8400773 및 US 5,151,350 참조). 그러나, 단백질의 펩티드 결합 때문에, 프로테인 A 매트릭스는 일정 정도의 알칼리 감도를 나타낸다. 또한, 프로테인 A 매트릭스가 세포 배양 배지로부터 항체를 정제하기 위해 사용될 때, 세포로부터 기원하는 프로테아제는 프로테인 A 또는 그의 펩티드 단편의 누출을 일으킬 수 있다.
이온 교환 크로마토그래피는 종종 면역글로불린 단리를 위한 프로토콜에서 사용된다. 음이온 교환 크로마토그래피에서, 면역글로불린의 음으로 하전된 아미노산 측쇄는 크로마토그래피 매트릭스의 양으로 하전된 리간드와 상호작용할 것이다. 반면, 양이온 교환 크로마토그래피에서, 면역글로불린의 양으로 하전된 아미노산 측쇄는 크로마토그래피 매트릭스의 음으로 하전된 리간드와 상호작용할 것이다.
소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)는 면역글로불린의 단리를 위한 프로 토콜에서 설명되고 사용된 다른 방법이다. 고도로 순수한 면역글로불린 생성물이 목적물이면, HIC를 하나 이상의 추가 단계와 혼합하는 것이 일반적으로 권장된다. HIC에서, 면역글로불린을 HIC 매트릭스에 효율적으로 결합시키기 위해, 이동상에 리오트로픽 염을 첨가하는 것이 요구된다. 결합된 면역글로불린은 리오트로픽 염의 농도를 저하시킴으로써 매트릭스로부터 후속적으로 방출된다. 따라서, 상기 절차의 단점은 원료 물질에 리오트로픽 염을 첨가할 필요성이고, 이는 문제를 일으킬 수 있으므로 결과적으로 대규모 사용자에게 비용을 증가시킨다. 예를 들어, 유장, 혈장 및 난황과 같은 원료 물질에 대해, 리오트로픽 염을 원료 물질에 첨가하는 것은 염이 면역글로불린 고갈된 원료 물질의 임의의 경제적으로 실행가능한 이용을 방해할 수 있으므로, 많은 경우 대규모 용도에서 금지될 것이다. 대규모 용도에서 추가의 문제는 수천 리터의 폐기물의 처리일 것이다.
US 5,945,520 (Burton et al)에서는 결합의 pH에서 소수성 특성을 나타내고, 탈착의 pH에서 친수성 및/또는 정전 특성을 나타내는 혼합 모드 (mixed mode) 크로마토그래피 수지를 개시한다. 수지는 구체적으로 저 및 고 이온 강도 모두에서 수용액으로부터의 표적 화합물에 결합하도록 설계된다. 이는 스페이서 아암 (spacer arm) 및 적어도 하나의 이온화가능 관능기를 포함하는 선택된 이온화가능 리간드에 의해 달성되고, 여기서 고체 지지체 매트릭스 상의 이온화가능 리간드의 밀도는 약 150 μmol/mL 수지 또는 1 mmol/g 수지 건조 중량 중 작은 것보다 더 크다. 또한, 상기 이온화가능 리간드를 포함하는 수지의 소수성 특성은 처음 pH에서 고 및 저 이온 강도에서 수성 매질 중 적어도 50％의 표적 화합물에 결합하기에 충분하다. 이온화가능 관능기의 예시적인 예는 4-(아미노메틸)피리딘, 3-(아미노메틸)피리딘, 2-(아미노메틸)피리딘, 1-(3-아미노프로필)-이미다졸, 2-(아미노메틸)-벤즈이미다졸, 4-(3-아미노프로필)모르폴린이 있다.
또한, WO 01/38228 (Belew et al.)은 음이온-교환 흡착 방법에 관한 것이고, 여기서 액체로부터 양으로 하전된 물질을 그의 결합에 의해 제거하기 위해 티오에테르 음이온-교환제가 사용된다. 각각의 리간드는 양으로 하전된 질소, 및 상기 전하로 하전된 질소로부터 1-7개 원자의 거리에서 티오에테르 연결기를 포함한다. 목적하는 물질, 예를 들어 세포, 세포의 일부, 및 펩티드 구조를 포함하는 물질은 0.25M NaCl의 구역의 염 농도에서 흡착된다.
마지막으로, US 6,702,943 (Johansson et al)에서는 음이온-교환기 및 소수성 구조를 포함하는 복수개의 리간드를 갖는 매트릭스에의 그의 흡착에 의한 액체로부터의 표적 물질의 제거 방법을 개시한다. 보다 구체적으로, 리간드는 양으로 하전된 음이온-교환기에 근접한 방향족 고리를 포함한다. 목적하는 물질은 세포, 세포의 일부, 및 펩티드 구조를 포함하는 물질인 것으로 진술된다. 개시된 리간드는 0.25M NaCl과 같은 고농도의 염에서 표적 물질을 흡착시키는 능력 때문에 "고 염 리간드"로 표시된다.
그러나, 구체적인 표적 분자의 정제에 관련된 공정을 최적화하기 위해, 독특한 작업 조건이 요구될 것이고, 최상의 분리 매트릭스는 사례마다 다를 것이다. 예를 들어, 바이오테크 산업에서, 펩티드 및 단백질; 핵산; 바이러스 등의 정제를 위해 특이적인 공정이 설계될 필요가 있다. 또한, 항체의 정제에서, 항체의 종류 는 분리 매트릭스의 선택에 결정적일 것이다. 따라서, 당업계에서 끊임없이 개발되는 많은 새로운 생성물의 정제를 위해 넓은 선택 범위를 제공하기 위해 대안적인 분리 매트릭스가 여전히 필요하다.
<발명의 간단한 설명>
본 발명의 한 측면은 액체의 다른 성분으로부터 항체의 분리에 유용한 신규한 리간드를 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 측면은 오염 단백질을 흡착할 수 있지만 표적 항체를 흡착하지 않는 상기 리간드를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 추가 측면과 잇점은 아래 상세한 설명으로부터 분명해질 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 예시적인 크로마토그래피 리간드, 즉 그의 아민을 통해 지지체에 커플링된 N-벤질-N-메틸 에탄올아민이다.
도 2는 아래 설명된 바와 같이, 세파로스(Sepharose)™ 6 FF 상에 고정된 N-벤질-N-메틸 에탄올아민 리간드; 및 참조용으로 강한 음이온 교환제 Q 세파로스™ FF를 포함하는 분리 매트릭스 상에서의 모노클로날 항체의 분리의 크로마토그램을 보여준다.
도 3a) 및 b)는 mAb1-r프로테인 A의 혼합물을 사용하여 리간드 프로토타입 상에서 수행된 크로마토그래피의 결과를 도시한 것이다.
도 4a)-c)는 MAb 1, 1％ rPrA을 갖는 샘플 및 도 3의 크로마토그래피 실행으로부터의 모아진 유출물 (flow-through) 및 용출액 분획에 대한 분석적 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)의 결과를 도시한 것이다.
<정의>
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다.
용어 "분리 매트릭스"는 본원에서 관능기를 포함하는 1종 이상의 리간드가 커플링된 지지체로 구성된 물질을 나타내도록 사용된다. 용어 "수지"는 때때로 당업계에서 분리 매트릭스에 대해 사용된다.
용어 "다중-모드" 분리 매트릭스는 결합될 화합물과 상호작용하는 적어도 2가지의 상이하지만 동시-작용성인 부위를 제공할 수 있는 매트릭스를 나타낸다. 예를 들어, 이들 부위 중 하나는 리간드와 관심있는 물질 사이의 인력 유형의 전하-전하 상호작용을 제공할 수 있다. 다른 부위는 전자 수용체-공여체 상호작용 및/또는 소수성 및/또는 친수성 상호작용을 제공할 수 있다. 전자 공여체-수용체 상호작용은 수소-결합, π-π, 양이온-π, 전하 전달, 쌍극자-쌍극자, 유도 쌍극자 등과 같은 상호작용을 포함한다. "다중-모드" 분리 매트릭스는 "혼합 모드" 분리 매트릭스로서 또한 공지된다.
용어 "표면"은 본원에서 모든 외부 표면을 의미하고, 다공성 지지체의 경우에 외부 표면 및 공극 표면을 포함한다.
용어 "용리액"은 당업계에서 그의 통상적인 의미로 사용되고, 즉 분리 매트릭스로부터 1종 이상의 화합물을 방출시키기 위해 적합한 pH 및/또는 이온 강도의 완충제를 의미한다.
용어 "포획 단계"는 액체 크로마토그래피의 맥락에서 분리 절차의 초기 단계를 나타낸다. 가장 일반적으로, 포획 단계는 정화, 농축, 안정화, 및 가용성 불순물로부터의 유의한 정제를 포함한다. 포획 단계 후, 남아있는 양의 불순물, 예를 들어 숙주 세포 단백질, DNA, 바이러스, 내독소, 영양소, 세포 배양 배지의 성분, 예를 들어 소포제 및 항생제, 및 생성물-관련 불순물, 예를 들어 응집체, 잘못 폴딩된 물질종 및 응집체를 추가로 제거하는 중간 정제가 이어질 수 있다.
용어 "1회용"은 본원에서 크로마토그래피 컬럼 및 다른 분리 매트릭스의 맥락에서 단일 사용 또는 제한된 수의 사용으로 의도된 매트릭스를 의미한다. 1회용 제품은 유리하게는 매우 소량으로도 유해한 오염물질을 제거하기 위해 사용되고, 이 경우에 상기 오염물질을 매트릭스에 흡착시킨 다음 매트릭스를 폐기하는 것이 편리하다. 1회용 제품이 요망되는 다른 상황은 멸균 처리를 위한 것이고, 이 경우 매트릭스는 멸균되거나 적어도 무균 상태이다.
용어 "폴리싱 단계"는 액체 크로마토그래피의 맥락에서 최종 정제 단계를 나타내고, 여기서 미량의 불순물이 제거되어 활성의 안전한 생성물을 남긴다. 폴리싱 단계 동안 제거된 불순물은 종종 표적 분자 또는 의심되는 누출 생성물의 이형태체 (conformer)이다.
용어 "Fc-결합 단백질"은 항체의 결정화가능 부분 (Fc)에 결합할 수 있는 단백질을 의미하고, 예를 들어 프로테인 A 및 프로테인 G, 또는 상기 결합 특성을 유지하는 그의 임의의 단편 또는 융합 단백질을 포함한다.
제1 측면에서, 본 발명은 방향족 에탄올아민을 포함하는 크로마토그래피 리간드에 관한 것이다. 본 발명에 따른 리간드는 아래에 보다 상세히 논의할 바와 같이 항체의 정제에서 특히 유용하다.
제1 실시태양에서, 본 발명의 리간드는 하기 식에 의해 정의된다:
R1-R2-N(R3)-R4-R5
식에서,
R1은 치환 또는 비치환 방향족 고리계, 예를 들어 페닐기이고;
R2는 0 내지 4개의 탄소 원자를 포함하는 탄화수소 쇄이고;
R3은 1 내지 3개의 탄소 원자를 포함하는 탄화수소 쇄이고;
R4는 1 내지 5개의 탄소 원자를 포함하는 탄화수소 쇄이고;
R5는 OH 또는 H이다.
상기에서 보이는 바와 같이, R1기는 탄소 원자를 포함하지 않을 수 있거나, 즉 R1과 아민 사이에 결합을 구성하거나; 또는 임의로 치환되는 1 내지 4개의 탄소 원자, 예를 들어 2 내지 3개의 탄소 원자를 포함할 수 있는 탄소 쇄 R2를 통해 아민에 연결된다. 아민을 R5와 연결시키는 탄소 쇄 R4는 1 내지 5개의 탄소 원자, 예를 들어 2 내지 4개의 탄소 원자를 포함할 수 있고, 이는 임의로 치환된다. 아민의 R3은 1 내지 3개의 탄소 원자, 예를 들어 2개의 탄소 원자를 포함할 수 있고, 이는 임의로 치환된다.
방향족 고리계 R1은 치환(들)이 리간드의 결합 특성을 임의의 실질적인 정도로 손상하지 않는다면 하나 이상의 치환 또는 비치환 페닐기를 포함할 수 있다. 따라서, R1은 하나 이상의 방향족 고리, 예를 들어 페닐렌, 비페닐렌 또는 나프틸렌 구조 및 다른 방향족 고리계를 포함할 수 있다. 방향족 고리는 헤테로환일 수 있고, 즉 하나 이상의 질소, 산소 또는 황 원자를 함유할 수 있고, 예를 들어 피리딘, 피리미딘, 피롤, 이미다졸, 티오펜 또는 피란일 수 있다. 예시적인 치환 R1기는 히드록시페닐 (2-, 3- 및 4-); 2-벤즈이마도졸릴; 메틸티옥시페닐 (2-, 3- 및 4-); 3-인돌릴; 2-히드록시-5-니트로페닐; 아미노페닐 (2-, 3- 및 4-); 4-(2-아미노에틸)페닐; 3,4-디히드록시페닐; 4-니트로페닐; 3-트리플루오로메틸페닐; 4-이미다졸릴; 4-아미노피리딘; 6-아미노피리미딜; 2-티에닐; 2,4,5-트리아미노페닐; 4-아미노트리아지닐; 및 4-술폰아미도페닐로 이루어진 군 중에서 선택된다.
유리한 실시태양에서, R1은 비치환 페닐이다. 별도의 실시태양에서, R1은 하나 이상의 OH기로 치환된 페닐이다.
또한, 하나 이상의 R1, R2, R3 및 R4는 리간드의 결합 특성을 임의의 실질적인 정도로 손상시키지 않는다면 임의의 적합한 치환체로 치환될 수 있다. 예를 들어, 보다 친수성 리간드가 요구되면, 하나 이상의 친수성 기, 예를 들어 OH기를 포함할 수 있다. 별법으로, 치환은 리간드의 소수성을 증가시킬 수 있고, 이 경우에 리간드는 하나 이상의 소수성 기, 예를 들어 알킬 및/또는 불소를 포함할 수 있다. 마지막으로, 치환은 리간드의 다중-모드 특성을 증가시키기 위해 하나 이상의 추가의 관능기, 예를 들어 전하로 하전된 물질을 도입하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 탄소 쇄 R2 및 R3은 리간드의 결합 특성을 임의의 실질적인 정도로 손상시키지 않는다면 직쇄 또는 분지쇄일 수 있다.
본 발명의 리간드의 특정 실시태양에서, R2는 -CH2-이다. 다른 실시태양에서, R3은 -CH3이다. 추가의 실시태양에서, R4는 -CH2-CH2-CH2- 또는 -CH2-CH2-이다. 또다른 실시태양에서, R1은 비치환 페닐이다.
따라서, 유리한 실시태양에서, 본 발명에 따른 리간드는 N-벤질-N-메틸 에탄올 아민 (BMEA)을 포함한다. 별도의 실시태양에서, 리간드는 N,N-디메틸벤질아민이다.
본 발명에 따른 리간드는 유기 화학의 표준 방법을 사용하여 당업계의 숙련인에 의해 쉽게 합성된다.
본 발명의 추가 측면은 상기 설명된 바와 같은 복수개의 리간드를 지지체에 고정시키는 것을 포함하는, 분리 매트릭스의 제조 방법에 관한 것이다. 특히 의료 또는 진단 분야에서 단일 사용에 적합한 매트릭스를 제공하기 위해, 본 발명에 따라 제조된 분리 매트릭스는 후속 단계에서 또한 멸균된다. 따라서, 한 실시태양에서, 상기 방법은 상기 설명된 바와 같이 매트릭스를 제조하고; 이렇게 제조된 매트릭스를 컬럼 내에 제공하고; 이렇게 제조된 매트릭스를 멸균시키는 것을 포함한다. 멸균은 적합한 조건 하에 당업계의 숙련인에 의해, 예를 들어 열 처리; 방사선 조사; 또는 임의의 다른 통상적으로 사용되는 방법에 의해 쉽게 수행된다.
상기 식에서 알 수 있는 바와 같이, 비고정 상태에서, 본 발명에 따른 리간드는 지지체에 대한 커플링을 위한 적합한 핸들 (handle)을 구성할 3급 아민을 포함하여, 4급 아민 및 페닐기를 포함하는 커플링된 리간드를 생성시킨다. 결과적으로, 고정된 상태에서, 본 발명에 따른 리간드는 양으로 하전된 4급 아민기에 추가로 소수성인 방향족 고리 구조를 또한 포함하므로 다중-모드 음이온 교환 리간드인 것으로 간주된다. 리간드를 다공성 또는 비-다공성 표면에 고정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 [Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson et al, Greg T. Hermanson, A. Krishna Mallia and Paul K. Smith, Academic Press, INC, 1992] 참조). 한 실시태양에서, 지지체의 표면에서 리간드 밀도는 통상적인 이온 교환 매트릭스에 일반적으로 사용되는 것에 가까운 범위 내에 있다.
유리한 실시태양에서, 리간드의 지지체에의 커플링은 지지체와 링커 사이에 링커를 도입함으로써 제공된다. 커플링은 예를 들어 에피클로로히드린; 에피브로모히드린; 알릴-글리시딜에테르; 비스-에폭시드, 예를 들어 부탄디올디글리시딜에테르; 할로겐-치환 지방족 물질, 예를 들어 디-클로로-프로판올; 및 디비닐 술폰을 사용하여 임의의 통상적인 공유 커플링 방법에 따라 수행할 수 있다. 이들 방법은 모두 당업계에 공지되어 있고, 당업자에 의해 쉽게 수행된다.
특정 실시태양에서, 본 발명에 따른 리간드는 연장제 (extender)로도 알려진 보다 긴 링커 분자를 통해 지지체에 커플링된다. 연장제는 당업계에 잘 알려져 있고, 일반적으로 리간드와 지지체 사이의 거리를 입체적으로 증가시키기 위해 사용된다. 연장제는 때때로 촉수 (tentacle) 또는 가요성 아암 (arm)으로 불리고, 가능한 화학 구조에 대한 보다 상세한 내용은 예를 들어 본원에 참고로 포함된 US 6,428,707을 참조한다. 간단히 설명하면, 연장제는 중합체, 예를 들어 단일중합체 또는 공중합체 형태일 수 있다. 친수성 중합성 연장제는 합성 기원, 즉 합성 골격을 갖거나, 생물학적 기원, 즉 천연 골격을 갖는 생체중합체일 수 있다. 전형적인 합성 중합체는 폴리비닐 알코올, 폴리아크릴- 및 폴리메타크릴아미드, 폴리비닐 에테르 등이다. 전형적인 생체중합체는 다당체, 예를 들어 전분, 셀룰로스, 덱스트란, 아가로즈이다.
지지체는 유기 또는 무기 물질로부터 제조될 수 있고, 다공성 또는 비-다공성일 수 있다. 한 실시태양에서, 지지체는 천연 중합체, 예를 들어 가교결합된 탄수화물 물질, 예를 들어 아가로즈, 아가, 셀룰로스, 덱스트란, 키토산, 곤약, 카라기난, 겔란, 알기네이트, 펙틴, 전분 등으로부터 제조된다. 천연 중합체 지지체는 표준 방법, 예를 들어 역상 현탁 겔화에 따라 쉽게 제조되고 임의로 가교결합된다 (S Hjerten: Biochim Biophys Acta 79(2), 393-398 (1964)). 특히 유리한 실시태양에서, 지지체는 그의 유동 특성을 향상시키는 방법에 의해 제조된, 비교적 경질이지만 다공성인 아가로즈의 일종이다 (예를 들어, US 6,602,990 (Berg) 또는 SE 0402322-2 (Berg et al.) 참조). 별도의 실시태양에서, 지지체는 합성 중합체 또는 공중합체, 예를 들어 가교결합된 합성 중합체, 예를 들어 스티렌 또는 스티렌 유도체, 디비닐벤젠, 아크릴아미드, 아크릴레이트 에스테르, 메타크릴레이트 에스테르, 비닐 에스테르, 비닐 아미드 등으로부터 제조된다. 상기 합성 중합체는 표준 방법에 따라 쉽게 제조되고 임의로 가교결합된다 (예를 들어, 문헌["Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization" (R Arshady: Chimica e L'Industria 70(9), 70-75 (1988)] 참조). 천연 또는 합성 중합체 지지체는 또한 상업적인 공급원, 예를 들어 지이 헬쓰케어 (GE Healthcare, 스웨덴 웁살라)로부터 예를 들어 다공성 입자 형태로 입수가능하다. 또다른 별도의 실시태양에서, 지지체는 무기 중합체, 예를 들어 실리카로부터 제조된다. 무기 다공성 및 비-다공성 지지체는 당업계에 잘 알려져 있고, 표준 방법에 따라 쉽게 제조된다.
본 발명의 분리 매트릭스의 적합한 입자 크기는 직경이 5-500 ㎛, 예를 들어 10-100 ㎛, 예를 들어 20-80 ㎛일 수 있다. 본질적으로 구형 입자의 경우에, 평균 입자 크기는 5-1000 ㎛, 예를 들어 10-500 ㎛일 수 있다. 특정 실시태양에서, 평균 입자 크기는 10-200 ㎛이다. 당업계의 숙련인은 사용될 공정에 따라 적합한 입자 크기 및 다공도를 쉽게 선택할 수 있다. 예를 들어, 대규모 공정에서, 경제적인 이유로, 보다 다공성이지만 경질인 지지체가 특히 포획 단계를 위해 큰 부피의 처리를 허용하기 위해 바람직할 수 있다. 크로마토그래피에서, 컬럼의 크기 및 형태와 같은 공정 파라미터가 선택에 영향을 줄 것이다. 팽창상 (expanded bed) 공정에서, 매트릭스는 일반적으로 고밀도 충전제, 바람직하게는 스테인레스강 충전제를 포함한다. 다른 공정에 대해, 다른 기준이 매트릭스의 특성에 영향을 줄 수 있다.
따라서, 본 발명의 제2 측면은 지지체에 커플링된 상기 설명된 리간드를 포함하는 분리 매트릭스에 관한 것이다. 당업계의 숙련인이 이해하는 바와 같이, 각각의 지지체는 일반적으로 복수개의 리간드를 포함할 것이다. 특정 실시태양에서, 지지체는 상기 설명된 바와 같은 리간드를 제2 종류의 리간드와 조합으로 포함하고, 여기서 본 발명에 따른 리간드는 리간드 총량의 적어도 약 30％, 바람직하게는 적어도 약 50％, 보다 바람직하게는 적어도 약 70％, 가장 바람직하게는 적어도 약 90％로 존재한다. 상기 조합된 리간드 분리 매트릭스는 추가의 상호작용의 성분이 그의 분리 특성을 개선하는 특수한 경우를 위해 설계될 수 있다. 제2 종류의 리간드는 하나 이상의 하전된 기, 예를 들어 전하 반발에 의해 화합물을 용출시키기 위해 사용된 양이온 교환제; 소수성 기; 수소-결합할 수 있는 기; 친화도 기 등을 포함할 수 있다.
제1 실시태양에서, 본 발명에 따른 매트릭스는 입자, 예를 들어 본질적으로 구형의, 길거나 불규칙하게 형성된 입자 형태로 존재한다. 특정 실시태양에서, 분리 매트릭스는 건조되고, 예를 들어 사용시 액체에 잠겨서 원래 형태를 유지하는 건조된 입자이다. 예시적인 실시태양에서, 상기 건조된 분리 매트릭스는 건조된 아가로즈 입자로 구성된다. 그러나, 별법으로 본 발명에 따른 매트릭스는 분리에서 통상적으로 사용되는 임의의 다른 형태, 예를 들어 모노리쓰 (monolith); 필터 또는 막; 모세관; 칩; 표면 등의 형태를 취할 수 있다. 결과적으로, 제2 실시태양에서, 매트릭스는 막 구조, 예를 들어 단일 막, 일단의 막 또는 필터를 포함한다.
본 발명의 제3 측면은 상기 설명한 분리 매트릭스의 용도에 관한 것이다. 제1 실시태양에서, 본 발명은 상기 설명된 바와 같은 분리 매트릭스를 단백질 정제에서 사용한다. 본 용도의 유리한 실시태양에서, 단백질은 항체; 항체 단편; 또는 항체를 포함하는 융합 단백질이다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 상기 설명된 바와 같은 분리 매트릭스를 임의의 다른 화합물, 예를 들어 폴리펩티드; 핵산, 예를 들어 DNA, RNA 또는 그의 올리고뉴클레오티드, 플라스미드; 바이러스; 프리온; 세포, 예를 들어 원핵 또는 진핵 세포; 지질; 탄수화물; 유기 분자, 예를 들어 소유기 분자; 약물 표적; 진단 마커 분자로 이루어진 군 중에서 선택된 것의 분리에서 사용한다. 용도는 아래에 보다 상세히 논의할 것이다. 또다른 실시태양에서, 본 발명은 상기 설명된 바와 같은 분리 매트릭스를 세포 배양에서 지지체로서, 즉 표면에서 성장하는 세포를 고정시키기 위해 사용한다. 당업계의 숙련인이 이해할 바와 같이, 본원에서 용어 분리는 화합물의 정제; 단리; 및 제거에 대해 사용되지만, 또한 진단 목적을 위한 것과 같은 표적 화합물의 확인을 포괄한다.
본 발명의 제4 측면은 분리 방법에 관한 것이고, 여기서 목적하는 화합물, 예를 들어 항체는 상기 액체 샘플을 포함하는 이동상을 상기 설명된 바와 같은 분리 매트릭스와 접촉시킴으로써 액체 샘플의 1종 이상의 다른 화합물로부터 분리된다. 유리한 실시태양에서, 본 발명의 방법은 액체 크로마토그래피의 원리를 이용하여, 즉 이동상을 본 발명에 따른 분리 매트릭스를 포함하는 크로마토그래피 컬럼 상으로 통과시킴으로써 수행한다. 다른 별도의 실시태양에서, 본 발명의 방법은 배치식 (batch-wise) 크로마토그래피 공정을 이용하여 수행하고, 여기서 분리 매트릭스는 액체 샘플을 포함하는 용기에 첨가된다. 특정 실시태양에서, 배치식 방식으로 첨가된 분리 매트릭스는 건조된 입자, 예를 들어 건조된 아가로즈 입자를 포함한다. 다른 실시태양에서, 상기 방법은 팽창상 크로마토그래피의 원리를 이용하여, 즉 이동상을 고밀도 충전제를 포함하는 본질적으로 구형 입자 형태의 분리 매트릭스의 팽창상, 예를 들어 유동상에 첨가함으로써 수행한다.
본 발명의 방법의 제1 실시태양에서, 목적하지 않는 화합물은 목적하는 화합물, 예를 들어 항체가 흡착되지 않은 상태로 이동상에 남아있는 동안 분리 매트릭스에 흡착된다. 당업계의 숙련인이 이해하는 바와 같이, 흡착된 화합물의 성질 및 정체는 액체 샘플의 기원에 따라 결정될 것이다. 목적하는 항체가 흡착되지 않는 실시태양에서 흡착되는 화합물의 예는 세포 및 세포 파쇄물; 단백질 및 펩티드; 핵산, 예를 들어 DNA 및 RNA; 내독소, 바이러스, 배양 배지로부터의 잔류물 등이다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 분리 매트릭스는 크로마토그래피 컬럼 내에 제공되고, 이동상은 중력 및/또는 펌핑에 의해 상기 컬럼을 통과하고, 항체는 컬럼의 유출물에서 회수된다. 따라서, 본 실시태양의 잇점은 컬럼으로부터 항체 생성물의 임의의 용출을 요구하지 않는 것이다. 보다 적은 단계가 보다 신속한 정제 프로토콜을 제공하고 결과적으로 공정 비용을 감소시킬 것이므로, 특이적 용출 단계를 피하는 것이 공정 관점에서 유리하다. 또한, 항체는 그들의 접힘 패턴을 손상시키거나; 그들의 펩티드 결합을 공격하여 파괴할 특정 조건에 감수성이다. 따라서, 음이온 교환제에 대한 용출 조건은 일반적으로 임의의 극한적 화학물질을 수반하지 않지만, 염 및 pH의 변화는 감수성 항체에 영향을 줄 수 있고, 그 효과는 pI, 전하 분포 등에 따라 종마다 다르다. 결과적으로, 본 실시태양의 다른 잇점은 목적하는 화합물에 대한 용리액의 첨가 및 용출 조건의 적용을 피하는 것이다. 화합물의 흡착을 위한 가장 적합한 조건을 얻기 위해, 액체 샘플은 적합한 완충제 또는 다른 액체와 합해져서 이동상을 제공한다. 본 실시태양은 유리하게는 일반적으로 비교적 저 염 농도에서의 흡착을 포함하는 음이온-교환 크로마토그래피에 통상적인 조건 하에 실행된다. 따라서, 본 발명의 방법의 한 실시태양에서, 이동상의 전도도는 0-25, 예를 들어 10-15 mS/cm 범위이다. 한 실시태양에서, 이동상의 pH는 약 5-6이다. 예를 들어 매트릭스의 재사용을 위해 흡착된 화합물을 후속적으로 방출시키기를 원하는 경우, 용출은 예를 들어 증가하는 염 구배를 사용하여 보다 고 염 농도에서 수행할 수 있다. 흡착된 화합물을 용출시키기 위해 pH값이 또한 또는 별법으로 예를 들어 감소하는 pH 구배에 의해 이동될 수 있다.
본 발명의 방법의 제2의 대안적인 실시태양에서, 목적하는 화합물은 통상적인 액체 크로마토그래피에서와 같이 매트릭스에 흡착된다. 이어서, 매트릭스는 생성물의 선택적인 용출 후 재사용될 수 있다. 용출은 적절한 완충제를 컬럼 상으로 통과시킴으로써 쉽게 수행된다. 필요하면, 하나 이상의 세척 단계가 임의의 상기 통과(들) 전에 또는 사이에 적용될 수 있다. 한 실시태양에서, 본 실시태양의 작업 조건은 통상적인 이온 교환에서와 같고, 즉 상기 논의된 바와 같이 흡착에서는 낮은 전도도를 갖는 이동상을 사용하고, 용출에서는 고 전도도 완충제를 사용한다. 당업계의 숙련인은 상이한 조건을 시험함으로써 조건을 쉽게 조정하고, 흡착된 화합물(들) 및 유출물을 분석할 수 있다. 특정 실시태양에서, 목적하는 화합물은 항체이다.
상기 제1 및 제2 실시태양 사이를 선택하면, 당업계의 숙련인은 유리하게는 pH 및/또는 전도도의 제어에 의해 구체적인 화합물을 흡착시키기 위한 조건을 쉽게 채용할 수 있다. 예를 들어, 항체의 분리에서, 상이한 클래스의 항체는 상이한 전하 및 전하 분포 패턴을 갖고, 이는 분리 목적과 함께 항체를 흡착하거나 또는 이들을 흡착되지 않은 상태로 컬럼을 통해 통과시키는 것이 더 바람직한지 결정할 것이다.
본 발명의 한 실시태양에 따라 분리되는 항체는 임의의 잘 공지된 원료, 예를 들어 표면에서 배양된 세포로부터 또는 발효 탱크 또는 용기 내의 배치식 또는 연속 세포 배양액으로부터 기원할 수 있다. 따라서, 한 실시태양에서, 액체는 세포 발효로부터 얻은 상등액이다. 따라서, 항체가 분리될 필요가 있는 화합물의 예는 단백질, DNA, 바이러스, 내독소, 영양소, 세포 배양 배지의 성분, 예를 들어 소포제 및 항생제, 및 생성물-관련 불순물, 예를 들어 잘못 폴딩된 물질종 및 응집체이다. 이동상과 본 발명의 분리 매트릭스 사이의 접촉 단계, 즉 흡착 단계 전에 기계적 여과, 원심분리 및/또는 크로마토그래피 단계가 수행될 수 있다. 예를 들어, 액체 샘플이 발효 브로쓰인 경우, 본 발명의 매트릭스를 사용하는 단계 이전에 세포 파쇄물, 전체 세포 및 다른 비교적 큰 성분을 기계적으로 제거하는 것이 유리하다.
한 실시태양에서, 본 발명의 방법은 정제 프로토콜의 포획 단계를 구성한다. 특정 실시태양에서, 액체 샘플은 본 발명에 따른 크로마토그래피 매트릭스와 접촉하기 전에 여과되는 조질 공급물이다. 결과적으로, 액체 샘플이 기계적 수단에 의해 예비정제되더라도, 본 실시태양은 여전히 포획 단계를 구성할 것이다. 잘 공지된 바와 같이, 항체를 생산하는 숙주 세포는 또한 숙주 세포 단백질 (HCP)로서 일반적으로 알려진 많은 다른 단백질을 포함할 것이다. 상기 HCP는 효소, 예를 들어 프로테아제, 및 숙주 세포에 의해 생산된 다른 단백질을 포함한다. 따라서, 한 실시태양에서, 액체 샘플의 실질적으로 모든 숙주 세포 단백질은 본 발명의 방법에 의해, 예를 들어 분리 매트릭스에의 흡착에 의해 제거된다.
별도의 실시태양에서, 본 발명의 방법은 세정 프로토콜에서 제2, 제3 또는 심지어 제4 크로마토그래피 단계, 예를 들어 중간 정제 또는 폴리싱 (polishing) 단계로서 사용된다. 따라서, 한 실시태양에서, 본 발명의 분리 매트릭스에 적용되는 이동상은 분리 매트릭스로부터의 항체-함유 용출액을 포함한다. 한 실시태양에서, 액체 샘플은 선행 친화도 크로마토그래피 매트릭스로부터의 용출액이다. 유리한 실시태양에서, 그로부터 용출액이 얻어지는 분리 매트릭스는 1종 이상의 Fc-결합 단백질 리간드, 예를 들어 프로테인 A 리간드를 포함한다. 용어 프로테인 A 리간드는 이러한 측면에서 천연 및 재조합 프로테인 A, 또는 그의 기능적 단편을 포함한다. 이러한 측면에서, 용어 "기능적" 단편은 단백질의 원래의 결합 특성을 보유하는 단편을 의미한다. 상기 친화도 매트릭스는 예를 들어 지이 헬쓰케어로부터 Mab셀렉트(MabSelect)™으로 상업적으로 입수가능하다. 결과적으로, 본 실시태양에서, 제거된, 바람직하게는 흡착된 화합물은 방출된 프로테인 A; 프로테인 A와 항체 사이에 형성된 복합체, 예를 들어 프로테인 A 1 분자당 많은 항체, 예를 들어 하나의 프로테인 A 분자와 복합된 2 내지 4개의 항체를 포함할 수 있는 프로테인 A-MAb 복합체; 및 방출된 프로테인 A 또는 항체의 응집체로 이루어진 군 중에서 하나 이상 선택될 수 있다. 당업계의 숙련인이 이해할 바와 같이, 선행 단계, 예를 들어 친화도 크로마토그래피에서 사용되는 구체적인 조건에 따라, 용출액은 적합한 첨가 또는 조정에 의해 조건화시킬 필요가 있을 수 있다. 따라서, 용출액은 적합한 완충제 또는 액체와 합해져서 이동상을 제공한다.
본 발명의 방법은 임의의 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 예를 들어 포유동물 숙주, 예를 들어 마우스, 설치류, 영장류 및 인간에서 유래한 항체, 또는 하이브리도마에서 유래한 항체를 분리하기 위해 유용하다. 한 실시태양에서, 분리되는 항체는 인간 또는 인간화 항체이다. 항체는 임의의 클래스일 수 있고, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 이루어지는 군 중에서 선택될 수 있다. 한 실시태양에서, 항체는 프로테인 A, 또는 Fc-함유 항체 단편 또는 융합 단백질에 결합할 수 있는 항체이다. 특정 실시태양에서, 항체는 면역글로불린 G (IgG), 예를 들어 IgG1이다. 한 실시태양에서, 본 발명의 방법은 pI가 6-9, 예를 들어 7-8인 항체를 정제하기 위해 사용된다. 특정 실시태양에서, 정제된 항체의 pI는 약 9이다. 상기 측면에서, 용어 "항체"는 또한 항체 단편, 및 항체 또는 항체 단편을 포함하는 임의의 융합 단백질을 포함함을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 언급된 항체 및 상기 항체를 포함하는 융합 단백질의 임의의 하나의 단편의 분리를 포괄한다. 한 실시태양에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 특정 실시태양에서, 항체는 인간화 항체이다.
상기에서 분명한 바와 같이, 본 발명의 방법에서, 비흡착된 항체의 실질적으로 순수한 분획이 회수된다. 이러한 측면에서, 용어 "실질적으로 순수한"은 실질적으로 모든 비항체 화합물이 제거되었음을 의미하는 것이 이해된다. 가장 유리하게는, 오염물질의 총량의 적어도 약 80％, 예를 들어 적어도 약 95％, 즉 95-100％ 사이, 예를 들어 적어도 약 98％, 즉 98-100％ 사이, 바람직하게는 적어도 약 99％, 즉 99-100％ 사이가 본 발명의 분리 매트릭스 상에서 제거된다. 그러나, 당업계의 숙련인이 이해하는 바와 같이, 얻어진 순도는 분리 매트릭스에 적용되는 액체 샘플 내의 항체의 농도, 및 사용되는 다른 조건에 따라 결정될 것이다. 따라서, 한 실시태양에서, 본 발명의 방법에 따라 분리된 항체는 치료 등급의 항체이다. 따라서, 본 발명에 따라 정제된 항체는 연구에서 유용하고, 또한 항체 의약품, 예를 들어 MAb 약물의 제조에도 유용하다. 정제된 항체의 별도의 용도는 진단 용도이다. 또한, 정제된 항체는 인간을 위한 식품에서 예를 들어 식품 첨가제로서 유용하다. 예를 들어, 본 발명에 따라 정제된 소 항체는 식품에서 유용하다.
본 발명의 방법의 특정 실시태양에서, 본 발명의 분리 매트릭스는 1회용 크로마토그래피 컬럼 또는 1회용 필터로서 제공된다. 치료 화합물, 예를 들어 항체의 정제 방법에서 1회용 제품 사용의 잇점은 2가지 상이한 공정 사이의 교차-오염을 피할 수 있는 것이다. 따라서, 한 실시태양에서, 본 발명의 분리 매트릭스는 멸균 크로마토그래피 컬럼 또는 필터로서 제공된다. 한 실시태양에서, 본 발명의 방법은 배치식 공정으로 수행되고, 여기서 1회용 분리 매트릭스는 그로부터 항체가 회수되는 액체를 포함하는 용기에 첨가된다. 적당한 시간은 표적 화합물이 매트릭스에 흡착되도록 하고, 이후에 항체를 포함하는 액체상을 용기로부터 제거한다. 이어서, 사용된 매트릭스는 흡착된 화합물을 방출시키지 않으면서 폐기될 수 있고, 이는 화합물, 예를 들어 내독소 및/또는 특정 숙주 세포 단백질을 임의로 추가로 처리할 필요가 없기 때문에 안전성 관점에서 유리할 수 있다. 별도의 실시태양에서, 본 발명의 매트릭스는 항체가 흡착되는 방식으로 사용되는 크로마토그래피 컬럼 내에 1회용 제품으로서 제공된다. 유리한 실시태양에서, 컬럼 및 매트릭스는 사용자가 항체 생성물을 무균 또는 심지어 멸균 조건 하에 정제할 수 있도록 멸균된다.
제2 측면에서, 본 발명은 액체 중에서 항체를 1종 이상의 다른 성분으로부터 정제하기 위한 키트에 관한 것이고, 상기 키트는 상기 설명된 바와 같은 분리 매트릭스로 충전된 크로마토그래피 컬럼; 1종 이상의 완충제; 및 서면 지침서를 별개의 구획 내에 포함한다. 분리 매트릭스는 상기 설명된 바와 같을 수 있다. 상기 지침서는 유리하게는 상기 정의된 방법을 상세히 설명한다.
<도면의 상세한 설명>
도 1은 질소 원자를 통해 비드 형태의 지지체에 고정된 프로토타입 리간드 N-벤질-N-메틸 에탄올아민을 보여준다. 커플링된 리간드는 좌측에 개략적으로 도시된 링커를 갖고; 우측에 예시적인 친수성 링커를 갖는 것으로 도시된다. 실험 파트에서는, 프로토타입 리간드를 6％ 아가로즈 매트릭스 세파로스™ 6 FF (지이 헬쓰케어)에 커플링시켰다.
도 2는 세파로스™ 6 FF 상에 고정된 N-벤질-N-메틸 에탄올아민 (901035A); 세파로스 6 FF 상에 고정된 N,N-디메틸벤질아민의 리간드; 및 25 mM Bis-Tris, 100 mM NaCl (약 12 mS/cm), pH 6.5 중의 Q 세파로스™ FF를 포함하는 분리 매트릭스에 적용된 50 mg Mab1을 포함하는 샘플의 크로마토그램을 보여준다. 용출은 25 mM Bis-Tris, 0.5 M NaCl, pH 6.5를 사용하여 수행하였다.
도 3a) 및 b)는 mAb1-r프로테인 A의 혼합물을 사용하여 프로토타입 상에서 수행된 크로마토그래피의 결과를 도시한 것이다. A-완충제는 25 mM Bis-Tris, 50 mM NaCl, pH 6.0이었다. 전도도는 약 7 mS/cm이었다. 용출을 위해 B-완충제, 0.5 M Na-아세테이트, pH 4.0을 사용하였다. 유속은 0.5 mL/분 (150 cm/시간)이었다. 샘플은 4 mg/mL mAb1 및 1％ r프로테인 A (w/w) 농도의 10 mg mAb1, 0.10 mg rPrA이었다. 3a) 참조 Q 세파로스™ FF; 및 b) N-벤질-N-메틸에탄올아민, 146 μmol/mL (901035A).
도 4a)-c)는 MAb 1, 1％ rPrA을 갖는 샘플 및 도 3의 크로마토그래피 실행으로부터의 모아진 유출물 및 용출액 분획에 대한 분석적 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)의 결과를 도시한 것이다. 청색 곡선은 유출물 (FT) 분획이고, 적색은 용출액이다. 보다 구체적으로, 도 4a)는 1％ (w/w)를 제공하는 4 mg/mL mAb1, 0.04 mg/mL rPrA의 샘플을 도시하고; 4b)는 도 3a) Q 세파로스™ FF으로부터의 FT 및 용출액을 도시하고; 4c)는 도 3b) N-벤질-N-메틸에탄올아민, 146 μmol/mL (901035A)로부터의 FT 및 용출액을 도시한다.
실험 파트
본 실시예는 예시의 목적으로만 제공되고, 어떠한 식으로도 청구의 범위에 의해 한정되는 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1: 본 발명에 따른 분리 매트릭스의 제조
BMEA 세파로스 패스트 플로우(Fast Flow)의 제조
가교결합된 아가로즈 겔 (세파로스™ 6 패스트 플로우, 지이 헬쓰케어)을 출발 물질로 사용하여, 본 발명에 따른 분리 매트릭스를 제조하는 방법의 한 실시태양을 아래 나타낸다.
A. 매트릭스 상에 알릴기의 도입
세파로스 6 패스트 플로우를 알릴 글리시딜 에테르로 다음과 같이 활성화시켰다: 100 mL의 세파로스 6 패스트 플로우를 흡인 건조시키고, 0.3 g의 NaBH4, 12 g의 Na2SO4 및 35 mL의 NaOH 50％ 수용액과 혼합하였다. 혼합물을 1시간 동안 5O℃에서 교반하였다. 100 mL의 알릴 글리시딜 에테르의 첨가 후, 현탁액을 추가로 16시간 동안 격렬하게 교반하면서 5O℃에서 유지시켰다. 혼합물의 여과 후, 겔을 500 mL 증류수, 500 mL 에탄올, 200 mL 증류수, 200 mL 0.2 M 아세트산 및 500 mL 증류수로 연속적으로 세척하였다.
적정은 0.22 mmol 알릴/mL 겔의 치환도를 제공하였다.
B. 브롬화를 통한 알릴 세파로스 6 패스트 플로우의 활성화
지속적인 황색이 얻어질 때까지 50 mL의 알릴 활성화된 세파로스™ 6 패스트 플로우 (0.22 mmol 알릴기/mL 수분제외 (drained) 겔), 1 g의 아세트산나트륨 및 15 mL의 증류수의 교반 현탁액에 브롬을 첨가하였다. 이어서, 현탁액이 완전히 탈색될 때까지 포름산나트륨을 첨가하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 겔을 500 mL의 증류수로 세척하였다. 이어서, 활성화된 겔을 반응 용기에 직접 옮기고 N-벤질-N-메틸에탄올아민과 추가로 반응시켰다.
C. 활성화된 매트릭스 상에 BMEA (N-벤질-N-메틸에탄올아민)기의 도입
아민기를 아민기의 질소 원자를 통해 직접 매트릭스 상에 도입하였다. 전형적인 과정에서, 매트릭스에 대한 커플링은 알릴기의 브롬화 및 염기성 조건 하의 친핵 치환을 통해 실현되었다. 25 mL의 브롬 활성화된 겔 (0.22 mmol 알릴기/mL 수분제외 겔)을 N-벤질-N-메틸에탄올아민 (16.0 mL)의 용액을 포함하는 반응 바이알에 옮겼다. 5 mL의 물을 첨가하고, 수산화나트륨 용액으로 반응 용액의 pH를 12.0으로 조정하였다. 반응물을 5O℃에서 교반하면서 16시간 동안 유지하였다. 반응 혼합물의 여과 후, 겔을 3 x 10 mL의 증류수, 3 x 10 mL의 수성 0.5 HCl 및 마지막으로 3 x 10 mL의 증류수로 연속적으로 세척하였다. 0.15 mmol 아민/mL 겔의 치환도를 갖는 BMEA 세파로스 패스트 플로우 겔을 얻었다.
실시예 2: 유출물에서 항체의 정제
실시예 2A): 처리
비-결합 조건 하에, 약 50 mg mAb1을 포함하는 샘플을 프로토타입 901035 A (N-벤질-N-메틸 에탄올아민) 상에 약 5 및 12 mS/cm에서 로딩하였다. 유출물 분획 (FT)는 5, 10 및 15 컬럼 부피 (CV)에서 수거하였다. 용출 피크로부터의 분획을 모았다. FT 분획을 HCP 및 프로테인 A 함량에 대해 분석하였다.
크로마토그래피 성능이 하나의 특정 mAb에 대해 독특하지 않음을 확인하기 위해, mAb2를 포함하는 샘플을 사용하여 pH 6.0 및 약 12 mS/cm에서 크로마토그래피 실행을 반복하였다. 프로토타입의 성능을 먼저 분석적 SEC로 평가하였다. 선택된 분획을 HCP 및 프로테인 A 함량에 대해 분석하였다. 분획을 SEC로 스크리닝한 후, 선택된 분획을 HCP 및 프로테인 A 분석을 위해 보냈다.
프로토타입의 r프로테인 A 제거율을 시험하기 위해, MAb1을 1％ (w/w) 재조합 프로테인 A (rPrA)로 스파이킹(spiking)하였다. 프로토타입을 10 mg MAb1, 1％ r프로테인 A에 상응하는 샘플 부피로 pH 6.0 및 약 7 mS/cm의 전도도에서 주입하였다. 유출물 및 용출액 분획을 따로 모으고, SEC로 분석하였다.
재료/조사된 유닛
컬럼 및 겔은 지이 헬쓰케어로부터 입수하였다.
하이프렙(HiPrep)™ 26/10 탈염, 카탈로그 번호: 17-5087-01, CV= 53.09 mL
트리콘(Tricorn)™ 5/50, 카탈로그 번호: 18-1163-09, CV= 1 mL
HR 5/5™, 카탈로그 번호: 18-0338-01, CV= 1 mL
수퍼덱스(Superdex)™ 200 10/300 GL, 카탈로그 번호: 17-5175-01, CV= 23.56 mL
기구
크로마토그래피 시스템: AEKTA익스플로러(AEKTAExplorer)™ 10
분광광도계: 스펙트라 맥스 플러스(Spectra MAX plus)
화학물질
사용된 모든 화학물질은 분석 등급이었다. 물은 밀리큐(MilliQ)-여과된 것이었다.
크로마토그래피 매질
Q 세파로스™ 패스트 플로우 (FF) (지이 헬쓰케어). 분리 매트릭스의 리간드는 하기 표 1에 설명된 프로토타입이다:
리간드
프로토타입 참조 리간드 Cl- 용량 (μmol/mL)
901035A N-벤질-N-메틸 에탄올아민 146
샘플
흡광 계수가 각각 1.46 및 1.50인 2가지 상이한 인간화 IgG 항체, 서브클래스 1 (MAb 1 및 MAb 2로 나타냄)을 사용하였다. 두 항체를 CHO 배양물에서 발현시키고, 본 실험에 앞서 통상적인 프로테인 A 친화도 크로마토그래피를 이용하여 후속적으로 정제하였다.
완충제 교환은 수퍼루프(Superloop)™ (지이 헬쓰케어)로 적절한 부피 (5 - 15 mL)를 주입함으로써 관심있는 완충제로 평형화시킨 하이프렙™ 탈염 컬럼 (지이 헬쓰케어) 상에서 이루어졌다. 유속은 5 mL/분이고, 5 mL의 분획을 수거하였다. 용출된 피크를 함유하는 분획을 모으고, 하기 식 1에 따라 농도를 계산하기 위해 280 nm에서의 흡광도를 이중으로 결정하였다:
A280= ε·C·l (식 1)
상기 식에서, A280은 280 nm에서의 흡광도이고,
ε (mL*mg-1*cm-1)은 특정 단백질에 대한 흡광 계수이고,
C (mg/mL)는 단백질의 농도이고,
l (cm)은 경로 길이이다.
크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 수퍼덱스™ 200 10/300 컬럼 (지이 헬쓰케어) 상에서 0.5 mL/분의 유속에서 수행하였다. 완충제는 타블렛 (시그마 (Sigma), P-4417)로부터 제조한 PBS (인산염-완충 염수); 10 mM 인산염, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, pH 7.4이었다.
방법
평형화 2/0.1 CV; 제1회 사용시 2 CV; 실행 사이에 0.1 CV
샘플 주입 50 ㎕
등용매 (isocratic) 용출 1.5 CV
mAb 를 사용하여 프로토타입 상에서 크로마토그래피
A-완충제는 25 mM Bis-Tris, pH 6.0 또는 6.5이었다. 목적하는 전도도, 약 5 또는 12 mS/cm에 따라, 35 또는 100 mM NaCl을 포함시켰다. 용출 완충제 (B-완충제)는 25 mM Bis-Tris, 0.5 M NaCl, pH 6.5이었다. 유속은 0.5 mL/분 (150 cm/시간)이었다.
방법: 평형화 5 CV A-완충제
샘플 주입 5-25 mL 샘플 농도 20 또는 50 mg mAb
세척 5 CV A-완충제
구배 용출 10 CV 0-100％ B-완충제
용출 10 CV 100％ B-완충제
재생 5 CV A-완충제
MAb -r 프로테인 A를 사용하여 프로토타입 상에서 크로마토그래피
A-완충제는 25 mM Bis-Tris, pH 6.0이었다. 50 mM NaCl을 첨가하여 전도도는 약 7 mS/cm이었고, B-완충제는 0.5 M Na-아세테이트, pH 4.0이었다. 유속은 0.5 mL/분 (150 cm/시간)이었다. 샘플 농도는 1％ (w/w)를 제공하는 4 mg/mL MAb 1-0.04 mg/mL rPrA이었다.
방법: 평형화 5 CV A-완충제
샘플 주입 2.5 mL 10 mg MAb, 1％ rPrA
세척 5 CV A-완충제
구배 용출 10 CV 0-100％ B-완충제
용출 10 CV 100％ B-완충제
재생 5 CV A-완충제
CIP (정치 세정)
각각의 크로마토그래피 실행 후, 프로토타입 및 참조 매트릭스 Q 세파로스™ FF를 다음 CIP 과정으로 처리하였다;
30％ 이소프로판올 5 CV (컬럼 부피)
H2O 5 CV
1.0 M NaOH 4 CV (15 분의 휴지 포함)
H2O 5 CV
A-완충제 5 CV
H2O 5 CV
20％ EtOH 5 CV
프로테인 A 분석
선택된 분획을 SPA 샘플 희석액과 800 ㎕ SPA 샘플 희석액 + 200 ㎕ 샘플의 비율로 혼합하였다. 혼합 후, 분획을 가열 블록 상에서 99℃에서 10분 동안 가열한 후, 다시 혼합하였다. 이어서, 샘플을 재조합 프로테인 A에 대해 분석하였다.
숙주 세포 단백질 ( HCP ) 분석
샘플 (분. 600 ㎕)을 HCP 함량에 대해 분석하였다. 검출 하한은 10 ng/mL이다.
실시예 2B): 프로토타입 리간드 N-벤질-N- 메틸에탄올아민 (901035A) 상에서 정제된 MAb1 -함유 샘플
50 mg MAb1을 함유하는 샘플을 상기 실시예 1에 설명된 바와 같이 제조된 세파로스™ 6 FF 상에 고정된 N-벤질-N-메틸 에탄올아민 (901035A), 및 25 mM Bis-Tris, 100 mM NaCl (약 12 mS/cm), pH 6.5 중의 참조 매트릭스 Q 세파로스™ FF에 적용하였다. 용출은 25 mM Bis-Tris, 0.5 M NaCl, pH 6.5를 사용하여 수행하였다.
실시예 2의 크로마토그램을 도 2에 도시하고, 이는 Q 세파로스™ FF에 비교한 프로토타입 N-벤질-N-메틸 에탄올아민 세파로스™ 6 FF (901035A)를 보여준다. 분석을 위해 선택된 유출물 (FT) 분획을 화살표로 표시한다. 하기 표 2 및 3에 나타낸 HCP 및 프로테인 A 제거율에 대한 결과는 프로토타입이 상기 면에서 Q 세파로스™ FF보다 우수함을 밝힌다.
HCP 분석 결과
컬럼 pH 출발
(ng/mL)		 FT1
(ng/mL)		 FT2
(ng/mL)		 FT3
(ng/mL)
Q 세파로스™ FF (참조) 6.5 890 160 200 180
N-벤질-N-메틸 에탄올아민,
146 μmol/mL (901035A)		 6.5 890 10 20 35
PrA 분석 결과
컬럼 pH 출발
(ng/mL)		 FT1
(ng/mL)		 FT2
(ng/mL)		 FT3
(ng/mL)
Q 세파로스™ FF (참조) 6.5 0.40 0.69 0.46 0.31
N-벤질-N-메틸 에탄올아민,
146 μmol/mL (901035A)		 6.5 0.40 0 0 0
실시예 3: 프로토타입 리간드 N-벤질-N- 메틸에탄올아민 상에서 MAb1 및 재조합 프로테인 A ( rPrA )를 포함하는 샘플로부터의 유출물에서 MAb1 의 정제
본 실시예에서, mAb1-r프로테인 A를 함유하는 샘플을 사용하여 프로토타입 상에서 크로마토그래피를 수행하였다. A-완충제는 25 mM Bis-Tris, 50 mM NaCl, pH 6.0이었다. 전도도는 약 7 mS/cm이었다. B-완충제는 0.5 M Na-아세테이트, pH 4.0이었다. 유속은 0.5 mL/분 (150 cm/시간)이었다. 샘플은 4 mg/mL mAb1 및 1％ r프로테인 A (w/w)의 농도에서 10 mg mAb1, 0.10 mg rPrA이었다. 결과를 도 3에 나타낸다.
마지막으로, mAb1, 1％ rPrA를 갖는 샘플 및 도 4의 크로마토그래피 실행으로부터의 모아진 유출물 및 용출액 분획에 대한 분석적 SEC를 수행하였다. 결과를 도 4에 나타낸다. 도 4a에서, 빗금친 피크는 MAb1-프로테인 A의 복합체이다. 청색 곡선은 유출물 (FT) 분획이고, 적색은 용출액이다.
실시예 4: 흡착 방식
4A) 처리
흡착 방식으로 BMEA 세파로스 패스트 플로우 (BMEA; N-벤질-N-메틸에탄올아민)의 선택도를 시험하기 위해, 인간 IgG 및 8가지 상이한 단백질의 체류 시간을 시험하였다. 결과를 상업적으로 입수가능한 음이온 교환제 Q 세파로스 패스트 플로우에 비교하였다. 시험법의 원리는 단백질을 A-완충제 (완충제 성분으로서 피페라진 함유)로 평형화시킨 HR5/5 컬럼 (세파로스™ 패스트 플로우 상에 고정된 BMEA 리간드 함유) 내로 주입한 것이었다. 단백질의 용출을 위해 염 구배를 사용하였다 (하기 방법 참조).
재료/조사된 유닛
컬럼 및 Q 세파로스 패스트 플로우는 지이 헬쓰케어로부터 입수하였다.
HR 5/5™, 카탈로그 번호: 18-0338-01, CV= 1 mL
기구
크로마토그래피 시스템: AEKTA익스플로러™ 10
화학물질 및 샘플
단백질, 난알부민, β-락토글로불린, 소 혈청 알부민, α-락트알부민, 미오글로빈, 락토페린, 리보뉴클레아제 A 및 사이토크롬 C는 시그마로부터 구입하고, 인간 IgG (Gammanorm)는 옥타파마 (Octapharma)로부터 구입하였다. 단백질을 A-완충제에 1-10 mg/mL의 농도로 용해시켰다. Q 세파로스 패스트 플로우는 지이 헬쓰케어로부터 입수하였다. 사용된 모든 화학물질은 분석 등급이고, 사용된 물은 밀리큐-여과된 것이었다.
크로마토그래피
컬럼을 A-완충제로 0.6 mL/분의 유속으로 평형화시킨 후, 100 ㎕의 샘플 용액을 적용하였다. 한번에 하나의 단백질만 분석되었다. 단백질은 21 컬럼 부피의 구배 부피로 완충제 A로부터 완충제 B로의 선형 구배에 의해 용출되었다 (하기 방법 참조). 완충제 A는 25 mM 피페라진, pH 10.0이고, 완충제 B는 25 mM 피페라진, 1.0 M NaCl, pH 10.0이었다. 모든 실행 동안 280 nm에서의 흡광도를 검출하였다.
방법:
평형화: 5 CV의 A-완충제
샘플 주입: 100 ㎕ (약 0.2 mg 단백질)
구배: 21 CV 100％ B-완충제
구배 후 평형화: 5 CV의 A-완충제
결과
BMEA 리간드가 면역글로불린과 선택적으로 상호작용하는지 증명하기 위해, 인간 IgG를 새로운 매질로 충전한 1 mL 컬럼 (HR 5/5)에 적용하였다. 또한, 단백질 난알부민, β-락토글로불린, 소 혈청 알부민, α-락트알부민, 미오글로빈, 락토페린, 리보뉴클레아제 A 및 사이토크롬 C를 또한 적용하였다. 결과를 Q 세파로스 패스트 플로우에 대해 관찰된 단백질의 체류 시간과 비교하였다. Q 세파로스 패스트 플로우는 강한 음이온 교환제이고, 동일한 지지체 매트릭스 (지지체 물질, 비드 크기, 공극 크기, 공극 부피, 충전 과정 등)을 갖고 본질적으로 동일한 치환도 (이온 교환 용량으로서 측정됨)를 가지므로 참조 음이온 교환제로서 사용된다. 표 I로부터 명백한 바와 같이, BMEA 세파로스 패스트 플로우는 모든 조사된 단백질을 Q 세파로스 패스트 플로우에 비해 더 강하게 지연시켰다. 또한, IgG는 BMEA 세파로스 패스트 플로우에서 가장 긴 체류 시간을 제공한 단백질이었다 (표 I). 이는 Q 세파로스 패스트 플로우보다 BMEA 매질에 훨씬 더 강한 결합을 반영한다. Q 세파로스 패스트 플로우에 비해, IgG의 체류 시간은 BMEA 세파로스 패스트 플로우를 사용할 때 27.3 분 증가하였다 (표 I). 상기 결과는 BMEA 세파로스 패스트 플로우가 선택적인 방식으로 IgG를 포획하고 용출하기 위해 사용될 수 있음을 명백하게 나타낸다.
Q 세파로스 패스트 플로우 및 BMEA 세파로스 패스트 플로우 상에서 상이한 단백질의 체류 시간 (tr).
단백질 분자량 pI Q 세파로스
패스트 플로우 상의
tr (분)		 BMEA 세파로스
패스트 플로우 상의
tr (분)		 Δtr
(trBMEA-trQ)
사이토크롬 C 12400 9.6 15.3 16.8 1.5
리보뉴클레아제 A 13700 9.4 15.8 22.6 6.8
락토페린 75000 7.9 15.1 19.4 4.3
미오글로빈 17600 7.2 16.1 20.5 4.4
인간 IgG 160000 16.5 43.8 27.3
α-락트알부민 14400 5.2 24.6 40.3 15.7
소 혈청 알부민 69000 5.1 25.3 32.6 7.3
β-락토글로불린 35000 5.1 25.1 37.1 12.0
β-락토글로불린 35000 5.1 30.0x 37.1 7.1
난알부민 43500 4.7 21.8 30.8 9.0
na = 분석되지 않음, x 2개의 피크가 관찰되었다.

Claims (26)

  1. 하기 식에 의해 정의되고, 그의 아민을 통해 지지체에 커플링되는 크로마토그래피 리간드:
    R1-R2-N(R3)-R4-R5
    식에서,
    R1은 비치환 페닐기이고,
    R2는 0 내지 4개의 탄소 원자를 포함하는 탄화수소 쇄이고,
    R3은 1 내지 3개의 탄소 원자를 포함하는 탄화수소 쇄이고,
    R4는 1 내지 5개의 탄소 원자를 포함하는 탄화수소 쇄이고,
    R5는 OH 또는 H이다.
  2. 제1항에 있어서, R2, R3 및 R4 중 하나 이상이 OH로 치환된 것인 리간드.
  3. 제1항에 있어서, R2가 -CH2-인 리간드.
  4. 제1항에 있어서, R3이 -CH3인 리간드.
  5. 제1항에 있어서, R4가 -CH2-CH2-CH2- 또는 -CH2-CH2-인 리간드.
  6. 제1항에 있어서, N-벤질-N-메틸 에탄올 아민을 포함하는 리간드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 복수개의 리간드를 지지체에 고정시키는 것을 포함하는, 분리 매트릭스의 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서, 리간드가 아민기를 통해 고정되는 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 지지체가 다공성인 것인 방법.
  10. 지지체에 커플링된 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 리간드를 포함하는 분리 매트릭스.
  11. 제10항에 있어서, 지지체가 입자를 포함하는 분리 매트릭스.
  12. 제11항에 있어서, 입자가 구형인 분리 매트릭스.
  13. 제10항에 있어서, 지지체가 막 구조를 포함하는 분리 매트릭스.
  14. 제10항 기재의 매트릭스를 제조하고, 상기 제조된 매트릭스를 컬럼 내에 제공하고, 매트릭스를 포함하는 컬럼을 멸균시키는 것을 포함하는, 크로마토그래피 컬럼의 제조 방법.
  15. 제13항 기재의 막을 제조하고, 상기 막을 멸균시키는 것을 포함하는, 분리 막의 제조 방법.
  16. 단백질 정제를 위한, 제10항에 따른 분리 매트릭스의 사용 방법.
  17. 제16항에 있어서, 단백질이 항체, 항체 단편, 또는 항체를 포함하는 융합 단백질인 사용 방법.
  18. 액체 샘플 중에서 1종 이상의 항체를 1종 이상의 다른 화합물로부터 분리하는 방법으로서, 이때 1종 이상의 항체 및 1종 이상의 다른 화합물을 포함하는 이동상을 제10항에 따른 분리 매트릭스와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 분리 매트릭스가 크로마토그래피 컬럼 내에 제공되고, 이동상이 중력 및/또는 펌핑에 의해 상기 컬럼을 통과하고, 항체가 컬럼의 유출물 (flow-through)에서 회수되는 것인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 액체 샘플이 세포 발효로부터 얻은 상등액을 포함하는 것인 방법.
  21. 제18항에 있어서, 분리 매트릭스와 접촉시키는 단계 이전에 기계적 여과 단계 및/또는 크로마토그래피 단계를 수행하는 것인 방법.
  22. 제18항에 있어서, 액체 샘플이 조질 공급물 (crude feed)을 포함하는 것인 방법.
  23. 제18항에 있어서, 흡착된 화합물이 숙주 세포 단백질이고, 상기 단백질의 80％ 이상이 분리 매트릭스에 흡착되는 것인 방법.
  24. 제10항에 따른 분리 매트릭스로 충전된 크로마토그래피 컬럼,
    1종 이상의 완충제, 및
    서면 지침서
    를 별개의 구획 내에 포함하는, 액체 중에서 항체를 1종 이상의 다른 성분으로부터 정제하기 위한 키트.
  25. 제10항에 따른 분리 매트릭스를 포함하는, 항체 정제를 위한 1회용 크로마토그래피 컬럼.
  26. 제25항에 있어서, 멸균된 컬럼.
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